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鼠疫耶尔森菌caf1M基因的克隆表达及其产物免疫学评价
目的 原核表达有免疫学活性的重组caf1M蛋白(rEaf1M),并以此建立检测鼠疫抗体的辅助诊断方法.方法 将去掉信号肽编码序列的caf1M基因片段与载体pGEX4t-1通过Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切位点进行连接,构建重组质粒caf1M-pGEX4t-1;将caf1qM-pGEX4t-1转化入E.coli BL21(DE3)中诱导表达;表达产物rlCaf1M经亲和层析进行纯化;以纯化rCaf1M及天然F1抗原喷制鼠疫抗体双检测NC膜,并以浙江各6份F1抗体阳性及阴性人血清标本进行应用评价.结果 含有重组质粒caf1M-pGEX4t-1的BL21,经诱导产生了分子量约为55×103的rCaf1M融合蛋白;rCaf1M融合蛋白与鼠疫菌免疫血清有较好反应;在浙江人血清标本的检测中,rCaf1M与F1抗体阳性者有明显反应,与F1抗体阴性者无反应.结论 本研究制备的rCaf1M,与鼠疫菌免疫血清具有良好的免疫反应性,该rCaf1M可用于鼠疫辅助免疫学检测.
关键词： 鼠疫 cajqf1M基因 rcaf1M融合蛋白 克隆表达 免疫学活性 -
鼠疫耶尔森菌caf1基因的克隆表达及其产物免疫学评价
目的 表达具有免疫学活性重组F1抗原(rF1),并以其构建检测鼠疫抗体胶体金试纸条.方法 将去掉信号肽编码序列的caf1基因片段与载体质粒pET32a(+)通过BamHI和Not I双酶切位点进行连接,将重组质粒[caf1-pET32a(+)]转化入BL21(DE3)中进行诱导表达,表达产物经亲和层析纯化,以纯化rF1及天然F1抗原制备双检测鼠疫抗体胶体金标试纸条,并对浙江省528份人血清标本进行检测.结果含caf1-pET32a(+)的BL21(DE3),经诱导产生相对分子质量(M_r)约为35.5×10~3的rF1融合蛋白;rF1融合蛋白检测鼠疫抗体的敏感性等同甚至超越天然F1抗原;在528份人血清标本的检测中,rF1与天然F1的符合率为97.9%(K=0.466),有较好一致性.结论 制备的rF1,具有良好免疫学活性,该rF1可替代天然F1抗原,用于鼠疫免疫学检测.
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庚型肝炎病毒基因在大肠杆菌中表达的初步研究
利用原核表达载体pRSET或(和)pGEX在大肠杆菌内表达了覆盖庚型肝炎病毒(HGV)C-NS3和NS5区的多段基因.CE1、E2、NS3、NS5及NS3-NS5嵌合基因等的8段基因均有高效表达,各重组蛋白产量与菌体总蛋白之比在10%～35%之间.对以上重组蛋白进行免疫学筛选,证实其中7个重组蛋白均具免疫学活性,在一定程度上确定了重组HGV抗原表位的分布,为HGV的血清学和免疫学诊断试剂的研究奠定了坚实基础.
关键词： 庚型肝炎病毒(HGV)基因 原核表达 重组抗原 免疫学活性 -
日本血吸虫抗原模拟表位免疫学活性的初步研究
目的研究从噬菌体12肽库中筛选得到的日本血吸虫抗原模拟表位的免疫学活性. 方法以日本血吸虫急感患者血清免疫球蛋白(Ig)作为靶分子,筛选噬菌体12肽库.经过3轮吸附-洗脱-扩增的淘筛过程,在筛选得到的阳性噬菌斑中随机挑取42个扩增,用ELISA检测不同寄生虫病患者和正常人血清,以分析其敏感性和特异性.并进一步免疫昆明株小鼠,经日本血吸虫尾蚴攻击感染后剖检,计算减虫率和减卵率,以分析其在小鼠体内诱导的免疫保护性. 结果在挑取的42个阳性克隆中,有9个与日本血吸虫急感患者血清有不同程度的结合(6.25%～100%).除其中1个灵敏性较低的克隆与其它寄生虫病患者血清有一定的交叉反应外,其余均未发现.而经其免疫后的小鼠也分别获得了29.3%减虫率和35.9%减卵率. 结论从噬菌体12肽库中筛选到的日本血吸虫抗原模拟表位具有较高的特异性和敏感性, 并能够在小鼠体内诱导一定的免疫保护力.
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肺炎支原体P1蛋白片段免疫学活性及黏附功能的研究
目的 了解肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae,Mp)P1蛋白第1125 ～1395氨基酸片段(P1C蛋白)的免疫学活性及其细胞黏附作用.方法 构建用于表达重组P1C片段(rP1C)的原核表达载体pGEX6p-2/p1c,采用SDS-PAGE和Western blot鉴定rP1C.采用基于GST的亲和层析法提纯rP1C,提纯的rP1C免疫BALB/c小鼠,ELISA检测小鼠抗rP1C血清的效价.采用Western blot检测rP1C对Mp感染患者血清的免疫反应性.采用间接免疫荧光法检测rP1C黏附HeLa细胞及其免疫血清黏附抑制作用.结果 所构建的原核表达系统能有效表达相对分子质量约为66×103的可溶性rP1C.rP1C免疫小鼠后,其抗血清ELISA效价高达1∶64000.rP1C能被Mp感染者血清及小鼠抗rP1C血清识别并与之结合.rP1C能黏附HeLa细胞,其抗血清可阻断Mp对HeLa细胞的黏附,该黏附阻断作用随抗血清浓度增高而增强.结论 rP1C具有良好的免疫原性和免疫反应性及黏附细胞功能,可作为Mp疫苗及血清学检测的候选抗原.
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ELISA检测抗HCV影响因素分析
ELISA方法的检测原理是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记.结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性.在测定时,受检标本(测定其中的抗体或抗原)与固相载体表面的抗原或抗体起反应.用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开.
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EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性
目的 在原核表达系统巾表达肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测.方法 PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基凶,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+).espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达.以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的 蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果.通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用.结果 重霍延伸PCR方法扩增出1 319 bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的 蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%.两种温度下,目的 蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%.Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应.融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157:H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应.融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%.免疫小鼠血清町以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用.结论 已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHEC O157:H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础.
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人乳头瘤病毒16型L1蛋白的纯化及免疫学活性
目的 纯化人乳头瘤病毒16型(HPVl6)L1蛋白,并分析其免疫学活性,为诊断试剂和疫苗的研制奠定基础.方法 采用电洗脱的方法纯化目的蛋白,通过免疫双扩散和ELISA法检测其免疫反应性.将该蛋白免疫BALB/c小鼠,分析其免疫原性.结果 纯化后的目的蛋白经凝胶灰度扫描显示,其纯度达到95%,免疫双扩散和ELISA结果显示,宫颈癌病人血清抗体效价明显高于健康人,表明该蛋白具有良好的抗原性,小鼠免疫力试验结果表明该蛋白具有较好的免疫原性.结论 电洗脱法得到的目的蛋白纯度较高,且有较好的免疫学活性.
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鸡卵黄乙肝病毒特异性转移因子的制备及鉴定
目的制备鸡卵黄乙肝病毒特异性转移因子(EYHBV-TF),并检测其免疫活性.方法用乙肝疫苗免疫母鸡,收集鸡蛋,取卵黄进行透析,制备EYHBV-TF,参照药典要求,采用光谱法、高效液相色谱法(HPLC)、Lowry法等检测其理化性质.采用白细胞粘附抑制法(LAI)和迟发型皮肤超敏试验(DTH)检测特异免疫活性.结果EYHBV-TF是一种可透析、含有18种氨基酸、相对分子质量小于12 000的小分子物质,其多肽含量为1.2 mg/ml,核糖含量为152.94μg/ml,pH 6.9±0.5,蛋白反应阴性,大紫外吸收光谱在270 nm处.该EYHBV-TF能明显抑制小鼠白细胞粘附(P＜0.01),并能诱导小鼠跖趾部皮肤的迟发型超敏反应(P＜0.01),与猪脾淋巴细胞制取的乙肝特异性转移因子(PSHBV-TF)检测结果接近(P＞0.05).而正常卵黄提取液组、非特异性转移因子和甲肝抗原(HAAg)对照组均不能表现出这两种效应(P＞0.05).结论EYHBV-TF与PSHBV-TF主要理化性质和作用相类似,均具有乙肝抗原特异性细胞免疫活性.
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粉尘螨过敏原蛋白Der f 3的表达纯化及活性鉴定
目的:制备有生物学活性的粉尘螨过敏原蛋白Der f3.方法:构建带有Strep Ⅱ标签的原核表达体系Rosetta-pET44a-Derf3高效表达目的蛋白,分别用梯度透析法和亲和层析法对其进行复性纯化,通过Western Blot试验验证目的蛋白的有效表达,后用丝氨酸蛋白酶特异荧光底物及粉尘螨过敏病人血清分别鉴定目的蛋白的酶学活性及免疫学活性.结果:利用原核表达体系成功表达了目的蛋白Derf3,Western Blot结果显示有目的条带出现.复性纯化后的过敏原蛋白Der f3能够成功降解丝氨酸蛋白酶特异性荧光底物,ELISA试验结果显示该蛋白血清特异性IgE在4级以上粉尘螨过敏病人中阳性率为4％.结论:成功获得有酶学活性及免疫学活性的粉尘螨过敏原蛋白Der f3,为生产高质量的诊断试剂和疫苗奠定了基础.
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CA1-18检测对肺癌诊断的临床意义
CA1-18是从始发性及转移性胃肠腺癌中分离提取出来的.CA1-18的免疫学特性及免疫学活性决定其成为一种新的肿瘤相关抗原.国外18家医院通过研究600多个课题并对8500多个样本进行检测证明了CA1-18的检测价值.这是一种简单、快速、灵敏并具有可再生能力的体外检测技术,各项独立研究证实了CA1-18在癌症诊断检测方面的价值.
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ctxB和ureB抗原表位的融合表达及其免疫学活性
为研制新型有效的幽门螺杆菌疫苗,设计了一个由ctxB(去除信号肽部分)和ureB抗原表位融合的新型分子.PCR扩增霍乱弧菌的ctxB基因,插入到质粒pET32a上,再将化学合成的ureB抗原表位序列(编码的氨基酸为CHHLDKSIKEDVQFADSRI)连接到ctxB下游,融合基因命名为ctube.将含有融合基因的pET32a转化到大肠杆菌BL21(DE3),诱导表达后SDS-PAGE测定融合蛋白ctube的分子质量,ELJSA法检测ctube对神经节苷脂GM1的结合活性,Western blotting检测对兔抗幽门螺杆菌(Hp)多抗的结合活性.序列分析结果表明,ctube基因全长387bp,编码129个氨基酸,其中ctxB的密码子与GenBank上的序列同源性达到99%.转化后的大肠杆菌BL21(DE3)经IPrG诱导表达后,产生了一个分子质量为2.5万的蛋白,经肠激酶酶切后的产物为ctube.ELISA试验和West Blotting表明,ctube与神经节苷脂性GMi、兔抗Hp多抗均具有很好的结合活性,有希望成为一个具有抗幽门螺杆菌感染的新的活性分子.
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乙型肝炎病毒特异性转移因子的研究
制备一种乙型肝炎病毒特异性转移因子制剂(HBV-STF),为临床应用提供有价值的实验依据.从人HBsAg阳性胎盘中制备了HBV-STF,并对其理化性质、免疫学活性进行了检测和初步的临床试用.每批样品经无菌试验、热原质检查、动物安全性试验等均符合药典要求.本品大紫外吸收光谱在256±2 nm处,E260nm/E280nm比值大于2.7.其水解氨基酸含17种.对人T淋巴细胞E受体的激活试验结果显示,HBV-STF的Ea-RFc平均增高率在83.47%～103.48%之间,抗原特异性皮肤试验表明HBV-STF能刺激小鼠体内T淋巴细胞增殖,诱导小鼠跖趾部皮肤的迟发性变态反应.对HBV-STF的初步临床试用也取得明显效果,显示HBV-STF是一种可用于治疗乙肝的安全、有效的免疫调节剂.
关键词： 乙型肝炎病毒特异性转移因子 制备 理化性质 免疫学活性 -
胰高血糖素样肽-1及其类似物的生物学活性测定方法
胰高血糖素样肽-1(GLP-1)因其独特的生理功能成为治疗2型糖尿病有潜力的药物之一,有很好的开发前景.本文对GLP-1及其类似物的生物学活性,如稳定性、免疫学活性、体外和体内生物学活性的测定方法进行了综述,为GLP-1及其类似物的应用开发研究提供参考.
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利用杆状病毒载体在家蚕幼虫中高效表达人胰岛素样生长因子-2(hIGF-2)
目的:研制有生物活性的可溶性分泌型重组人胰岛素样生长因子-2(rhIGF-2).方法:将14 kD hIGF-2前体cDNA基因插入家蚕核型多角体病毒(BmNPV)转移载体pBakPAK8中,经与野生型病毒DNA共转染家蚕细胞后,通过体内同源重组的方式获得重组病毒BmNPV/IGF-2.以BmNPV/IGF-2感染5龄家蚕幼虫,分别在感染后24,48,72,96,108,120 h提取家蚕血淋巴液,以ELISA法测定不同时象家蚕血中IGF-2浓度,采用Western-blot分析鉴定IGF-2免疫学活性,MTT法观察其对NIH3T3细胞增殖的影响. 结果:ELISA测定显示,BmNPV/IGF-2感染家蚕幼虫96 h后IGF-2表达率高,每毫升血淋巴中约含IGF-2 14 μg, Western-blot分析发现表达产物在蚕体内被加工成7.0 kD成熟hIGF-2,并对NIH3T3细胞具有良好促增殖效应,其促细胞生长能力明显优于来源于E.coli的IGF-2标准品.结论:本研究实现具有免疫学活性及生物学活性的rhIGF-2在家蚕杆状病毒表达系统的高效表达.
关键词： 人胰岛素样生长因子-2 家蚕核型多角体病毒 基因表达 免疫学活性 生物学活性 -
抗人AFP单链抗体的制备、鉴定及其免疫学活性的测定
目的 构建具有免疫学活性的抗人甲胎蛋白单链抗体ScFv (single chain fragment of variety region,ScFv),为进一步的研究奠定实验基础.方法 采用RT-PCR 技术,从分泌抗人AFP 单克隆抗体的杂交瘤细胞中扩增mAb 的VH、VL 基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL 型的ScFv 片段.将ScFv 片段亚克隆至原核分泌型表达载体pUC19,将pUC19-ScFv 纯化质粒转染大肠杆菌BL21 并用IPTG 诱导表达ScFv 蛋白.用SDS-PAGE方法检测ScFv 的表达,采用ELISA 检测ScFv 的亲和活性.结果 大肠杆菌BL21 可被诱导表达ScFv 蛋白.SDS-PAGE 法证实ScFv 蛋白在细胞包涵体有表达,大小约24 kD.ELISA 检测表明,ScFv 蛋白经能与重组人AFP 纯化抗原结合,并具有抑制亲本单抗与其结合的能力.结论 成功构建抗人AFP 的ScFv 表达载体,并能有效表达出具有免疫学活性的ScFv 蛋白.
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DNA疫苗的研究进展
DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的一项崭新的免疫技术,由Tang[1]等首次报道,随后引起了广泛的关注.大量的疫苗研制工作如抗流感疫苗、HIV疫苗、乙肝病毒疫苗和肿瘤相关抗原疫苗等相继报道,被称为"第三次疫苗革命"[2],是继减毒疫苗、基因工程疫苗之后的第三代疫苗.DNA疫苗具有免疫刺激活性的结构基础是非甲基化的CpG基序(CpG motif),又称为免疫刺激序列(ISS,immunostimulatory sequences).另外有人将含有CpG基序的DNA称为CpG DNA,将含有CpG基序的寡核苷酸(ODN,oligonucleoetide)称为CpG ODN.DNA疫苗在治疗、预防感染性疾病、变态反应疾病和肿瘤治疗等方面,具有强大的发展潜力.
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白耙齿菌发酵液及其不同组分免疫学活性的研究
目的 研究白耙齿菌发酵液及其不同组分的免疫学活性.方法 用白耙齿菌发酵液及其不同组分灌胃小鼠,通过脾脏和胸腺指数评估对免疫器官的影响;通过白细胞计数、巨噬细胞吞噬能力、淋巴细胞增殖,评估其对免疫细胞的影响;对血清中免疫球蛋白G(IgG)的检测评估对免疫分子的影响.结果 白耙齿菌发酵液及其不同组分均可以增强小鼠的非特异性免疫、体液免疫及细胞免疫,增加血液中淋巴细胞、中性粒细胞及单核吞噬细胞的含量,增强吞噬细胞吞噬异物的能力,促使小鼠体内产生大量的抗体及免疫球蛋白,并且使T淋巴细胞的增殖能力加强,各组间没有显著区别.结论 白耙齿菌发酵液及其不同组分可以提高小鼠免疫功能.
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蜗牛多糖的提取和免疫学活性研究
目的 提取蜗牛多糖并研究其免疫学活性.方法 用碱提醇沉法从江西巴蜗牛中提取多糖,通过溶血空斑实验、巨噬细胞吞噬功能实验、迟发型变态反应和小鼠脾淋巴细胞转化实验研究蜗牛多糖的免疫学活性.结果 蜗牛多糖显著增强小鼠溶血空斑形成,提高小鼠巨噬细胞吞噬指数,增强小鼠迟发型变态反应,显著提高小鼠脾淋巴细胞转化率,且有良好的量-效关系.结论 蜗牛多糖能提高小鼠的非特异性和特异性细胞免疫功能.
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抗鼠CTLA-4 单链抗体的构建与表达及其免疫学活性的鉴定
目的 构建具有免疫学活性的抗小鼠细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)单链抗体ScFv (single chain fragment of variety region),为进一步将其应用到动物体内奠定基础.方法 采用RT-PCR技术,从分泌抗小鼠CTLA-4 单克隆抗体(mAb) 的杂交瘤细胞中扩增mAb 的VH、VL 基因,并进一步将其组装成VH-Linker-VL 型的ScFv 片段.将ScFv 片段亚克隆至pGMET 载体,测序正确后将其克隆至真核分泌型表达载体pSect2-GFP,将pSect2-GFP-ScFv 纯化质粒转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO)并进行表达,同时经Zeocin筛选稳定表达株.用Western blot方法检测ScFv 融合蛋白的表达,采用ELISA检测 ScFv 的亲和活性.结果 经Zeocin 筛选2周后,CHO细胞株可稳定表达GFP-ScFv 蛋白.Western blot法证实GFP-ScFv 蛋白在细胞上清和细胞裂解液中均有表达,大小约55 kD.ELISA检测表明,CHO 培养上清中的GFP-ScFv 蛋白经浓缩初纯后能与重组小鼠CTLA-4 纯化抗原结合,并具有抑制亲本单抗与其结合的能力.结论 成功构建了抗小鼠CTLA-4 的ScFv 真核表达载体,并能有效表达出具有免疫学活性的ScFv 融合蛋白.
关键词： 细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4 单链抗体 真核表达 免疫学活性
