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鼠疫耶尔森菌caf1基因的克隆表达及其产物免疫学评价
目的 表达具有免疫学活性重组F1抗原(rF1),并以其构建检测鼠疫抗体胶体金试纸条.方法 将去掉信号肽编码序列的caf1基因片段与载体质粒pET32a(+)通过BamHI和Not I双酶切位点进行连接,将重组质粒[caf1-pET32a(+)]转化入BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经亲和层析纯化,以纯化rF1及天然F1抗原制备双检测鼠疫抗体胶体金标试纸条,并对浙江省528份人血清标本进行检测.结果含caf1-pET32a(+)的BL21(DE3),经诱导产生相对分子质量(M_r)约为35.5×10~3的rF1融合蛋白;rF1融合蛋白检测鼠疫抗体的敏感性等同甚至超越天然F1抗原;在528份人血清标本的检测中,rF1与天然F1的符合率为97.9%(K=0.466),有较好一致性.结论 制备的rF1,具有良好免疫学活性,该rF1可替代天然F1抗原,用于鼠疫免疫学检测.
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鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的验证
目的 检验鼠疫耶尔森菌pla抗原基因芯片检测法的准确性.方法 针对鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上pla抗原基因中保守性片段,设计合成探针,制备尼龙膜基因芯片,用于检测在镇赉国家级鼠疫监测点采集到的达乌尔黄鼠肺、肝、肾样本154份,然后用鼠疫caf1基因PCR扩增法复检基因芯片阳性样品.结果 基因芯片共检测出18份样本呈阳性反应,而caf1基因PCR法却发现这些样品均为阴性.结论 在鼠疫耶尔森菌pPCP1质粒上的pla抗原基因不易用于鼠疫耶尔森菌的特异性检测,该抗原可同其它特异性抗原联合应用,提高检测的准确性.
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PCR检测鼠疫菌种中F1抗原基因
目的 应用PCR检测试验用EV菌株是否存在caf1基因.方法 应用含内部对照PCR技术,以鼠疫菌特异基因caf1合成一对引物,进行PCR实验.结果 该试验用EV菌株经PCR扩增,呈现一条与caf1基因分子量相吻合的清晰目的 扩增带.结论 该试验用EV菌株未缺失产生F1抗原的基因,可以用于提取F1抗原等试验.
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caf1基因为靶标的鼠疫检测PCR法的改进
目的 查明行业标准推荐caf1基因引物(简称行标caf1引物)进行PCR检测时,在一些非鼠疫菌上出现非特异性条带的原因,并提出解决办法.方法 共选取112株菌进行试验,其中鼠疫菌40株、非鼠疫菌72株;提取菌株DNA,并对caf1基因进行PCR扩增;选择出现非特异性条带的7株菌株,进行切胶回收、纯化以及TA克隆测序;针对caf1基因重新设计引物,对被试菌株进行验证.结果 使用行标caf1引物扩增40株鼠疫菌,均未出现非特异性条带,扩增72株非鼠疫菌,有58株扩增出400、500、600、700、800、900、1000 bp的非特异性条带.经克隆和测序,在非特异性产物的基因序列中均出现行标caf1引物的反向引物序列及反向引物的反向互补序列.重新设计caf1引物,扩增72株非鼠疫菌,均未出现非特异性条带.结论 行标caf1引物在筛查鼠疫菌时会出现非特异性条带,使用新caf1引物可有效避免这一情况,提高检测的准确性.
