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CTD格式申报资料中原料药特性鉴定部分的解读
通用技术文件(CTD)作为一种注册申报资料的格式,可提升申报资料的质量,提高技术审评的质量和效率.根据笔者对《化学药品新注册分类申报资料要求(试行)》的理解,结合几年来CTD格式申报资料的审评体会,就原料药特性鉴定部分资料的撰写要求和相关研究技术要求进行解读和分析,希望有助于提升申请人对特性鉴定相关研究工作的认识,提高该部分资料的撰写质量.
关键词： 通用技术文件(CTD) 特性鉴定 解读 -
粉尘螨变应原第5组分单克隆抗体的制备与鉴定
本研究制备并鉴定了鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb).将质粒pET28a(+)Der f 5转化ArcticExpress (DE3)感受态细胞,取单个菌落接种培养,加入IPTG诱导表达,经纯化获得Der f 5重组蛋白.利用Der f 5重组蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾脏细胞与其骨髓瘤细胞融合.通过间接ELISA法筛选特异性分泌抗体的杂交瘤细胞.用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化.通过间接ELISA、Western blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性.终获得3株稳定分泌鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的高效价单克隆抗体.研究分析表明该3株单抗均能识别重组Der f 5蛋白和天然的粉尘螨提取物.本实验成功制备了3株鼠抗粉尘螨变应原Der f 5的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der f 5检测及纯化方法奠定了基础.
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抗重组人骨唾液酸蛋白单克隆抗体的制备及鉴定
目的 研制重组人骨唾液酸蛋白(rhBSP)单克隆抗体(mAb),并鉴定其特性.方法 以纯化的rhBSP免疫Balb/c小鼠,采用杂交瘤技术制备抗rhBSP mAb;用亚型鉴定试剂条鉴定IgG亚类;ELISA鉴定mAb的特异性和效价.结果 获得2株能稳定分泌特异性mAb的抗rhBSP的杂交瘤细胞系AHB1和AHB5,Ig亚类分别为IgG2a和IgG1,轻链均为κ型,其效价分别为1×10-3和1×10-7.腹水mAb经Protein A亲和色谱柱纯化后,纯度达92%以上.结论 获得抗rhBSP的mAb,为进一步研究BSP的生物学功能和用于临床诊断实验研究创造了条件.
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抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备并鉴定鼠源抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ单克隆抗体(Monoclonal Antibody,McAb).方法 重组Der fⅡ蛋白为抗原免疫BALB/c小鼠,取小鼠免疫脾细胞与NS-1细胞融合.间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞.用筛选获得的单克隆细胞株诱生小鼠腹水,蛋白G亲和层析法纯化腹水抗体.利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型；通过间接ELISA、Western Blotting方法鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性.结果 获得5株IgG2a型鼠抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ的单克隆抗体,效价良好.ELISA和Western Blotting分析表明该5株单抗均可识别重组Der fⅡ蛋白和天然粉尘螨提取物.结论 成功制备了5株鼠抗粉尘螨主要变应原Der fⅡ的单克隆抗体,为建立粉尘螨主要变应原Der fⅡ的检测及纯化方法奠定了基础.
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抗人蛋白酶激活受体3单克隆抗体的制备与鉴定
目的:制备并鉴定抗人蛋白酶激活受体3(PAR3)单克隆抗体(mAb).方法:以人PAR3为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗PAR3 mAb.采用捕获ELISA法鉴定mAb的Ig亚类;通过ELISA、流式细胞分析、激光共聚焦显微镜技术、免疫组织化学染色法、斑点杂交技术鉴定mAb的特异性.结果:获得2株可稳定分泌抗人PAR3 mAb的杂交瘤细胞,其分泌的mAb均为IgM.斑点杂交技术分析表明,其mAb能与PAR3抗原有效结合.免疫组织化学染色表明,mAb与肺组织中的巨噬细胞、结肠组织中的淋巴细胞及疑似肥大细胞、扁桃体和包皮组织中的淋巴细胞的反应呈阳性.流式细胞仪分析及激光共聚焦显微镜观察显示,2株mAb与人肺腺癌A549细胞胞内及膜上的PAR3均呈阳性反应.结论:成功地制备抗PAR3 mAb,为变态反应性和炎症性疾病的研究提供了有用的试剂.
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柯萨奇病毒A16型2 B基因的酵母双杂交诱饵载体的构建及其特性鉴定
目的：构建柯萨奇病毒A16的2B基因的酵母诱饵表达载体，用于筛选与2B相互作用的蛋白。方法 PCR扩增2B全序列，克隆入pGBKT7?BD，将构建好的 pGBKT7?2B转化到酵母细胞 Y2HGold；用Western印迹分析诱饵蛋白的表达，检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应。结果成功克隆了pGBKT7?2B并转化至Y2 HGold中，转化细胞Y2 HGold [pGBKT7?2B]可以表达诱饵蛋白2B，2B蛋白对转化细胞无细胞毒性和自激活效应。结论成功构建了酵母诱饵表达载体pGBKT7?2B，可用于酵母双杂交筛选与2B蛋白相互作用的宿主靶蛋白。
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抗粉尘螨主要变应原Der f1单克隆抗体的制备与鉴定
目的 制备和鉴定鼠抗粉尘螨主要变应原Der f1的单克隆抗体(monoclonal antibody,McAb).方法 利用重组Der f1蛋白为免疫原,免疫BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤NS-1细胞融合.通过间接ELISA法筛选特异性分泌的杂交瘤细胞.用杂交瘤细胞株诱生小鼠腹水,应用蛋白A亲和层析法进行抗体纯化.采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型;通过间接ELISA、Western Blotting鉴定该单克隆抗体的特性和交叉性.结果 获得6株可稳定分泌鼠抗粉尘螨主要变应原Der f1的单克隆抗体,其Ig亚型均为IgG1,且6株单抗均具有良好的效价.ELISA和Western-blotting分析表明,该6株单抗均能识别重组Der f1蛋白和天然的粉尘螨提取物.其中,除了484不识别屋尘螨提取物,其他均能识别.结论 成功制备了6株鼠抗粉尘螨主要变应原Der f1的单克隆抗体.为建立粉尘螨主要变应原Der f1检测及纯化方法奠定了基础.
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抗人白介素-28A单克隆抗体的制备与鉴定
目的制备抗人白介素-28A(hIL-28A)单克隆抗体(mAb).方法以hIL-28A融合蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠,运用杂交瘤技术制备抗hIL-28A mAb.采用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb的Ig亚类,通过ELISA、Western blot、免疫组化染色法、流式细胞分析、激光共聚焦显微镜技术鉴定mAb的特异性.结果获得2株稳定分泌抗hIL-28A mAb的杂交瘤细胞,但2株mAb均与hIL-29有弱交叉反应.2株mAb的类别均为IgM.Western blot分析表明,此mAb所识别的靶分子的相对分子质量(Mr)约为19 000.免疫组化染色表明,mAb与包皮和肺组织中的上皮细胞、结肠组织中的疑似巨噬细胞呈阳性反应.流式细胞仪分析显示,2株mAb与人脐静脉内皮细胞系HUVEC细胞的反应均呈阳性.激光共聚焦扫描显微镜观察到荧光标记的阳性反应物主要位于HUVEC细胞胞浆内.结论成功地制备抗hIL-28A mAb,为病毒感染性疾病、肿瘤和其他疾病的研究提供新的手段.
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抗人降钙素原特异性单克隆抗体的制备鉴定及初步应用
目的 获得抗人降钙素原(procalcitonin,PCT)单克隆抗体,并鉴定其基本特性.方法 从NCBI数据库中获得PCT编码序列,以原核表达系统表达PCT重组蛋白,经镍亲和层析柱纯化,获得筛选单克隆抗体的筛选原；综合应用多种生物信息学分析软件预测PCT中潜在的B细胞表位肽,用合成肽对BALB/c小鼠进行免疫,纯化单克隆抗体,通过间接ELISA、Western blot和免疫组化鉴定获得的单克隆抗体.将获得的单克隆抗体作为捕获抗体,经过配对建立检测重组PCT的ELISA体系,并初步对临床血清进行了检测.结果 成功获得3株PCT特异性单克隆抗体,分别为2-D7、2-H12和4-H12,亚类分别为IgG1和IgG2a,高效价为1∶1 024 000,亲和力高可达到1.3×109 L/mol;选取2-D7经Western blot 鉴定能够检测重组PCT蛋白,经免疫组化证实能特异性识别甲状腺组织中PCT蛋白,经过配对成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,运用建立体系检测临床血清PCT含量时发现正常组与细菌培养阳性组之间具有显著差异.结论 成功表达了人PCT重组蛋白,获得了3株高特异性和高亲和力的PCT单克隆抗体,成功建立了检测重组PCT的ELISA体系,并初步用于临床样本检测.
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花生主要过敏原Ara h1单克隆抗体的制备与应用
目的 制备与鉴定抗花生主要过敏原Arah1单克隆抗体,建立双单抗ELISA法,检测食品中花生过敏原.方法 以花生主要过敏原Ara h1为抗原免疫Balb/c小鼠,融合免疫鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞NS-1.半固体培养基法结合有限稀释法筛选稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株后诱生小鼠腹水,采用蛋白A亲和层析法获得纯化抗体.利用Ig类与亚类鉴定试剂盒鉴定该单克隆抗体的Ig亚型.间接ELISA法和Western blot鉴定抗体效价和特异性以及与其他过敏源的交叉反应性.建立双单抗夹心ELISA法检测食品中的花生过敏原.结果 共获得抗Arah1细胞株4株,分别命名为2G9、5G4、5B5、2C7,效价均高于1∶106.经抗体亚型鉴定,4株抗体均为IgG1型.Western blot的结果表明4株抗体均能识别Arah1,其中2G9与5G4结合能力较强.在特异性检测实验中,2G9和5G4与其他种类过敏原无交叉反应.通过建立双单克隆抗体夹心ELISA法,发现花生Ara h1蛋白的检出低限为:5 ng/ml,标准曲线在～80 ng/ml范围内线性良好.利用此法检测了10种食品,结果显示在5种含有花生成分的食品中均检测到了花生过敏原.结论 获得高效价抗体4株,建立了高效、高特异性的食品中花生过敏原的检测方法,为食品中花生过敏原的检测提供了依据.
关键词： 花生Ara h1蛋白 单克隆抗体 特性鉴定 过敏原检测 -
抗多环芳烃单克隆抗体的制备及初步鉴定
目的 本研究制备了2株抗多环芳烃单克隆抗体,并对其免疫学特性进行了初步鉴定.方法 以芘丁酸(PBA)为半抗原,采用活性酯法分别与BSA和OVA偶联合成免疫抗原和包被抗原,4次免疫Balb/c小鼠后,选择抗体效价1∶25 600的小鼠脾细胞与Sp2/0细胞采用PEG进行细胞融合.ELISA法筛选阳性细胞株,有限稀释法进行亚克隆,体内诱生腹水法制备单克隆抗体.抗体经Protein G亲和纯化后,SDS-PAGE检测抗体纯度,测定抗体水平和亚类.间接ELISA法测定抗体效价、亲和力常数;竞争ELISA法测定2株抗体特异性和交叉反应率.结果 PBA-BSA免疫成功,共获得2株可稳定分泌抗多环芳烃单克隆抗体的杂交瘤细胞株,命名为#1 、#6-B7.2株单克隆抗体纯化后经鉴定为IgG1亚类,质量浓度分别为4.1和3.6 mg/ml,效价分别为1∶25 600和1∶51 200,亲和常数分别为7.52×108和1.25×109.结论 2株抗体均对高环PAHs具有较高的交叉反应率,而无法识别低环的PAHs.
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抗组织型纤溶酶原激活物单克隆抗体的制备及其特性鉴定和初步应用
目的研制抗组织型纤溶酶原激活物(tPA)单克隆抗体(mAb), 鉴定其各种生物学特性.方法采用传统的细胞融合、有限稀释法,制备稳定分泌mAb的细胞株.采用辛酸、硫酸铵沉淀法,纯化腹水中的mAb,以SDS-PAGE鉴定其纯度.运用ELISA和细胞免疫组化染色,鉴定mAb的各项特性.结果获得了两株能稳定分泌抗tPAmAb的细胞株.用该两株细胞分泌的mAb能检测出0.4 μg/L重组的tPA和血清中的tPA.结论成功地研制了两株抗tPA的mAb,为进一步用于临床诊断和实验研究创造了条件.
关键词： 杂交瘤 单克隆抗体 组织型纤溶酶原激活物(tPA) 特性鉴定 -
抗人Glypican3N端融合蛋白单克隆抗体研制及特性鉴定
目的:制备抗人磷脂酰蛋白聚糖3(Glypican3,GPC3)N端蛋白的单克隆抗体(mAb),并进行特性鉴定.方法:以纯化的GPC3 N端融合蛋白免疫BALB/c小鼠,应用淋巴细胞杂交瘤技术制备抗人GPC3N端mAb并进行纯化.经Western blot和ELISA方法鉴定其特异性、Ig亚类和效价.结果:获得2株可稳定分泌抗人GPC3N端mAb的杂交瘤细胞株(Ⅲ4B,Ⅻ6C).两株mAb均为Ig1亚类,其腹水mAb的效价分别为1:9 600及1:7 200,均可特异性地识别GPC3蛋白.结论:成功地建立可稳定分泌抗人GPC3N端mAb的杂交瘤细胞株,其分泌的mAb特异性强、效价高.
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抗HCV HVR1模拟合成肽单克隆抗体的制备及特性鉴定
目的:制备抗-HCV高变区I(HVR1)合成肽单克隆抗体(mAb),并对其特性进行鉴定.方法:以固相合成的HCV HVR1合成肽与牛血清白蛋白(BSA)偶联后,免疫8周龄的BALB/c小鼠.采用杂交瘤技术,取免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合,制备抗-HCV HVR1 mAb.经HAT,HT选择培养及有限稀释法进行克隆化后,用相关的试剂盒鉴定小鼠mAb的Ig亚类;经中和抑制后用ELISA法检测mAb的特异性:用间接ELISA法检测mAb腹水的效价及相对亲和常数.结果:获得1株可分泌抗-HCV HVR1合成肽特异性mAb的杂交瘤细胞1A9G9F11.该株mAb的Ig亚类为IgG3;腹水效价为3.125x10-5;相对亲和常数为1.0x106 L/mol.该株mAb与HBsAg,HBeAg,HBcAg,HAAg、牛血清白蛋白、酪蛋白和胸腺5肽均无交叉反应,与HCV HVR1合成肽-牛血清白蛋白出现特异性反应.结论:成功地建立了1株可分泌抗-HCV HVR1 mAb的杂交瘤细胞1 A9G9F11,为进一步的实验研究提供了重要的制剂.
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抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA单克隆抗体的制备及其特性鉴定
目的:制备抗肠出血性大肠杆菌O157: H7 EspA单克隆抗体(mAb).方法:以重组EspA蛋白为免疫原免疫BALB/c小鼠, 运用杂交瘤技术并且联合间接ELISA筛选只针对EspA的杂交瘤细胞株.以Ig 类与亚类鉴定试剂盒鉴定mAb 的Ig亚类, ELISA、Western blot及免疫荧光技术鉴定抗体的免疫学特性.结果:获得3株稳定分泌抗EspA杂交瘤细胞的mAb, Ig亚型分别为IgG1κ型、IgG2aκ型、IgG2bκ型.Western blot和免疫荧光分析表明, 3株杂交瘤细胞制备的mAb腹水都能特异地结合重组EspA蛋白和识别O157: H7的EspA成分. 结论:成功地制备了抗肠出血性大肠杆菌O157:H7 EspA的mAb, 并证明了该mAb的生物学活性, 为深入研究肠出血性大肠杆菌O157: H7的致病机制提供新的手段.
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抗白念珠菌芽管单克隆抗体的制备及特性鉴定
目的:制备抗白念珠菌芽管的单克隆抗体mAb03 2C1 C2, 并对其特性进行分析, 以探讨其应用于实验室检测的可行性.方法:利用杂交瘤技术制备分泌抗白念珠菌芽管胞壁外膜抗原mAb的杂交瘤细胞株, 对mAb的Ig亚类进行鉴定.用间接免疫荧光(IIF)法对mAb的抗体活性及特异性进行测定.在白念珠菌芽管形成条件下, 加入mAb, 观察其对白念珠菌芽管诱导的抑制及白念珠菌对上皮细胞、 内皮细胞黏附的抑制.复苏冻存的杂交瘤细胞株, 分析其持续分泌mAb的能力.结果:获得1株mAb03 2C1 C2, 其Ig亚类为IgG1.该mAb仅与白念珠菌芽管特异性结合, 并能显著降低白念珠菌芽管的生成率以及在芽管形成条件下对上皮细胞、 内皮细胞的黏附, 其抑制作用与该mAb的浓度呈正比.结论:制备的mAb03 2C1 C2抗体效价高, 在体外能抑制白念珠菌芽管的形成, 降低白念珠菌的侵袭力.而且其对白念珠菌芽管具有高度的特异性, 可用于白念珠菌和都柏林念珠菌的快速鉴别.
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抗MDV-1 VP22羧基端单克隆抗体的制备与免疫学特性鉴定
目的:制备抗血清I型马立克氏病病毒(MDV-1)VP22的单克隆抗体(mAb), 并鉴定其免疫学特性.方法:在原核系统中表达VP22 羧基端区域(94～243aa), 获得融合表达产物GST-VP22C.将该表达产物切胶免疫小鼠, 利用杂交瘤技术制备抗MDV-1 VP22C的mAb, 并通过ELISA、间接免疫荧光(IFA)、 Western blot鉴定其特性.结果:获得了2株可稳定分泌抗MDV-1 VP22C的mAb的杂交瘤细胞, 命名为3F7、 4E4.IFA鉴定表明, 两株mAb均能与感染MDV-1的成纤维细胞反应, 其中, 3F7 mAb染色呈现MDV空斑, 而4E4 mAb呈现整个单层的细胞核荧光.ELISA和Western blot分析表明, 3F7能与杆状病毒表达的VP22反应, 4E4不具备该特性.对3F7 mAb进一步鉴定, 确定了该mAb针对的具体位置在94～193aa处, 是蛋白转导域的预测位置.结论:成功地制备了抗MDV-1 VP22C的mAb, 为深入研究VP22蛋白的转导功能提供了有用的试剂.
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抗志贺样毒素Ⅱ型变异体单克隆抗体的制备及特性鉴定
志贺样毒素Ⅱ变异体(SLT-Ⅱe)是猪水肿病的主要致病因子之一, 为了制备SLT-Ⅱe单克隆抗体(mAb), 我们从TB1菌中用多粘菌素诱导提取了SLT-Ⅱe蛋白, 并且用硫酸铵盐析沉淀法对该蛋白进行了提纯, 以提纯蛋白免疫BALB/c小鼠, 利用杂交瘤细胞技术制备mAb.细胞融合后, 培养上清经间接ELISA检测, 共得到3株阳性杂交瘤细胞2E11、2H9和4F3, ELISA效价分别为1∶ 213、1∶ 213和1∶ 28, 3株杂交瘤细胞培养上清分泌的mAb在Western blot试验中均与提纯的毒素蛋白反应, 在Vero细胞中和试验中均能够中和毒素对Vero细胞的毒性作用, 从而为临床分离株SLT-Ⅱe产生的免疫学检测方法奠定了一定的基础.
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禽流感病毒核蛋白单克隆抗体的制备及部分特性鉴定
目的:制备抗禽流感病毒(AIV)核蛋白(NP)的单克隆抗体(mAb)并进行特性鉴定.方法:分别用甲醛灭活的和Triton X-100裂解的AIV H9N2及AIV NP基因的原核表达产物免疫BALB/c小鼠.经细胞融合、间接ELISA筛选及克隆化,建立能稳定分泌抗AIV NP mAb的杂交瘤细胞株.mAb的效价采用间接ELISA测定,用交叉反应试验及间接免疫荧光染色法检测mAb的特异性.结果:经细胞融合、筛选及克隆化,间接ELISA法测定,mAb共得到6株能稳定分泌抗禽流感病毒NP mAb的杂交瘤细胞株,分别命名为4F4、1C3、1G11、1C2、1D10及2E7.1G11、1D10腹水的ELISA效价高,分别为2-13和2-14.交叉反应试验及间接免疫荧光染色检测表明,两株mAb的特异性良好.结论:共获得6株抗AIV NP的mAb,其中2株mAb 1C11和1D10的效价高,特异性良好,为AIV的研究及快速诊断方法的建立奠定了基础.
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兔抗重组穿孔素抗体的制备及特性鉴定
目的:制备兔抗重组穿孔素的抗体,检测其免疫反应性,并用于穿孔素的体外功能定位分析.方法:以纯化的全长穿孔素融合蛋白DsbA-full length免疫新西兰大白兔制备抗血清,用免疫双扩法检测抗血清的效价,Western blot检测抗血清与5个穿孔素侯选活性区域重组融合蛋白的免疫反应性.将活性重组穿孔素体外作用HIV-1SF33感染的MT4细胞后,用免疫组化染色法显示穿孔素作用的部位.结果:用免疫双扩法检测表明,兔抗穿孔素融合蛋白抗血清的效价为1∶ 32;Western blot显示,抗血清可与穿孔素各重组融合蛋白发生特异性结合;免疫组化显示,穿孔素作用的部位位于靶细胞的胞质和胞膜.结论:制备的兔抗重组穿孔素融合蛋白的抗体具有较好的免疫反应性和特异性,为穿孔素的深入研究提供了有力的工具.
