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结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测
目的 构建结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活作用.方法 用PCR技术特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因,将其克隆入酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,用PCR、限制性酶切鉴定及序列测定,获得质粒pGBKT7-ESAT-6.用PEG/LiAc法将其转入酵母AH109b中,经表型筛选检测其自激活作用.结果 获得了无自激活作用的诱饵载体pGBKT7-ESAT-6.结论 ESAT-6无自激活作用,可用酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子.
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丹参均一化酵母双杂交文库的构建及与SmJAZ8互作蛋白的筛选
为构建高质量的丹参cDNA文库以及通过酵母双杂交获得丹参SrnJAZ8互作蛋白基因.研究以丹参的根、茎、叶、花、毛状根为材料,利用SMART(switching mechanism at 5'end of RNA transcript)方式合成全长cDNA,并结合基于双链的特异性核酸酶(duplex-specific nuclease,DSN)均一化技术,构建丹参的均一化全长cDNA文库.通过文库鉴定,检测到cDNA文库库容为1.45 × 106,重组率为100％,插入片段平均大小为500 ～2 000 bp.构建pDEST-pGADT7-SmJAZ8重组载体,将该载体转化Y2HGold菌种,通过酵母双杂交进行互作蛋白的筛选,终筛选到了丹参DnaJ蛋白和UBQ蛋白.该研究既成功构建了丹参均一化全长cDNA文库,又为后续丹参功能基因筛选和基因功能的研究奠定了基础.
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利用酵母双杂交筛选与苹果褪绿叶斑病毒MP互作的寄主因子
为了找到与苹果褪绿叶斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)运动蛋白(Movement protein,MP)互作的寄主因子,首先构建了ACLSV MP酵母双杂交诱饵载体,然后通过顺序转化的方法自前期已构建好的苏俄苹果(Malus sylvestris cv.R12740-7A)cDNA文库中筛选互作基因;在GenBank中对互作寄主基因进行BLAST分析,根据基因注释推测其在病毒与寄主互作过程中可能发挥的作用.结果表明,构建的酵母双杂交诱饵载体pG-BKT7-MP无自激活性、无毒性.筛选到69个与ACLSV MP互作的苏俄苹果寄主因子,包括水解酶活性、病程相关蛋白、氧化还原酶活性、磷酸酶活性、催化活性、连接酶活性、苯丙氨酸解氨酶活性、过氧化物酶活性、DNA结合功能和未知蛋白,共10类不同功能的蛋白.通过生物信息学分析,推断蛋白磷酸酶、病程相关蛋白及3-磷酸甘油醛脱氢酶可能在互作过程中起重要作用.该研究为深入了解ACLSV致病特征及病原与寄主互作机制奠定基础.
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肠道病毒71型3D聚合酶转录激活域的界定
EV71是导致手足口病的主要病原体之一,其3D聚合酶作为依赖于RNA的RNA聚合酶,在病毒基因组转录及复制过程中发挥重要作用.当前,3D与宿主细胞的相互作用鲜有研究.酵母双杂交实验是研究蛋白质相互作用成熟有效的方法.本文将3D基因克隆至pGBKT7载体,构建了用于酵母双杂交实验的诱饵质粒,鉴定正确后转化酵母细胞AH109,依次检测了3D蛋白的表达、细胞毒性和自激活能力,结果表明3D基因可在AH109菌株中表达,对后者生长无显著影响,但融合蛋白具有自激活能力.进一步构建一系列含3D蛋白截短体的诱饵质粒,通过自激活实验界定了3D的小转录激活域(1～94 aa),为后续利用酵母双杂交技术研究与3D相互作用的细胞蛋白奠定了基础.
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人肝细胞内戊型肝炎病毒结合蛋白的酵母双杂交筛选
为进一步深入研究戊型肝炎病毒(HEV)感染机制以及致病机理,用酵母双杂交系统从人肝细胞cDNA文库中筛选与戊型肝炎病毒衣壳蛋白E2相互作用的蛋白,核酸序列分析及同源性检索表明,4个克隆与E2相互作用,其中一个克隆与P38IP高度同源,细胞免疫共沉淀实验结果显示:在哺乳动物细胞水平仍能够检测到E2与P38IP片段的特异的相互作用.
关键词： 戊型肝炎病毒(HEV) 结合蛋白 酵母双杂交 -
利用酵母双杂交系统研究人血管内皮生长因子受体Flt-1的配体结合域
血管内皮生长因子(VEGF)受体Flt－1胞外区具有7个免疫球蛋白样袢(Ig－like loop).细胞外实验研究结果表明,配体结合域位于其氨基端3个袢内[1],其中第2个袢在Flt－1与其配体的结合中可能起关键作用[2].
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鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定
为构建鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体,以本实验室分离鉴定的DuCV GH01株Cap基因为棋板,对其进行酵母密码子优化后,连接到pGBKT7载体上构建诱饵质粒,经菌落PCR、酶切鉴定以及测序后,转化酵母菌株Y2HGold感受态,检测诱饵蛋白表达以及诱饵蛋白对酵母细胞毒性和白激活现象.结果表明,优化后的Cap基因全长774 bp,成功连接到诱饵载体pGBKT7中,重组质粒pGBKT7-Cap转入酵母细胞后,Western blot检测到50kD左右的蛋白条带,诱饵蛋白对酵母细胞既无毒性,又没有自激活现象.为进一步利用酵母双杂交技术筛选与Cap蛋白互作的蛋白奠定了基础.
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ClanGV的PIF0与其他经口感染因子间的互作研究
本文旨在通过酵母双杂交技术研究杨扇舟蛾颗粒体病毒(ClanGV)的经口感染因子PIF0和其他经口感染因子PIF1～PIF6之间的互作关系.首先根据ClanGV的基因组序列信息,利用在线软件TMHMMServer v.2.0对PIF0～PIF6进行跨膜区分析,确定需要扩增的片段.然后以诱饵载体pGBKT7和捕获载体pGADT为出发载体,构建了PIF0的重组诱饵载体(B0)和PIF1～PIF6的重组捕获载体(A1～A6).自激活实验证明,重组诱饵载体B0没有自激活特性,可以进一步开展蛋白的互作研究.酵母双杂交结果证明,PIF0作为诱饵载体时,可以与PIF3和PIF5的重组捕获载体发生蛋白相互作用,与PIF1、PIF2、PIF4和PIF6都没有互作现象.本研究结果将有助于揭示PIF0在ClanGV经口感染过程中的功能,并可为阐明ClanGV的经口感染机制以及开发新型病毒杀虫剂和增效剂奠定基础.
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杆状病毒经口感染因子之间相互作用分析
昆虫杆状病毒包涵体衍生型病毒(Occlusion-derived virus,ODV)被幼虫食下后通过感染中肠上皮细胞引发全身感染,这个过程被称为经口感染.多种ODV囊膜蛋白在经口感染中发挥关键作用,它们被称为经口感染因子(PIFs).研究表明7种PIFs:P74、PIF1、PIF2、PIF3、PIF4、PIF6、P95 (Ac83)和2种ODV特异性蛋白,Ac5和Ac108,与ODV表面复合物相关,该复合物被称为PIF复合物.阐明杆状病毒PIFs之间,尤其是复合物各个成分之间的相互作用特点是了解经口感染因子功能的关键.本研究以杆状病毒模式种-苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)为研究对象,利用酵母双杂交和双分子荧光互补技术探究了与PIF复合物相关的9种蛋白之间相互作用的特点.我们鉴定到了6对相互作用,分别为PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P95、PIF2-PIF3和PIF3-PIF4,但是没有鉴定到P74、PIF6、Ac5和Ac108参与相互作用.其中PIF1-PIF3、PIF2-PIF3和PIF1-P95为强相互作用,其他相互作用为中等强度相互作用.根据这些结果我们推测PIF1是PIF复合物的中心,其他成分都和PIF1存在相互作用.后,我们对目前为止已报道的PIF之间相互作用进行了总结,包括10对不同蛋白之间的相互作用:PIF1-PIF2、PIF1-PIF3、PIF1-PIF4、PIF1-P95、PIF2-PIF3、PIF3-PIF4、ODV-E56-PIF1、ODV-E56-PIF2、ODV-E56-PIF3和ODV-E56-P74,以及2对自相互作用:PIF3-PIF3和ODV-E56-ODV-E56.总之,本研究探索了PIF复合物中蛋白质的相互作用特点,揭示了复合物中各成分如何通过相互作用有机地结合在一起,推进了对该复合物的认识.
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通过配体文库研究GIPC2 PDZ配体结合特点及其相互作用蛋白
目的 通过验证性筛选配体文库,获得GIPC2 PDZ结构域的配体结合特点,进而找到GIPC2的相互作用蛋白.方法 1)利用酵母双杂交的方法从已有的PDZ配体库中寻找与GIPC2的PDZ结构域配体结合特性;2)根据GIPC2的亚细胞定位和肿瘤相关功能再结合PDZ结构域结合序列的共同特征在蛋白质数据库中预测GIPC2的天然潜在配体;3)将天然潜在配体的C末端序列依次与GIPC2 PDZ结构域或GIPC2全长进行验证反应,从而得到阳性蛋白.结果 1)GIPC2 PDZ结构域的配体结合特性是C末端后4个氨基酸为-X-S/T-X-V/L/I,是Ⅰ类PDZ配体;2)综合GIPC2的生物学特征和GIPC2 PDZ结构域的配体结合特点,在蛋白质数据库中预测得到47个天然潜在配体;3)将天然潜在配体的C末端序列克隆至酵母双杂交系统进行验证,后得到10个确定的阳性蛋白.结论 获得10个GIPC2相互作用蛋白.
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通过筛选随机多肽文库研究Veli3 PDZ结构域配体结合特性
目的 研究Veli3 PDZ结构域配体的结合特性.方法 用Veil3 PDZ为诱饵蛋白,用酵母双杂交方法 筛选随机多肽文库.结合生物信息学方法 在各种数据库中检索与Veli3 PDZ识别规律相符合的天然人类蛋白质.然后根据蛋白质的功能和细胞定位等性质选择14个潜在新配体用酵母双杂交验证相互作用.文献检索与Veil3 PDZ配体结合的其他PDZ蛋白.结果 Veil3 PDZ结构域配体C-末端保守的氨基酸序列通式可以表示为:[E/X][S/T]X[V/I/L]-COOH(X表示任意氨基酸).这是Class I PDZ结构域配体的特点.用酵母双杂交实验证实14个生物信息方法 预测的潜在配体中有6个配体与Veil3相互作用.另一个PDZ蛋白PSD-95与已报道的Veil3 PDZ配体和本研究新发现的潜在配体有多个相互作用.结论 新发现的6个Veli3PDZ潜在配体为进一步研究Veil3的生物学功能提供新的线索.另外Veli3与PSD-95可能易于同时竞争结合同一配体,其生物学意义还有待进一步研究.
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酵母双杂交技术筛选NECL1胞内区的结合蛋白
目的 筛选人源膜表面黏附分子NECL1蛋白胞内区相互作用蛋白.方法 构建含人NECL1蛋白胞内区氨基酸编码序列的诱饵质粒pGBKT7-NECLlC,对人胎脑cDNA文库进行酵母双杂交筛选.用GST pull down实验进行体外蛋白相互作用的验证.结果 酵母双杂交阳性克隆测序后显示共存在9段不同序列(存在重复克隆).比对氨基酸序列得到5个可能相互作用蛋白.通过GST pull down实验验证了其中两个蛋白与NECL1胞内区的相互作用.结论 应用酵母双杂交系统,获得了一些候选的NECL1胞内区相互作用蛋白.
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应用酵母双杂交系统筛选与蛋白激酶Pkmyt1相互作用的候选分子
目的 蛋白激酶Pkmyt1负调控小鼠1-细胞期受精卵有丝分裂的进程,但具体调控机制还不清楚.因此,利用酵母双杂交系统从人卵巢cDNA文库中筛选与Pkmyt1相互作用的候选蛋白,为研究Pkmyt1调控小鼠受精卵早期发育提供新线索.方法 以小鼠卵巢组织cDNA为模板,构建pGBKT7-Pkmyt1诱饵质粒,转化酵母感受态细胞后,分别接种于SD/-Trp(SDO)、SD/-Trp/X-α-Gal(SDO/X)和SD/-Trp/X-α-Gal/AbA plates(SDO/X/A)培养板,检测其对酵母的毒性和自身激活能力,Western blotting法检测pGBKT7-Pkmyt1在酵母细胞中的表达.将人卵巢cDNA文库与含有pGBKT7-Pkmyt1的酵母感受态细胞融合,PCR筛选出阳性克隆,提取质粒,测序鉴定,再次检测其对酵母自激活能力,利用生物信息学分析筛选蛋白与胚胎发育的关系.结果 酶切鉴定和Blast分析表明pGBKT7-Pkmyt1质粒构建成功.将该质粒转入Y2H golden中,在SDO板上克隆均匀生长,在SDO/X/A平皿上无克隆生长,Westernblotting检测Pkmyt1在酵母细胞中有表达.PCR验证融合后的阳性克隆质粒有插入片段.通过初步筛选得到182种能够与Pkmyt1相互作用的蛋白质,经回复性实验进一步验证有46个与Pkmyt1之间存在相互作用的蛋白.结论 通过筛选发现46个蛋白可能通过与Pkmyt1相互作用调控小鼠卵母细胞成熟和受精卵早期发育.
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18日龄日本血吸虫酵母双杂交cDNA文库的构建
为揭示血吸虫生长发育机理,深入研究血吸虫与宿主、血吸虫雌雄虫之间蛋白质的相互关系,本研究选取血吸虫进入终末宿主体内18天时的虫体(发育成熟初期),采用Clontech Matchmaker技术成功构建日本血吸虫的酵母双杂交cDNA文库.该文库具有基因多样性和足够大的库容量,库容量为2.5×106 pfu/mL,插入的双链cDNA片段的长度在0.25～2.0 kb之间,文库重组比率为97.9%,具有良好的代表性.该文库的构建为筛选相互作用蛋白并进一步阐明其生理意义提供了基础.
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细粒棘球蚴TGF-βⅡ型受体不同结构域酵母双杂交载体的构建和自激活鉴定
目的 构建细粒棘球蚴转化生长因子βⅡ型受体全长(EgTβRⅡ)、受体结合域(EgTβRⅡA)和激酶域(EgTβRⅡ-K)的酵母双杂交真核表达载体,检测重组融合蛋白对酵母Y2H Gold菌株的毒性作用和自激活活性. 方法 采用Trizol法提取细粒棘球绦虫总RNA,反转录合成cDNA; PCR扩增EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ基因,分别克隆入pGADT7、pGBKT7载体中,经PCR、限制性内切酶鉴定及序列测定正确后,采用PEG/LiAc法转入酵母菌,检测重组融合蛋白对酵母菌毒性和自激活活性. 结果 构建EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ的pGADT7、pGBKT7重组质粒,经双酶切和1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,得到长度为406 bp、1 023 bp和1 824 bp的目的基因片段,与预期结果一致;重组质粒转化酵母菌后形成的菌落与对照质粒pGBKT7转化菌的菌落生长状况一致,直径1.5～2.0 mm,而在SD/-Leu/X/AbA、SD/-Trp/X/AbA平板上无菌落生长. 结论 成功构建EgTβRⅡ-A、EgTβRⅡ-K和EgTβRⅡ基因的pGADT7、pGBKT7真核表达载体,其表达蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性作用和自激活活性,重组质粒载体可用于酵母双杂交系统,为鉴定EgTβRⅡ在TGF-β/Smad通路中的生物学功能奠定了理论基础.
关键词： 细粒棘球蚴 转化生长因子βⅡ型受体 酵母双杂交 -
应用酵母双杂交技术筛选与pGBKT7-CT813编码产物相互作用蛋白的研究
目的 以pGBKT7-CT813作为诱饵质粒与HeLa细胞酵母GAL4 AD融合cDNA文库进行酵母双杂交试验,以进一步探讨沙眼衣原体包涵体膜蛋白的生物学功能. 方法 根据STD基因库提供信息设计引物,用PCR法获取目的基因片段CT813,经酶切处理的CT813和pGBKT7质粒,在T4连接酶作用下连接,连接产物转入感受态细胞BL21,培养后进行菌落PCR验证,对阳性质粒进行测序分析.质粒转化入酵母菌株Y187和AH109中,检测其有无自激活及毒性作用.阳性重组酵母菌株AH109与cDNA文库菌株Y187进行配合,待三叶草(或米奇)形状合子形成后涂布于腺嘌呤、组氨酸、亮氨酸、色氨酸缺陷型培养基和铺有X-Gal的SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp平板上初筛,再经过2次筛选,收集阳性菌落.将阳性菌液点种在滤纸上,在液氮中反复冻融2次,然后浸泡在Z缓冲液-β巯基乙醇-X-Gal混合液中室温温育8h.对筛选出的显色阳性菌液进行PCR验证.选取22个PCR阳性菌液提取酵母质粒,将22个质粒再转入感受态细胞E.coli,BL-21,对阳性菌落提取质粒,进行回交试验,对验证阳性的菌落对应的质粒进行测序. 结果 成功构建了pGBKT7-CT813诱饵质粒,该质粒的表达产物对AH109和Y187均无自激活和毒性作用.将回交试验筛选的阳性菌落对应的质粒进行测序,对测序结果做BLAST检索分析,确定筛选出与pGBKT7-CT813特异性相互作用的基因可能编码的蛋白是:半乳糖凝集素-1(LGALS1)、环腺苷酸应答原件结合蛋白3(CREB3)、核糖体核糖体蛋白L10a(RPL10a)和微管蛋白37E-16(RP1-37E16). 结论 筛选出的4种蛋白可能与沙眼衣原体的致病机制相关,但仍需要进一步验证.pGBKT7-CT813编码产物与多种蛋白有相互作用,为进一步研究其生物学功能打下了基础.
关键词： pGBKT7-CT813 cDNA文库 酵母双杂交 -
细粒棘球蚴胰岛素受体(EgInsR)与人胰岛素(Huins)酵母双杂交载体的构建及自激活鉴定
目的 构建细粒棘球蚴(Eg)胰岛素受体(InsR)与人胰岛素(Huins)酵母双杂交系统,检测表达蛋白对报告基因的自激活活性及对酵母菌的毒性. 方法 从Eg cDNA中扩增EgInsR基因和Huins编码序列,分别将EgInsR基因和Huins编码序列克隆人酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中并进行限制性酶切鉴定和测序鉴定,鉴定正确的重组载体采用PEG/LiAc法转化酵母菌,检测诱饵蛋白对酵母菌生长的自激活活性和毒性. 结果 扩增的EgInsR和Huins基因编码区全长分别为1 122 bp和261 bp.构建的pGADT7-EgInsR及pGBKT7-Huins两组重组质粒转化Y2HGold酵母菌表达的蛋白对Y2HGold无毒性及自激活作用. 结论 构建的EgInsR基因和Huins基因重组载体表达蛋白对Y2HGold酵母菌无毒性和自激活作用,为研究Eg与中间宿主的交互作用机制奠定了基础.
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细粒棘球蚴14-3-3与MKK2酵母双杂交载体的构建及自激活鉴定
目的 构建细粒棘球幼(Eg)14-3-3与MKK2酵母双杂交系统,并对诱饵质粒进行自激活活性及毒性检测.方法 从Eg cDNA中扩增Eg14-3-3基因和EgMKK2编码序列,将其克隆人酵母双杂交载体pGADT7和pGBKT7中,经PCR、限制性酶切鉴定及序列测定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株,检测融合蛋白对酵母菌生长的影响和自激活活性. 结果 扩增Eg14-3-3和EgMKK2基因编码区全长分别为749 bp和1 572 bp.构建的pGBKT7-Eg14-3-3及pGADT7-EgMKK2重组质粒转化到酵母细胞Y2 HGold中,检测表达蛋白对Y2HGold无毒性及自激活作用. 结论 Eg14-3-3基因和EgMKK2编码序列表达的蛋白对酵母菌Y2 HGold无毒性和自激活作用,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.
关键词： Eg14-3-3基因 EgMKK2基因 酵母双杂交 自激活 -
利用噬菌体展示技术研究功能基因组和蛋白质-蛋白质相互作用——与酵母双杂交方法比较
近年来基因组测序工作已揭示了数以万计的新基因,但是这些基因序列的价值只有当这些数据被翻译成蛋白质功能的时候才能被了解.而蛋白质与蛋白质之间相互作用构成了细胞生化反应网络的一个主要组成部分,不仅可以从分子水平揭示蛋白质的功能,而且为我们更好地理解生命过程、疾病机制和新药开发等提供了一个很好的基础.
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筛选CD4结合蛋白的酵母双杂交饵载体构建及功能鉴定
目的构建用于筛选人CD4结合蛋白的酵母双杂交饵载体,并对其功能进行鉴定.方法RT-PCR扩增编码CD4的cDNA.构建双杂交饵载体pAS2-1-CD4,并转化入宿主酵母菌Y190中.通过测定报告基因--β-半乳糖苷酶的活性,判断饵载体自激活报告基因能力.将CD4的已知HIV配体gp120构建入猎物载体pACT2,转入重组菌Y190/pAS2-1-CD4.检测其报告基因活性,鉴定pAS2-1-CD4是否具有筛选CD4结合蛋白的能力.结果DNA序列测定证实,获得了编码CD4蛋白的cDNA序列.β-半乳糖苷酶活性测定表明,pAS2-1-CD4单独无自激活能力,与猎物载体pACT2-gp120能够发生相互作用,激活报告基因表达.结论构建了酵母双杂交饵载体pAS2-1-CD4,为筛选CD4结合蛋白(尤其是筛选病毒编码的CD4配体),提供了技术平台.
