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日本血吸虫中国大陆株过氧化物氧化还原酶1的表达及生物学功能研究
目的 制备重组日本血吸虫过氧化物氧化还原酶1 (rSj Prx1)蛋白,研究其生物学功能. 方法 采用RT-PCR方法,从日本血吸虫成虫cDNA中扩增编码Sj Prx1蛋白的基因片段,并亚克隆入表达载体pET28a(+),构建重组表达质粒Sj Prx1-pET28a,转化E.coli BL21,用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)诱导表达rSj Prx1蛋白,通过镍柱亲和层析纯化rSj Prx1蛋白.采用生物化学方法分析rSj Prx1对底物H2O2进行还原的酶活性.用纯化的rSj Prx1蛋白免疫小鼠,酶联免疫法检测小鼠血清抗体水平,观察其免疫原性.通过Western blot观察rSj Prx1蛋白对血吸虫感染血清的免疫反应性.以纯化rSj Prx-1蛋白刺激巨噬细胞RAW264.7,通过流式分析观察RAW264.7细胞表面标志物CD16/32、CD206表达水平的变化,通过RT-PCR检测RAW264.7细胞内诱导型一氧化氮合酶与精氨酸酶表达水平的变化,采用细胞因子检测试剂盒分析巨噬细胞培养上清液中IL-12及IL-10水平的变化,以评价rSj Prx1蛋白的免疫调节功能. 结果 通过RT-PCR获得编码Sj Prx1蛋白的基因片段,并成功构建了重组表达质粒Sj Prx1-pET28a.含重组质粒Sj Prx1-pET28a的转化子细菌经IPTG诱导表达可溶性Sj Prx1蛋白.纯化的rSj Prx1蛋白具有氧化还原活性,可还原底物H2O2.rSj Prx1蛋白免疫小鼠可产生高效价的血清抗体,该蛋白能被日本血吸虫感染者血清、病兔及病鼠血清识别,而免疫血清同样可能识别来源于血吸虫成虫及虫卵的天然SjPrx1蛋白.制备的rSj Prx1可诱导巨噬细胞高水平表达与M2型转化相关的IL-10、精氨酸及CD206. 结论 制备的rSj Prx1蛋白具有天然的酶学特性、抗原性和Th2型免疫调节功能,为进一步发展新的血吸虫病治疗药物和免疫调节方法奠定了基础.
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淫羊藿总黄酮对大鼠肝微粒体CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性的影响
评估淫羊藿总黄酮对大鼠肝细胞色素P450及其主要亚型活性的潜在影响.淫羊藿总黄酮以300 mg/kg/d的剂量对SD大鼠进行连续灌胃处理15天,测定肝微粒体中CYP450含量与CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1亚型活性,观察淫羊藿总黄酮的效应.CYP1A2的活性用荧光比色法进行测定,CYP3A4和CYP2E1的活性用紫外可见分光光度法测定.淫羊藿总黄酮处理后的大鼠肝脏CYP450含量及CYP1A2、CYP3A4和LICYP2E1亚型活性均明显增高,其中CYP1A2和CYP2E1活性升高显著(P<0.01).淫羊藿总黄酮对大鼠肝脏CYP450及主要亚型CYP1A2、CYP3A4和CYP2E1活性均有诱导效应.
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粉尘螨过敏原蛋白Der f 3的表达纯化及活性鉴定
目的:制备有生物学活性的粉尘螨过敏原蛋白Der f3.方法:构建带有Strep Ⅱ标签的原核表达体系Rosetta-pET44a-Derf3高效表达目的蛋白,分别用梯度透析法和亲和层析法对其进行复性纯化,通过Western Blot试验验证目的蛋白的有效表达,后用丝氨酸蛋白酶特异荧光底物及粉尘螨过敏病人血清分别鉴定目的蛋白的酶学活性及免疫学活性.结果:利用原核表达体系成功表达了目的蛋白Derf3,Western Blot结果显示有目的条带出现.复性纯化后的过敏原蛋白Der f3能够成功降解丝氨酸蛋白酶特异性荧光底物,ELISA试验结果显示该蛋白血清特异性IgE在4级以上粉尘螨过敏病人中阳性率为4％.结论:成功获得有酶学活性及免疫学活性的粉尘螨过敏原蛋白Der f3,为生产高质量的诊断试剂和疫苗奠定了基础.
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蛋清溶菌酶部分酶学性质及酶活性的影响因素研究
目的 探讨将蛋清溶菌酶制成液体制剂的可行性.方法 通过改变不同影响因素测定蛋清溶菌酶的活性,观察几种常用辅料对蛋清溶菌酶活性的影响.结果 酶活性在pH 6.0～6.5强,且在pH 5～7范围内较稳定;在25～65℃范围内随着作用温度的升高酶的活性增强,但温度太高则变性失活;Na+、K+对其活性有轻微激活作用 ,Mn2+、Mg2+对溶菌酶活性无明显影响,Co2+、Ca2+、Cu2+ 、Fe2+、Zn2+使溶菌酶的活性下降;吐温20、吐温80、甘油溶液对酶活有抑制作用;EDTA-2Na在0.000 5%～0.300 0%浓度范围内对溶菌酶活性具有激活作用,浓度继续增加反而有抑制活性作用.结论 初步试验结果表明溶菌酶可以制成合适的液体制剂.
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dUTP焦磷酸酶在大肠癌细胞和组织中的差异表达
目的 验证dUTP焦磷酸酶(dUTPase)在人4种大肠癌细胞SW480,SW620,LoVo,SW1116和组织的差异表达.方法 RT-PCR检测人4种大肠癌细胞SW480,SW620,LoVo,SW1116中焦磷酸酶的mRNA表达水平,并通过检测该酶水解dUTP释放的焦磷酸(PPi)来测定这4种大肠癌细胞dUTPase的酶活性.免疫细胞和组织化学检测焦磷酸酶的蛋白表达差异.结果 dUTPase在SW620和LoVo细胞的mRNA水平和酶活性高于SW480和SW1116细胞.大肠癌SW620,LoVo细胞免疫化学dUTPase表达高于SW1116、SW480细胞.大肠增生性息肉和腺瘤性息肉dUTPase的表达低于大肠癌.结论 焦磷酸酶dUTPase在人4种大肠癌细胞和组织存在差异表达.
