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结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活检测
目的 构建结核杆菌ESAT-6蛋白酵母双杂交诱饵载体,并检测其自激活作用.方法 用PCR技术特异性扩增结核分枝杆菌H37Rv株的ESAT-6基因,将其克隆入酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7中,用PCR、限制性酶切鉴定及序列测定,获得质粒pGBKT7-ESAT-6.用PEG/LiAc法将其转入酵母AH109b中,经表型筛选检测其自激活作用.结果 获得了无自激活作用的诱饵载体pGBKT7-ESAT-6.结论 ESAT-6无自激活作用,可用酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子.
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鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定
为构建鸭圆环病毒Cap基因酵母双杂交诱饵载体,以本实验室分离鉴定的DuCV GH01株Cap基因为棋板,对其进行酵母密码子优化后,连接到pGBKT7载体上构建诱饵质粒,经菌落PCR、酶切鉴定以及测序后,转化酵母菌株Y2HGold感受态,检测诱饵蛋白表达以及诱饵蛋白对酵母细胞毒性和白激活现象.结果表明,优化后的Cap基因全长774 bp,成功连接到诱饵载体pGBKT7中,重组质粒pGBKT7-Cap转入酵母细胞后,Western blot检测到50kD左右的蛋白条带,诱饵蛋白对酵母细胞既无毒性,又没有自激活现象.为进一步利用酵母双杂交技术筛选与Cap蛋白互作的蛋白奠定了基础.
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HBsAg诱饵载体的构建、表达及人胰腺cDNA文库的扩增、纯化和转化
目的 构建HBsAg诱饵真核表达载体,并在AH109酵母菌中进行表达,同时扩增、纯化、鉴定及转化人胰腺cDNA文库.方法 通过PCR扩增HBsAg基因,克隆到pGEM-T载体,测序正确后酶切并连接至表达载体pGBKT7中,转化酵母菌AH109,在色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp/Kana)上筛选阳性菌落,提取重组蛋白,经SDS-PAGE电泳后进行Western blot分析.扩增、纯化人胰腺cDNA文库并进行酶切鉴定及生物信息学分析,醋酸锂法将其转入Y187酵母菌.结果 成功构建酵母表达载体pGBKT7-HBsAg、SDS-PAGE和Western blot显示重组蛋白在酵母细胞中正确表达；成功构建人胰腺cDNA文库,其容量为4×109CFU/L,插入片段大小为0.5～2.0 kb,长度不均,重组率为100％.结论 成功构建HBsAg真核载体并在AH109酵母菌中表达,同时获得高质量的胰腺cDNA文库并转化入Y187酵母菌,为通过酵母双杂交筛选与HBsAg相互作用蛋白基因奠定了基础.
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神经退行性疾病潜在致病肺炎衣原体蛋白Cpn0147酵母双杂交诱饵载体的构建
目的：构建Cpn0147酵母双杂交诱饵载体，为应用酵母双杂交系统筛选与其相互作用的蛋白奠定基础。方法：应用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）扩增技术获得Cpn0147基因片段，克隆入pGBKT7载体，鉴定构建是否成功，确定构建成功后将重组载体pGBKT7-Cpn0147转入AH109及Y187酵母中，进行诱饵载体的毒性及自激活活性分析。结果：Cpn0147诱饵载体构建成功，且该诱饵载体无自激活活性，对两种宿主酵母细胞无毒性。结论：诱饵载体pGBKT7-Cpn0147可用于酵母双杂交系统，为进一步筛选与之相互作用蛋白提供了实验基础。
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长双歧杆菌抗毒素基因mazE细菌双杂交诱饵质粒的构建与鉴定﹡
目的：构建细菌双杂交系统中的诱饵载体pBT－mazE，为长双歧杆菌的压力调控机制研究奠定基础。方法 PCR扩增抗毒素蛋白MazE的编码基因，插入到带有λcI基因的载体pBT构建诱饵质粒pBT－mazE。将pBT－mazE转化至大肠杆菌报告菌株XL－1 Blue MRF′Kan，检测诱饵蛋白mazE－λcI的表达。将pBT－mazE和pTRG空载体共转化报告菌株XL－1 Blue MRF′Kan，通过3－氨基－1，2，4－三氮唑（3－amino－1，2，4－triazole，3－AT）选择性筛选平板检测诱饵质粒的自激活作用。结果酶切和测序结果显示MazE蛋白编码序列成功克隆入载体pBT，融合区读码框正确。诱饵质粒pBT－mazE能够表达诱饵蛋白mazE－λcI。 pBT－mazE和pTRG空载体共转化的报告菌株XL－1 Blue MRF′Kan在含有3－AT的选择性筛选平板上无菌落生成，而在no 3－AT非选择性筛选平板上生长良好，表明诱饵质粒pBT－mazE在细菌双杂交系统中无自激活作用。结论所构建的诱饵载体pBT－mazE可以用于细菌双杂交的进一步实验。
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禽流感病毒NP基因的酵母双杂交饵载体表达及自激活检测
目的 构建H5N1亚型禽流感病毒NP基因的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用.方法以PCR法从pGEMT/H5NP扩增NP基因编码区序列,将其定向克隆到PGBKT7载体,经测序鉴定后,PEG/LiAc法转化酵母菌株AH109,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用同时Western blot验证诱饵蛋白的表达.结果获得NP编码区基因,并成功构建酵母双杂交系统中的诱饵载体pGBKT7-NP,对宿主细胞酵母菌株AH109无毒性和自激活作用,并能在酵母细胞中稳定表达.结论诱饵载体pGBKT7-NP可用于GAL4酵母双杂交系统钓取与禽流感病毒核蛋白相互作用的蛋白.
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杜氏盐藻环盒子1相互作用蛋白的酵母双杂交法筛选
目的:构建杜氏盐藻环盒子1(RBX1)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-RBX1,筛选与RBX1相互作用的蛋白.方法:采用PCR技术扩增杜氏盐藻RBX1的开放阅读框,测序分析后插入酵母表达质粒,构建诱饵载体pG-BKT7-RBX1.将酶切鉴定正确的诱饵载体用PEG/LiAc法分别转化到酵母菌Y187和AH109中,通过表型筛选检测RBX1对酵母菌有无自激活和毒性作用.转化诱饵质粒的Y187与文库菌AH109杂交,待三叶草形状的合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选阳性克隆并测序.结果:成功构建了pGBKT7-RBX1,它对Y187和AH109两种酵母菌既无自激活又无毒性作用.杂交后筛选得到两个阳性克隆,阳性克隆1与莱茵衣藻和拟南芥中氧化还原酶铁硫蛋白亚基的同源性为38％和39％,阳性克隆2与莱茵衣藻中转化抑制剂蛋白的同源性为57％.结论:诱饵载体pGBKT7-RBX1可用于酵母双杂交.成功筛选得到两个阳性克隆,可能是与RBX1相互作用的蛋白.
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杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测
目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用.方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHH cDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH.用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用.结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性.在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1.结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白.
关键词： S腺苷高半胱氨酸水解酶 酵母双杂交 诱饵载体 自激活 杜氏盐藻 -
用于酵母双杂交的M-CSF诱饵载体的构建和鉴定
目的构建用于酵母双杂交系统的结合域(binding domain,BD)诱饵载体pGBKT7-M-CSF, 并检测其是否具有自身激活作用.方法用PCR方法从M-CSF cDNA中扩增出M-CSF的胞外活性区, 引入酶切位点SalⅠ、 NcoⅠ, 与pGBKT7载体连接起来, 并检测pGBKT7-M-CSF在酵母双杂交系统3中的自激活作用.结果成功构建了BD诱饵载体pGBKT7-M-CSF, 并证明其在酵母双杂交系统中无自激活作用.结论 pGBKT7-M-CSF可以用于酵母双杂交系统中, 找出与M-CSF相互作用的分子.
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Survivin基因诱饵表达载体的构建和鉴定
目的 构建Survivin基因诱饵表达载体,为建立酵母双杂交系统筛选Survivin蛋白靶蛋白奠定基础.方法 从人K562细胞中提取总RNA作为模板,逆转录得到Survivin cDNA,通过特异引物扩增Survivin基因的ORF区,然后与诱饵表达载体pGBKT7连接,构建诱饵表达载体pGBKT7-Survivin,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-Survivin转化到酵母AH109细胞中,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功扩增了Survivin基因的ORF区,并成功将其克隆到诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果 正确.诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Western blot分析证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论 成功构建了Survivin基因的ORF区的酵母诱饵表达载体,为建立酵母双杂交系统筛选Survivin蛋白靶蛋白奠定基础.
关键词： Survivin基因 诱饵载体 诱饵蛋白 -
果蝇神经粘附分子Neuroligin4诱饵蛋白载体的构建
目的 构建果蝇神经粘附分子Neuroligin4诱饵蛋白载体.方法 根据Neuroligin4基因的特点,分别设计胞外段和胞内段的引物序列,通过PCR、酶切等手段将目的片段接入诱饵载体中.结果 经酶切和测序鉴定,成功构建Neuroligin4胞外端和胞内端诱饵蛋白质粒.结论 Neuroligin4诱饵载体的成功构建为研究Neuroligin4基因的功能奠定了基础.
关键词： Neuroligin4 神经粘附分子 诱饵载体 -
人HL-60细胞GRα-LBD诱饵表达载体的构建和鉴定
目的:构建糖皮质激素(Glueocorticoid,GC)受体α配体结合域(GRα-LBD)的诱饵表达载体,为小分子配体酵母三杂交系统的建立奠定基础.方法:RT-PCR扩增HL-60细胞的GR α-LBD,克隆入诱饵载体pGBKT7中,测序正确后,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GR α-LBD转化到酵母AH109细胞中,提取酵母蛋白,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果:成功扩增了GRα-LBD,并成功亚克隆到pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Westrrn blot分析也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论:成功构建了GRα-LBD酵母诱饵表达载体,为建立小分子配体酵母三杂交系统奠定了基础.
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糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建及鉴定
目的 构建糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合域的诱饵表达载体.方法 RT-PCR 扩增GR 结合域,克隆入 pMD18-T,测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7 中,再把构建好的诱饵载体 pGBKT7-GR 转化到酵母 AH109 细胞中,并用 Western blot 分析诱饵蛋白的表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功扩增了GR结合域,并分别成功克隆到 pMD18-T 和 pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母 AH109 细胞中,无毒性和自激活作用,Westem blot 分析结果也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论 成功构建了 GR 结合域的酵母诱饵表达载体.
关键词： 糖皮质激素受体结合域 诱饵载体 诱饵蛋白 -
NDRG家族成员酵母双杂交诱饵载体的构建,表达及自激活检测
目的:构建NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵载体,验证其在酵母中的表达并检测其自激活作用,为用酵母双杂交方法寻找与NDRG家族相互作用的分子奠定实验基础. 方法:用PCR方法获得NDRG家族4个成员cDNA全长,将4个片段按正确读框插入酵母表达质粒PGBKT7中,经限制性酶切鉴定正确后,PEG/LiAc法转化酵母菌株AH109,Western验证4个分子的正确表达,用表型筛选法及颜色筛选法检测其自激活作用. 结果:构建了NDRG家族4个成员的酵母双杂交诱饵载体,并在酵母中正确表达,除NDRG4-B外NDRG1,2,3均无自激活作用. 结论:NDRG1,2,3可以用酵母双杂交方法钓取与之相互作用的分子. NDRG4-B由于有自激活作用不能用于酵母双杂交的筛选.
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酵母双杂交系统筛选HBV PreS1相互作用蛋白
目的 利用Sos招募系统(SRS),构建含HBV PreS1基因的酵母双杂交诱饵载体,筛选人肝细胞与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,进一步探讨HBV侵入肝细胞的机制.方法 以HBV ayw亚型全长质粒PCP10为模板,PCR扩增HBV PreS1基因,克隆到酵母表达载体pSos中,构建诱饵质粒pSos-PreS1,将其转化cdc25酵母感受态细胞,提取酵母蛋白质进行Western blot分析,证实其在酵母细胞中的表达;将pSos-PreS1分别与pMyr Lamin C、pMyr SB共转化酵母,证实诱饵蛋白无自激活作用.将pSos-PreS1与人肝cDNA文库共转化cdc25酵母感受态细胞,通过营养及温度选择性培养筛选阳性菌落,扩增阳性菌落目的基因并测序.结果 成功构建了HBV PreS1基因酵母双杂交诱饵载体pSos-PreS1,筛选得到5个准阳性克隆,序列分析表明其分别与人类钾通道调制因子1(KCMF1)、细胞色素C、VitD结合蛋白、人源去唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)和人白蛋白具有高度同源性.结论 利用SRS筛选出5个可能与HBV PreS1蛋白相互作用的蛋白,为进一步了解HBV侵入肝细胞的机制奠定了基础.
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人DOC-2氨基端PID结构域酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活鉴定
目的:获得人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域(PID)cDNA基因,构建酵母双杂交诱饵载体,并检测对报告基因的激活作用.方法:PCR扩增含人DOC-2编码区的全长cDNA片段,克隆入诱饵载体pGBKT7,再亚克隆得到含PID结构域的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-nDOC2.将重组质粒导入酵母菌AH109,检测其表达产物在酵母细胞中对报告基因有无激活作用.结果:成功构建人DOC-2氨基端磷酸酪氨酸作用结构域(PID)酵母双杂交诱饵载体,该段基因表达的蛋白对酵母菌AH109既无毒性,对报告基因也没有激活作用.结论:我们可利用构建的酵母双杂交诱饵载体来钓取人DOC-2氨基端PID结构域的相互作用蛋白,以利于对DOC-2基因功能进行研究.
关键词： 人DOC-2基因 磷酸酪氨酸作用结构域 酵母双杂交 诱饵载体
