致病性大肠埃希菌EspA抗血清制备及其对细菌粘附的影响

目的 制备致病性大肠埃希菌(EPEC)分泌蛋白 A(EspA)抗血清,并检测其对EPEC粘附的中和作用. 方法 以EPEC标准株E2348/69为模板,采用PCR方法获得EspA基因,将目的基因连接载体pET32a,构建重组表达质粒pET32a-EspA,转入表达菌株BL21后用IPTG诱导表达并采用Ni-柱亲和层析法纯化EspA;以纯化EspA辅以佐剂免疫家兔,多次免疫获得抗血清,采用中和试验检测抗血清中和EPEC粘附Hep-2细胞的能力. 结果 成功构建Es-pA原核表达质粒,表达蛋白分子质量单位为37 ku,与预期值相符.用纯化的表达蛋白EspA免疫家兔,对流免疫电泳检测抗血清的效价为1∶2,但稀释度≤1∶16时仍能效抑制EPEC粘附Hep-2细胞. 结论 EspA抗血清具有抑制EPEC粘附Hep-2细胞作用,有望为疫苗研发的候选抗原.

肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA-Stx2B融合蛋白的克隆、表达及生物学活性研究

目的 重组表达肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7的EspA与Stx2B融合蛋白,并对其生物学活性进行初步研究.方法 采用PCR技术从EHEC O157:H7基因组中扩增espA基因及stx2B基因,两基因通过连接子(linker)相连,T/A法克隆,克隆至pET-28a(+)表达载体上,转化宿主细胞E. coli BL21(DE3),IPTG诱导表达,SDS-PAGE检测其表达量及表达形式,免疫印迹分析免疫反应性.用纯化的融合蛋白免疫BALB/c小鼠,检测其免疫原性,然后对免疫小鼠进行O157活菌攻毒试验和O157超声上清致死保护试验.结果 构建的espA-stx2B融合基因片段的测序结果 与理论预测值完全一致.融合蛋白在工程菌中以包涵体的形式表达,表达量约40%.免疫印迹显示融合蛋白能分别与EspA和Stx2B抗体发生抗原抗体反应.免疫小鼠其特异性抗体阳转率达100%,EspA和Stx2B抗体的几何平均滴度(GMT)分别增长了124.30倍和58.49倍.免疫小鼠O157活菌攻毒保护试验免疫后排菌时间和排菌量与对照组相比并没有明显改变,O157菌超声上清致死保护试验免疫组存活率为10/15,对照组全部死亡.结论 在E. coli中高效表达了EspA-Stx2B融合蛋白,此融合蛋白具有良好的免疫原性和免疫反应性,融合蛋白免疫小鼠并不能降低细菌在小鼠胃肠道的黏附与定植,但却起到明显的免疫保护作用,保护率为66.7%(10/15).

EspA-Stx2A1融合蛋白的表达、纯化及其免疫学活性

目的 在原核表达系统巾表达肠出血性大肠杆菌O157:H7(EHEC O157:H7)Ⅲ型分泌蛋白EspA与Stx2毒素A1亚单位(Stx2A1)的融合蛋白,并对表达蛋白进行纯化及免疫学活性检测.方法 PCR扩增espA和stx2A1全长基因,利用重叠延伸PCR技术获得espA-stx2A1融合基凶,T-A克隆后插入表达载体pET-28a(+),构建原核表达质粒pET-28a(+).espA-stx2A1,转化大肠杆菌BL21(DE3),分别在37℃和25℃用IPTG诱导表达.以EspA单克隆抗体亲和层析柱纯化目的 蛋白,免疫小鼠,检测其免疫原性及抗血清的反应原性,并以天然Stx2毒素攻击,观察保护效果.通过细胞毒试验检测免疫小鼠抗血清的体外中和作用.结果 重霍延伸PCR方法扩增出1 319 bp的融合基因片段,重组表达质粒构建正确;目的 蛋白在25℃时的表达量明显高于37℃,约占菌体总蛋白的40%.两种温度下,目的 蛋白均主要以包涵体形式存在;纯化后蛋白纯度可达90%.Western blot结果证实,融合蛋白与EspA单克隆抗体和Stx2A1单克隆抗体均发生特异性反应.融合蛋白免疫小鼠制备的抗血清能分别与O157:H7的EspA、Stx2A发生特异性免疫反应.融合蛋白免疫小鼠能够抵御致死剂量天然Stx2毒素的攻击,保护率达95%.免疫小鼠血清町以中和天然Stx2毒素对HeLa细胞的毒性作用.结论 已成功表达了EspA-Stx2A1融合蛋白,纯化的蛋白显示出较好的免疫保护效果,为研制EHEC O157:H7基因工程多亚单位疫苗奠定了基础.

大肠杆菌变种EspA的研究进展

大肠杆菌是常见的微生物之一,在自然界广泛分布,在动物体内也存在.它具有易培养、生长快、易变异等特点.肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic E.coli,EHEC)是大肠杆菌的一个变种,曾在多个国家暴发流行.感染主要导致腹泻、出血性结肠炎(hemorrhagic colitis,HC),并经常伴发溶血性尿毒综合征(hemolytic uremic syndrome,HUS)、血栓形成的血小板减少性紫癜(thrombotic thrombocytopenic purpura,TTP)并发症,严重威胁着人类的生命健康[1].

肠致病性大肠杆菌的生物膜形成对致病岛基因的影响

目的 研究不同pH值条件对肠致病性大肠埃希菌生物膜形成能力及对致病岛基因的影响.方法 将2株EPEC菌株(E11313和E11435)分别接种于pH值为7、9和11的LB培养基,用结晶紫染色半定量法检测2株菌株产生物膜能力,观察产生物膜菌株及非产生物膜菌株生物膜形成的差异,将2株菌株产生的生物膜溶解,提取总RNA,定量PCR检测不同pH浓度的生物膜与致病岛基因EspA表达水平的关系.结果 E11435为生物膜阳性菌株,E11313为生物膜阴性菌株,pH为7～9之间,生物膜的形成变化不大,当pH值=11时,菌株形成生物膜更容易,E11435菌株形成的生物膜可影响EPEC致病岛EspA基因的表达,且当pH=11时,EspA表达水平明显提高(P＜0.05).结论 碱性环境可促进肠致病性大肠杆菌生物膜的形成.生物膜阳性肠致病性大肠杆菌可显著提高致病岛EspA基因的表达水平.

类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FliC与EHEC O157:H7 EspA蛋白的融合表达及其免疫学性质研究

目的 融合表达类鼻疽杆菌鞭毛蛋白FilC与肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157 EspA蛋白,并评价其免疫学性质.方法 PCR扩增类鼻疽杆菌FilC编码基因bpsl3319,连接到基于EHEC O157 EspA的表达载体pEspA上,表达并纯化EspA-FliC融合蛋白,Western blot分析其抗原性；EspA-FlC免疫Balb/c小鼠评价其免疫原性.结果 获得了bpsl3319目的基因,构建了重组表达质粒pEspA-bpsl3319；实现了EspA-FilC的高效表达,其表达量约占菌体总蛋白的25％,纯化后蛋白纯度超过85％.Westernblot结果显示EspA-FliC能分别与抗类鼻疽杆菌多克隆抗体、抗EHEC O157:H7 EspA的单抗和多抗血清发生特异性抗原抗体反应.EspA-FilC免疫Balb/c小鼠可刺激其产生高效价特异的IgG,且此抗体能识别EspA-FilC 、EspA以及天然类鼻疽杆菌的FliC.结论 重组表达了融合蛋白EspA-FilC,该蛋白具有较好的免疫反应性和良好的免疫原性.此研究为下一步研制类鼻疽杆菌和EHEC O157的二联疫苗奠定了基础.

抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定

目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157: H7 EspA单克隆抗体(mAb).方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠, 运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株.以Ig 类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb 的Ig亚类, ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性.结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb, Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型.Western blot和免疫荧光分析表明, 3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157: H7的EspA成分. 结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA的mAb, 并证明了该mAb的生物学活性, 为深入研究肠出血性大肠杆菌O157: H7的致病机制提供新的手段.

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