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维甲酸受体变异蛋白酵母双杂交诱饵载体构建
目的 构建维甲酸受体变异蛋白(RARα-V)的诱饵表达载体.为应用酵母双杂交系统筛选与RARα-V相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增RARα-V,克隆入诱饵载体pGBKT7中,将构建好的诱饵载体pG-BKT7一RARα-v转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果 成功扩增了RARα-V基因片断,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性,无自激活和渗漏,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论 成功构建了RARα-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步筛选与之相互作用的蛋白提供基础依据.
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酵母双杂交诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ的构建及自激活检测
目的 构建耐辐射球菌(Deinococcus radiodurans)R1 ppr Ⅰ蛋白的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统筛选与ppr Ⅰ相互作用的蛋白建立实验基础.方法 PCR扩增ppr Ⅰ基因片段,克隆入诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7_ppr Ⅰ转化到酵母细胞AH109中,检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果 成功扩增了ppr Ⅰ基因片段,并克隆入pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用.结论 成功构建了ppr Ⅰ的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.
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筛选和鉴定抗卵巢癌活性六肽的靶点蛋白
目的：采用 pull-down技术筛选乳源抗癌六肽( PG-PIPN)在人卵巢癌细胞株(SKOV3)上的靶点蛋白(受体)并进行鉴定。方法以 PGPIPN 的序列为参照，设计出 PG-PIPN基因，以BamH Ⅰ/Xho Ⅰ为酶切位点，将PGPIPN基因构建到表达质粒载体pGEX-4T-1中，转化到E. coli BL21中，用诱导剂异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷( IPTG)低温诱导表达的谷胱甘肽S转移酶( GST)标签融合蛋白作为诱饵蛋白；从SKOV3中提取的总蛋白作为捕获蛋白，运用 GST pull-down技术，筛选出靶点蛋白质，运用SDS-PAGE电泳进行初步鉴定，并用异硫氰酸荧光素( FITC)标记的PGPIPN孵育鉴定。结果 SDS-PAGE 电泳中有两条条带，一条为诱饵蛋白，一条为目的条带，在免疫荧光显微镜下观察到荧光PG-PIPN结合到该条带上。结论筛选和鉴定了PGPIPN作用于卵巢癌细胞上的靶蛋白，为研究其抗癌的作用机制及其信号转导通路奠定了基础。
关键词： 乳源抗癌六肽 GST pull-down 诱饵蛋白 捕获蛋白 靶点蛋白 -
人FAM92A1基因诱饵表达质粒的构建与鉴定
目的 构建人FAM92A1基因(hFAM92A1)的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1并检测其蛋白表达、毒性和自激活作用.方法 PCR扩增hFAM92A1的基因编码序列并克隆入诱饵表达载体pGBKT7中,酶切和测序鉴定后,转化到酵母AHl09细胞中,Western印迹检测诱饵蛋白表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功构建FAM92A1基因的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1,测序结果正确.Western印迹实验证实酵母细胞高表达诱饵蛋白hFAM92A1,诱饵蛋白没有自激活作用.结论 构建的诱饵表达质粒pGBKT7-hFAM92A1可用于下一步酵母双杂交系统实验,为进一步研究hFAM92A1功能奠定了基础.
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酵母双杂交系统在中枢神经系统疾病研究中的应用
酵母双杂交系统是一项检测体内蛋白-蛋白间相互作用的新技术,与其他体外方法相比,它简便、可靠、敏感性好,接近体内真实情况,并可快速获得目的蛋白的编码基因,已在中枢神经疾病尤其是感染性和变性性疾病研究中广泛应用.
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酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-UL49的构建、表达与鉴定
目的 构建人巨细胞病毒UL49基因的诱饵表达载体,以利于筛选与pUL49相互作用的蛋白.方法 PCK扩增UL49全序列,克隆入pGBKT7,将构建好的pGBKT7-UL49转化到酵母细胞AH109;用蛋白印迹法分析诱饵蛋白的表达,检测诱饵蛋白有无毒性和自激活效应.结果 克隆成功pGBKT7-UL49;pGBKT7-UL49成功转化到AH109.转化细胞AH109[pGBKT7-UL49]表达诱饵蛋白pUL49,pUL49对转化细胞无细胞毒性、无自激活.结论 成功构建了酵母诱饵表达栽体pGBKT7-UL49,为进一步筛选与pUL49相互作用的蛋白提供了实验基础.
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Survivin基因诱饵表达载体的构建和鉴定
目的 构建Survivin基因诱饵表达载体,为建立酵母双杂交系统筛选Survivin蛋白靶蛋白奠定基础.方法 从人K562细胞中提取总RNA作为模板,逆转录得到Survivin cDNA,通过特异引物扩增Survivin基因的ORF区,然后与诱饵表达载体pGBKT7连接,构建诱饵表达载体pGBKT7-Survivin,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-Survivin转化到酵母AH109细胞中,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功扩增了Survivin基因的ORF区,并成功将其克隆到诱饵表达载体pGBKT7中,测序结果 正确.诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Western blot分析证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论 成功构建了Survivin基因的ORF区的酵母诱饵表达载体,为建立酵母双杂交系统筛选Survivin蛋白靶蛋白奠定基础.
关键词： Survivin基因 诱饵载体 诱饵蛋白 -
日本脑炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体构建及鉴定
目的 构建日本脑炎病毒核心蛋白(JEV C蛋白)基因的酵母双杂交诱饵载体,并检测其蛋白表达产物对酵母细胞的毒性及对酵母细胞内报告基因的自激活效应.方法 PCR扩增JEV C蛋白cDNA全基序并克隆入载体pGBKT7的EcoR1/BamHI酶切位点之间,酶切及测序鉴定；PE G/LiAc法将构建好的诱饵质粒pGBKT7-JC及载体pGBKT7分别转化人酵母菌株Y2H Gold感受态细胞,经酵母氨基酸缺陷培养及表型筛选检测其对酵母细胞毒性及自激活作用；用Western-blotting法分析酵母菌中诱饵蛋白BD-JC的表达.结果 重组质粒pGBKT7-JC经酶切鉴定及测序结果与Genebank公布的JEV SA14-14-2株中JEV C蛋白编码基序完全一致；成功转化质粒pGBKT7-JC及空载体pGBKT7的酵母菌株Y2H Gold感受态细胞均只在SD/-Trp、SD/-Trp/X培养基上生长,二者菌落数、菌落大小、分布无明显差异且不变蓝,且SD/-Trp液体培养基30℃过夜培养测OD600值均＞0.8,在SD/-TrpPMA培养基上均不生长；经Western-blotting法检测到酵母菌能表达分子量约为35KDa的特异性融合蛋白BD-JC.结论 成功构建了酵母双杂交诱饵表达质粒pCBKT7-JC;其诱饵蛋白BD-JC对酵母细胞无细胞毒性及自激活效应,为筛选及验证与pCBKT7-JC相互作用蛋白奠定实验基础.
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人HL-60细胞GRα-LBD诱饵表达载体的构建和鉴定
目的:构建糖皮质激素(Glueocorticoid,GC)受体α配体结合域(GRα-LBD)的诱饵表达载体,为小分子配体酵母三杂交系统的建立奠定基础.方法:RT-PCR扩增HL-60细胞的GR α-LBD,克隆入诱饵载体pGBKT7中,测序正确后,再把构建好的诱饵载体pGBKT7-GR α-LBD转化到酵母AH109细胞中,提取酵母蛋白,并用Western blot分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果:成功扩增了GRα-LBD,并成功亚克隆到pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母AH109细胞中,无毒性和自激活作用,Westrrn blot分析也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论:成功构建了GRα-LBD酵母诱饵表达载体,为建立小分子配体酵母三杂交系统奠定了基础.
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酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-PML-V的构建、表达及鉴定
目的:构建早幼粒细胞白血病基因变异蛋白(Promyelocytie leukemia,PML-V)的诱饵表达载体,为应用酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid system)筛选与PML-V相互作用的蛋白建立实验基础.方法:PCR扩增PML-V,克隆人诱饵载体pGBKT7中,经测序鉴定后,将构建好的诱饵载体pGBKT7-PML-V转化到酵母细胞AH109中,并利用蛋白印迹法(Western Blotting)分析诱饵蛋白的表达情况.同时检测诱饵蛋白有无毒性、渗漏和自激活作用.结果:成功扩增了PML-V基因片断,并克隆人pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母细胞AH109中,诱饵蛋白无毒性、渗漏和自激活作用,Western Blotting分析证实酵母细胞表达诱饵蛋白.结论:成功构建了PML-V结合域的酵母诱饵表达载体,为进一步运用酵母双杂交技术筛选与之相互作用的蛋白奠定了基础.
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糖皮质激素受体结合域诱饵表达载体的构建及鉴定
目的 构建糖皮质激素受体(glucocorticoid receptor,GR)结合域的诱饵表达载体.方法 RT-PCR 扩增GR 结合域,克隆入 pMD18-T,测序正确后,再亚克隆入诱饵载体 pGBKT7 中,再把构建好的诱饵载体 pGBKT7-GR 转化到酵母 AH109 细胞中,并用 Western blot 分析诱饵蛋白的表达情况,同时检测诱饵蛋白的毒性和自激活作用.结果 成功扩增了GR结合域,并分别成功克隆到 pMD18-T 和 pGBKT7中,测序结果正确.诱饵载体成功转化到酵母 AH109 细胞中,无毒性和自激活作用,Westem blot 分析结果也证实了酵母细胞高表达诱饵蛋白.结论 成功构建了 GR 结合域的酵母诱饵表达载体.
关键词： 糖皮质激素受体结合域 诱饵载体 诱饵蛋白
