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酵母双杂交技术在病原生物蛋白质研究中的应用
酵母双杂交技术在蛋白质的研究中有着重要的、不可替代的位置.在基因组蛋白质连锁图的建立、药物及其作用位点、抗原抗体反应、细菌、病毒、寄生虫等领域的研究也有广泛的应用.随着科学技术的发展,酵母双杂交技术的不断改进和完善,其应用必将大有前景.
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丙型肝炎病毒核心蛋白酵母双杂交诱饵载体的构建及鉴定研究
目的构建含丙型肝炎病毒（ hepatitis C virus，HCV）核心（ core，C）蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体，为C蛋白与宿主蛋白相互作用机制研究奠定基础。方法聚合酶链反应（ PCR）法扩增HCV 1b基因型C蛋白基因，经EcoR I和Pst I双酶切后插入到诱饵载体pGBKT7中，构建含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-Core，经酶切分析及核酸测序分析加以鉴定。醋酸锂法将pGBKT7-Core转化入酵母菌株Y2HGold，蛋白印迹法检测C蛋白的表达，通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母细胞的毒性作用及对报告基因的激活作用。结果重组质粒pGBKT7-Core中的C蛋白基因为576 bp，经核酸测序分析与NCBI中注册的HCV 1b基因型C蛋白基因序列一致；转化酵母菌后检测到C蛋白的表达；HCV C蛋白对酵母菌Y2HGold无毒性，且对报告基因无激活作用。结论含HCV C蛋白基因的酵母双杂交诱饵载体构建成功，表达稳定。
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一组端粒相关蛋白分子的克隆
目的:进一步了解端粒酶的生物学功能及其在永生化或肿瘤细胞中作用的分子机制,筛选新的端粒相关蛋白分子.方法:基于酵母双杂交技术原理,采用DNA重组技术构建诱饵融合蛋白表达载体,筛选cDNA文库,β-半乳糖苷酶滤膜影印分析确证阳性克隆,对阳性克隆质粒测序并在GenBank进行cDNA序列同源性比较.结果: AH109、Y187酵母菌基因表型稳定,无His渗漏表达.成功构建端粒酶催化亚单位诱饵融合蛋白表达载体pGBKT7-hTERT,其表达的融合蛋白对AH109酵母细胞生长无毒性且不具有激活自身报告基因(LacZ)的作用.从cDNA文库中筛选到Ade+、Leu+、Trp+和His+阳性克隆28个,β-半乳糖苷酶菌落影印滤膜分析筛选到Ade+、His+和LacZ+阳性克隆12个,其中有5个文库质粒具有自身激活报告基因的作用,予以弃除.7个阳性克隆质粒测序发现有2个为重复序列,cDNA序列同源性比较终获得6个已收录人cDNA序列,他们分别为T-STAR、PAWR、I-1、SMARCB1、LOXL3和HKR3.结论:获取新的端粒相关蛋白可了解端粒酶全酶的结构及其在肿瘤、细胞永生化的生物学功能及分子机制,为肿瘤、衰老的发生及防治奠定重要的理论基础.
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酵母双杂交技术对人胰腺cDNA文库中HBcAg结合蛋白基因的筛选
目的: 应用酵母双杂交技术,筛选人胰腺cDNA文库中与HBV核心抗原结合的蛋白的基因.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,将其转化至酵母菌Y187;诱饵质粒pGBKT7-HbcAg转化酵母菌AH109并筛选鉴定.应用酵母双杂交系统3进行配合,在SD/-Trp/Leu-His/-Ade培养基和含X-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒并测序,对测序结果进行生物信息学分析.结果:人胰腺cDNA文库的构建以及pGBKT7-HBcAg质粒转化AH109酵母菌株均获成功,并从人胰腺cDNA文库中筛选出9个与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因.分别与以下已知的9种编码蛋白基因序列同源:人胰脂肪酶(PNLIP)、人胆盐刺激酯酶(CEL)、人胰凝乳蛋白C(CTRC)、人胰蛋白酶原、人羧肽酶B1(CPB1)、人线粒体全基因组、人胰弹性酶2A、人辅脂肪酶(CLPS)和人核糖体蛋白(RPL10A).结论:筛选出的与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因主要与胰腺外分泌功能相关,HBV感染可能通过与胰腺所分泌的糖、脂类代谢相关的酶类结合,而引发代谢性疾病.
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乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白结合蛋白的筛选
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞与乙型肝炎病毒截短型表面抗原中蛋白(MHBst)结合蛋白.方法:PCR扩增MHBst基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达.后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落增菌后提出质粒转化入大肠杆菌(DH5α),并经氨苄青霉素抗性筛选,提取单克隆菌落质粒,酶切鉴定,序列测定后进行生物信息学分析.结果:应用酵母双杂交技术筛选出阳性克隆8个,经生物信息学分析,排除读码框架不正确者,后得到7种已知基因,分别为ADP核糖基因子2种,RAB6相互作用蛋白(RAB6IP1)1种,CCR4-NOT转录复合体亚基10(CCR4-NOT-10)1种,脂多糖蛋白结合蛋白(LBP)1种,醛缩酶B(ALDOB)1种,补体成分3(C3)1种,丙酮酸脱氢酶(PDH)1种.结论:成功克隆出MHBst结合蛋白.
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酵母双杂交技术筛选HBcAg肝细胞结合蛋白基因
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中含金属硫蛋白A2基因的菌落有2个、未知基因4个、补体8 α基因1个、NAD(P)H脱氢酶亚基1个、维甲酸受体应答元件2基因1个、细胞色素c氧化酶基因1个、细胞色素b基因1个、DAZ相关蛋白2基因2个、线粒体核蛋白L41基因2个、人血白蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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酵母双杂交法对HBV表面抗原主蛋白候选结合蛋白的筛选
目的:自肝细胞cDNA文库中筛选与HBV主蛋白(SHBs)相互作用的蛋白基因,探讨主蛋白的生物学功能.方法:利用PCR扩增S主蛋白基因,定向克隆技术将靶基因克隆到pDEST32构建出S主蛋白的诱饵质粒:Western blot方法验证转化诱饵质粒的酵母细胞表达SHBs:将诱饵质粒与人肝cDNA文库猎物质粒共同转化MaV203酵母细胞,在营养缺陷型培养基和X-gal上进行三重筛选阳性菌落,提取阳性酵母茵落的猎物质粒进行DNA测序;利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.结果:构建S主蛋白及肝文库酵母细胞表达载体,进行酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,筛选出既能在缺陷培养基也能在X-gal的检测下变成蓝色的真阳性菌落3个,分别为核糖体蛋白L3、微管蛋白α-1a和α-2巨球蛋白.结论:用酵母双杂交技术筛选出3个与SHBs相互作用的肝细胞结合蛋白编码基因,提示SHBs可能参与到肝细胞内部的多种生物学反应.
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酵母双杂交技术筛选HCV E1蛋白结合的肝细胞蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与HCV E1蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV E1基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:获得了19个与E1蛋白特异性结合的阳性克隆,其中16个克隆为已知蛋白基因和3个克隆为未知功能蛋白基因.结论:成功克隆出与丙型肝炎病毒E1蛋白结合的肝细胞蛋白,为进一步研究HCV E1在HCV致病中的作用提供了新线索.
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HBV核心蛋白结合蛋白1编码基因C1的克隆化
目的:对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白l的基因C1进行克隆化研究.方法:对应用酵母双杂交技术筛选的白细胞中与HBV核心蛋白结合的新蛋白基因,利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因的编码序列,根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为C1,在GenBank中注册,注册号为AY555145.结果:C1基因编码区为366个核苷酸(nt),编码产物由121个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,表明我们克隆的C1基因属于未知功能新基因.结论:成功克隆了HBV核心蛋白结合蛋白新基因C1.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV核心蛋白编码基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV核心蛋白编码基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落17个,其中肿瘤高甲基化1基因3个,编码线粒体蛋白的DNA聚合酶γ基因1个,乙酰辅酶A合成酶3基因1个,假定翻译起始因子基因1个,趋化因子受体5基因1个,线粒体核糖体蛋白L41基因1个,Kyot结合蛋白基因1个,Ran结合蛋白基因1个,真核细胞翻译延伸因子2基因2个,未知基因5个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒核心蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBV核心蛋白在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP6蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV NS3TP6蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个,其中3个人类白细胞CDl4抗原,1个人类免疫球蛋白入轻链,3个人类推定蛋白基因(ACl24014,AC097504,AC023785).结论:成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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乙型肝炎病毒蛋白结合蛋白的研究
0 引言随着基因组测序工作的完成,后面就是研究基因的功能,其中基因表达蛋白质的功能的研究尤为重要,因为基因是通过蛋白质起作用的.蛋白质与蛋白质之间的相互作用揭示了蛋白质功能的物理基础之一,即蛋白质起作用是通过与另一蛋白质进行物理接触而完成.大家知道乙型肝炎病毒(HBV),对人体有着广泛的作用,如引起人免疫紊乱、慢性肝炎、肝硬化、肝肿瘤发生,治疗效果不佳[1-9 ],但是他们是如何作用的目前不是太清楚,但是可以肯定其中具有蛋白质-蛋白质之间的相互作用.1990年代以来一系列遗传、生化方法特别是酵母双杂交技术等进展,为研究HBV与人体蛋白质之间的相互作用打下了基础.HBV有四个结构蛋白开放读码框架,S、C、P、X编码前-S1、前-S2、HBsAg、HBcAg、HBeAg、病毒多聚酶、和HBxAg,其中HBxAg作用复杂有反式激活作用[10].但是其结构中没有DNA结合域,推测可能和蛋白质之间的相互作用有关,研究比较多.其次是前-S1等.目前鉴定的与HBV相互作用的蛋白质有十几种
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酵母双杂交技术筛选鉴定乙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白新基因C-12的研究
目的:乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白(HBcAg)在HBV感染的肝细胞中可同时存在于细胞核和胞质中,对于病毒前基因组RNA装配入核壳体是必须的,HBcAg还是HBV介导体液免疫反应和CD4+T细胞免疫反应的重要抗原,寻找人肝细胞cDNA文库中与HBcAg相互作用蛋白的基因,是研究HBcAg生物学功能的重要途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBcAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-d-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,PCR从中扩增出目的片段并测序,进行生物信息学分析.根据Genbank的信息设计新基因的引物,从HepG2细胞的mRNA中逆转录PCR扩增出C-12#新基因的完整序列,连入另一酵母表达载体pGADT7,并转化进酵母细胞Y187,再次与转化了诱饵质粒的酵母细胞AH109配合(回交),以进一步证实HBcAg与C-12#新基因编码蛋白的结合作用.结果:成功克隆出HBcAg基因并在酵母细胞中的表达,配合后选出既能在四缺(SD/Trp-Leu-His-Ade)培养基又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落16个,其中未知基因4个.用自行设计的引物成功地从HepG2细胞的mRNA中扩增出C-12#新基因的完整序列,回交实验证实二者之间的结合作用.结论:成功克隆出HBcAg的肝细胞结合蛋白,发现未知功能基因,为进一步研究HBcAg在病毒装配、损害肝细胞、感染致病等方面的具体作用提供了新线索.
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应用酵母双杂交技术筛选肝细胞cDNA文库中乙型肝炎病毒前-X蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选肝细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)前-X蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBV基因组中的前-X基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBV的前-X基因,构建表达载体并在酵母细胞中表达,配合后选出在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四重缺陷培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落19个,其中5个是人铁蛋白;1个是人的胰岛素样生长因子结合蛋白3(IGFBP3);1个是人醛缩酶B;1个是人糖基化磷脂酰肌醇锚定结合因子1(GPAAl);1个是人血红素结合蛋白;1个是人C1酯酶抑制子(C1-INH);1个是人玻连蛋白;1个是人电压依赖性阴离子通道1(VDACl);1个是丝氨酸穿膜蛋白酶(hepsin);1个是人梭素;1个是人纤溶酶原(PLG);3个是人假想蛋白;1个是RP11-542M13克隆,位于染色体16.结论:成功克隆出前-X的结合蛋白,为进一步研究HBV的前-X蛋白的作用提供了新线索.
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酵母双杂交技术筛选人白细胞中与乙型肝炎病毒X蛋白结合蛋白基因
目的:筛选并克隆人白细胞中与乙型肝炎病毒(HBV)X蛋白(HBxAg)相互作用蛋白的基因,进一步探讨HBxAg的生物学功能.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HBxAg基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人淋cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HBxAg基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-gal的四缺培养基上均能生长,并变成蓝色的真阳性菌落50个,其中含真核翻译延伸因子2基因20个,真核翻译延伸因子1基因1个,真核翻译起始因子3基因2个,急性髓样白血病MTG8蛋白基因2个,髓样关联分化蛋白基因1个,髓样分化主反应蛋白基因1个,皮肤T细胞淋巴瘤肿瘤抗原基因1个,大组织相容性复合物Ib抗原基因3个,白细胞抗原CD37基因1个,慢性白细胞性白血病相关抗原基因1个,α白细胞整联蛋白基因1个,生长停止和DNA损伤诱导因子34基因1个,转录变异因子1基因2个,蛋白磷酸酶1调控抑制因子15A基因1个,单核细胞系胞苷脱氨酶基因1个,巨噬细胞钙离子依赖型凝集素2基因1个,KIAA1949蛋白基因3个,尿激酶型血浆素原激活剂基因1个,GDP分解抑制因子基因3个,软骨素4磺基转移酶基因1个,锌指蛋白1A亚目基因1个和未知蛋白基因1个.结论:成功克隆出乙型肝炎病毒X蛋白的结合蛋白,为进一步研究HBxAg的生物学作用提供了新的线索.
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应用酵母双杂交技术筛选白细胞cDNA文库与NS5ATP1结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与NSA5TP1结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP1基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提出质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP1基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基及铺有X-α-半乳(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落10个,其中2个人HLA-B27;2个人亚砷酸盐转移子(arsA);1个人单倍型E22i线粒体;1个人pyrin(MEFV);1个人肌动蛋白素1(cofilin 1);1个人染色体15;1个来自RP11-353N14克隆人的DNA基因,位于染色体17;1个新基因.结论:成功克隆出NS5ATP1的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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噬菌体表面展示技术筛选HCBP6人源单链可变区抗体
目的:制备丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)的特异性人源化单链可变区抗体(scFv).方法:采用噬菌体表面展示技术,将生物合成的应用酵母双杂交技术筛选得到的HCV核心蛋白的肝细胞结合蛋白6(HCBP6)16肽固相包被于Nunc板,从噬菌体单链可变区抗体库中经过5轮"黏附-洗脱-扩增"筛选过程,随机挑选出48个克隆,利用酶联免疫黏附法(ELISA)、交叉反应和竞争抑制实验,对其进行免疫学检测,获得与HCBP6结合活性较强的单链可变区抗体片段的阳性克隆,并对HCBP6特异性scFv的编码序列进行序列测定分析.结果:对噬菌体单链可变区抗体库经过5轮"黏附-洗脱-扩增"的筛选后,结合到包被平皿的噬菌体与第一轮相比,富集了162倍.用酶联免疫黏附法测定第5轮筛选后上清液中含有的噬菌体抗体与HCBP6结合活性.其中有30株克隆ELISA的吸光度(A450 nm)值较高(P8 nm 0.77,P240.714,P26 0.728,P29 0.723,P38 0.803,P39 0.762,P43 0.747等).对这些噬菌体抗体进行与牛血清白蛋白(BSA)的交叉反应后,确定其中有7株交叉反应较弱(P80.145,P24 0.119,P26 0.17,P29 0.186,P38 0.118,P39 0.138,P43 0.178),结合2次ELISA重复实验的A值及竞争抑制实验结果,后确定1株(P24)阳性克隆.提取质粒,SfiI/NotI双酶切后,将片段亚克隆到pCANTAB5E载体,进行DNA序列测定,DNA大小为771 bp,符合人源化单链可变区抗体典型的骨架区(FR)及互补决定区(CDR)的序列结构.结论:用噬菌体抗体库技术能够成功地获得HCBP6的scFv.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合蛋白6基因转染肝癌细胞的基因表达谱芯片分析
目的:筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白的肝细胞结合蛋白基因,并对新基因转染肝癌细胞的基因表达谱进行分析,探索该基因表达对肝细胞基因表达的调节机制.方法:应用酵母双杂交技术,以HCV的核心蛋白作为"诱饵(bait)",筛选鉴定与其结合的肝细胞中蛋白的编码基因.应用生物信息学(bioinformatics)技术,分析其中筛选得到的人HCV核心蛋白结合蛋白6(HCBP6)基因的全长编码序列,并构建HCBP6基因的真核表达载体pcDNA3.1(-)-HCBP6.应用基因表达谱芯片技术对重组表达质粒pcDNA3.1(-)-HCBP6转染的HepG2细胞和空载体处理的相同细胞差异表达的mRNA进行检测.结果:通过酵母双杂交技术的筛选和鉴定,结合生物信息学分析,确定人的HCBP6基因由456 nt组成,编码152aa的蛋白.基因表达谱芯片所检测的1 152条目的基因均为GenBank中登录的基因,HCBP6表达质粒转染的细胞有20条差异表达基因,其中13条基因表达增强,7条基因表达降低.这些差异表达的基因与细胞信号转导、增生、分化及生长调节密切相关.结论:酵母双杂交技术结合生物信息学技术,是克隆蛋白结合蛋白的有效方法,基因表达谱芯片技术对于初步全面探索新基因的功能提供重要的资料.本实验结果为进一步阐明HCV核心蛋白与Hcbp6相互作用后的肝细胞生物大分子变化提供了理论依据.
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应用酵母双杂交技术筛选人白细胞中与NS5ATP9蛋白结合蛋白的编码基因
目的:我们在以往的研究中,应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选得到了丙型肝炎病毒非结构蛋白5A反式激活蛋白9(NS5ATP9),NS5ATP9是一种未知功能新基因.为了进一步研究NS5ATP9的生物学功能,应用酵母双杂交技术,筛选并克隆人白细胞中与NS5ATP9蛋白相互作用蛋白的基因,进一步阐明NS5ATP9的生物学功能及其作用途径.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS5ATP9基因,连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS5ATP9基因并在酵母细胞中表达,配合后选出既能在四重缺陷(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基上生长,又能在铺有X-α-gal的四缺培养基上变蓝的真阳性菌落46个,其中含人类免疫球蛋白轻链13个,核小体表面蛋白10个,铁蛋白重链2个,人类重组免疫球蛋白λ轻链11个,14-3-3家族蛋白1个,脑膜炎球菌PorA蛋白1个,RNA多聚酶Ⅲ 3个,烟草有丝分裂原激活蛋白激酶1个,细胞色素P450Ⅱ2个,SLIT2蛋白1个,DNA依赖蛋白激酶催化亚基1个.结论:成功克隆出丙型肝炎病毒NS5ATP9蛋白的结合蛋白,为进一步研究NS5ATP9的生物学作用提供了新的线索.
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酵母双杂交技术筛选白细胞中HCV NS3蛋白结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)NS3蛋白结合蛋白的编码基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增NS3基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提出质粒,转化入大肠杆菌(DH5α),提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出NS3基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和在铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落18个,其中4个真核细胞翻译延伸因子2;2个免疫球蛋白λ轻链;1个肌动蛋白β;1个铁蛋白轻多肽;1个(丝裂原)活化蛋白激酶3;2个肌球蛋白因子1;1个白介素2受体β;1个富含精氨酸/丝氨酸剪切因子6;1个组织蛋白酶S;1个2'-5'寡腺甘酸合成酶类似物;1个缺失精子缺乏相关蛋白2;1个CNN2;1个新基因.结论:成功克隆出HCV NS3的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
