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9-顺-维甲酸对人肺腺癌细胞株细胞分化和凋亡的影响
维甲酸类化合物(Retinoids)在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用[1].其在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸(ATRA)、13-顺维甲酸(13-cis-RA)和9-顺维甲酸(9-cis-RA),它们可通过核维甲酸受体(RAR)结合于DNA应答元件调节靶基因的转录;其中9-cis-RA除生物学活性较强外,尚能与维甲酸X受体(RXR)结合.实验已证明,维甲酸类化合物能有效地抑制多种肿瘤细胞的生长并促进其分化[1].在动物模型上的研究表明9-cis-RA在治疗耐药性及播散性肿瘤方面比全反式维甲酸具有更大的潜力.本实验观察了不同浓度的9-cis-RA对人肺腺癌细胞生长、细胞形态、细胞周期和凋亡的影响,为临床利用维甲酸治疗恶性肿瘤提供实验依据.
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肺癌小RNA即时定量逆转录聚合酶链反应分析中内参照的选择
小RNA(microRNA,miRNA)是一类体积微小的内源性非编码RNA,可其通过翻译后水平调节靶基因的表达.miRNA在肺脏的发育过程中发挥多种作用,其异常表达很可能是肺癌发生的原因之一,且在肺癌的发生与发展过程中呈不同的表达水平,可作为新型的临床生物标志物用于肺癌的诊断、预后评估及指导治疗方案的选择等[1-3].即时定量逆转录聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-PCR,RT-qPCR)技术目前已广泛应用于miRNA的表达分析[1-2].
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酵母双杂交筛选白细胞中新基因NS3TP6结合蛋白基因
目的:用酵母双杂交技术筛选白细胞中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白3(NS3)反式调节靶基因编码产物NS3TP6蛋白结合蛋白的基因.方法:用多聚酶链反应(PCR)法扩增HCV NS3TP6蛋白基因,连接入酵母表达载体pGBKT-7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AHl09并在其内表达,然后与转化了人白细胞文库质粒的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基上进行双重筛选阳性菌落,增菌后提取质粒,转化入大肠杆菌,提取质粒并测序,进行生物信息学分析.结果:成功克隆出HCV NS3TP6蛋白基因并在酵母细胞中表达,配合后选出在四缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基和铺有X-α-半乳糖(X-α-gal)的四缺培养基上均能生长并变成蓝色的真阳性菌落共7个,其中3个人类白细胞CDl4抗原,1个人类免疫球蛋白入轻链,3个人类推定蛋白基因(ACl24014,AC097504,AC023785).结论:成功克隆出NS3TP6蛋白的结合蛋白,为进一步研究HCV的作用提供了新线索.
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乙型肝炎病毒和丙型肝炎病毒反式调节靶基因的抑制性消减杂交和基因芯片分析结果的比较
目的:筛选与克隆HBV和HCV蛋白反式调节靶基因,阐明HBV和HCV感染后慢性肝脏疾病的发病机制.方法:应用抑制性消减杂交(SSH)技术及表达谱基因芯片(cDNA microarray)技术筛选并克隆HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因.以HBV和HCV蛋白的表达质粒转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,制备转染后的细胞裂解液,提取mRNA并逆转录为cDNA,经RsaI酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行2次消减杂交及2次抑制性聚合酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.同时进行表达谱基因芯片技术分析.结果:成功构建人HBV和HCV蛋白反式调节基因差异表达的cDNA消减文库,对HBV和HCV蛋白反式调节的靶基因同时进行基因表达谱芯片的分析.在SSH分析中,文库扩增后均得到200-800 bp插入片段.对插入片段测序,并通过生物信息学分析获得其全长基因序列.对于不同的肝炎病毒蛋白反式调节的靶基因类型,以及不同的分析技术研究的结果进行比较分析,发现了一系列的共同调节的靶基因,说明不同的肝炎病毒蛋白反式调节具有共同的作用途径.结论:筛选到的反式调节靶基因,包括一些与细胞生长调节、信号转导、肿瘤免疫发生及细胞凋亡密切相关的蛋白编码基因,推测了HBv和HCV蛋白可能存在的调控机制,有助于阐明HBV和HCV蛋白的反式调节在慢性肝脏疾病的发生发展中的作用.
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基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3反式调节靶基因
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3)是由HCV基因组编码的具有多种功能的蛋白质.NS3蛋白的表达对于HCV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究NS3蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-NS3分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染hepG2细胞之后有NS3蛋白的表达,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有34个基因表达水平显著上调,37个基因表达水平显著下调.结论:HCV的NS3蛋白是一种反式激活因子.NS3基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.
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应用抑制性消减杂交技术筛选双环醇调节靶基因
目的:应用抑制性消减杂交(suppression subtractive hybrid-ization,SSH)技术构建双环醇处理的人肝癌细胞系HepG2差异表达基因的cDNA消减文库,筛选并克隆双环醇调节相关基因,阐明双环醇对肝细胞调节作用的分子生物学机制.方法:以双环醇处理HepG2细胞,同时以二甲基硫氧化物(DMSO)处理的相同细胞系作为对照;24 h后制备细胞裂解液,提取muRNA并逆转录为cDNA,经RsaⅠ酶切后,将实验组cDNA分成两组,分别与两种不同的接头衔接,再与对照组cDNA进行两次消减杂交及两次抑制性多聚酶链反应(PCR),将产物与T/A载体连接,构建cDNA消减文库,并转染大肠杆菌进行文库扩增,随机挑选克隆PCR扩增后进行测序及同源性分析.结果:成功构建双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.文库扩增后得到46个白色克隆,进行菌落PCR分析,均得到2 0-1 000bp插入片段.挑取含有插入片段的30个克隆进行测序,并通过生物信息学分析获得14种已知基因序列.结论:应用SSH技术成功构建了双环醇处理HepG2细胞差异表达基因的cDNA消减文库.该文库的建立为进一步阐明双环醇在体内的调节机制提供依据.
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miR-155与胰腺癌关系研究进展
MicroRNAs(miRNAs)是一类由18~24个核苷酸构成的单链RNA,属于非编码蛋白RNA.目前认为,miRNA通过与靶基因mRNA的3'端非编码区(3'-untranslational region,UTR)结合,抑制mRNA的转录,从而调节靶基因的功能[1].
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肝细胞核因子-1β基因与MODY5
肝细胞核因子-1β(HNF-1β)又名变异型肝细胞核因子-1(VHNF-1)或肝细胞因子-B3(LFB3),是一种核蛋白.作为转录因子,HNF-1β能识别启动子、启动子近侧元件和增强子等顺式元件中的特异靶序列并与之结合,对靶基因的转录起到激活或阻遏的作用;也可与其它转录因子相互作用,协同调节靶基因的终活性状态.近来发现HNF-1β基因(TCF2)突变与青少年起病的成年型糖尿病(maturity-onset diabetes of the young, MODY)伴肾脏畸形有关,现就此作一介绍.
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miRNA-30在肿瘤细胞中的作用
microRNA( miRNAs)是一种长度约为22核苷酸的非编码的单链小RNA,由内源基因编码,主要功能是负性调节靶基因的表达。从1993年Lee和Ambros[1]在C.elegans中发现lin-4以来,至今发现的miRNAs已经超过1000种。成熟的miRNAs分子的形成过程包含若干个步骤:miRNAs基因通过RNA 聚合酶Ⅱ转录合成原始 microRNA ( pri-microRNA),pri-microRNA具有5’端的帽子、3’端的polyA尾的结构;pri-microRNA 经过两次酶的剪切产生成熟的miRNAs。动物 pri-microRNA第一次剪切在细胞核内,经Dorsha酶剪切产生大小约70个核苷酸并形成茎环结构的microRNA前体( pre-microRNA);pre-microRNA通过Ran-GTP依赖性核浆转运子Exportin5从核内转移至细胞质中。在细胞质中,Dicer酶将pre-microRNA剪切形成一个不完全配对的双链RNA片段即microRNA和microRNA*双体,其中一条形成成熟的21~23个核苷酸长度的microRNA分子,另一条则可能迅速降解。成熟的microRNA形成RNA诱导复合体(RNA-induced silencing complex,RISC),从而引起靶基因mRNA降解或翻译抑制。 miRNA与靶基因的mRNA 3’端非翻译区(3’-UTR)完全或部分结合,使得mRNA降解或抑制翻译产物的生成,从而参与调控个体发育、细胞凋亡、增殖及分化。目前报道的miRNAs 靶基因大约有5300个。一个miRNA可以与多个mRNA结合,而一个mRNA可以同时被多个miRNAs 调节,据统计约30%的基因受到 miRNA 的调节。
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雄激素在心血管疾病中作用的相关信号通路
雄激素作为男性重要的类固醇激素,对心血管疾病的病理生理过程有重要的意义,其作用多通过雄激素受体(androgen receptor,AR)起作用.既往关于雄激素对心血管疾病作用机制的研究主要集中于雄激素与AR结合后作为转录因子参与核内基因的转录过程,调节靶基因的表达,即雄激素的基因作用[1].近年来大量研究发现,雄激素还可以通过非基因作用影响细胞的生长、分化、增殖、凋亡,进而参与心血管疾病的调节[2].本文主要就雄激素作用对心血管系统的基因作用和非基因作用可能涉及的信号转导通路做一综述.
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微小RNA表达在糖尿病视网膜病变中的作用研究进展
微小RNA(microRNA)是一类进化中高度保守基因编码的内源性小分子RNA ,长度小于30个碱基。它可通过与靶基因的3'端结合,或直接与靶基因结合,或通过碱基互补配对抑制mRNA,在转录后水平调控目的基因的表达。 microRNA 调节靶基因mRNA主要通过降解或直接结合抑制其翻译。数据显示,人类基因组编码的microRNA估计有1100多种,它们可调节哺乳动物约60%的蛋白质编码[1]。自1993年microRNA 被首次从线虫发现,关于它的研究日益广泛深入,被证明在细胞的生长分化、增殖凋亡、生物的发育及物质代谢等方面均发挥作用。microRNA作为一个生物学标志物,是可以衡量的客观指标,可以反映特定疾病状态的发生和发展,并可以被有效测量。它在糖尿病诱导的视网膜病变动物模型中能够被有效监测,更准确地反映疾病病理状态的变化,这对于糖尿病视网膜病变的诊断、治疗及判断预后具有重要的意义。现就其在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用进行综述。
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微小RNA对血细胞分化及功能调控的研究进展
微小RNA(miRNA或miR)是近几年发现的一类长度约22个核苷酸的内源性非编码RNA,通过与靶mRNA互补结合,在转录后水平调节靶基因的表达,是细胞内基因表达的调控机制之一.迄今为止,已在哺乳动物细胞中鉴定出800多种miRNA.
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过氧化物酶体增生物激活受体的特性及其在多种疾病中的作用
过氧化物酶体增生物激活受体(peroxisome proliferatoractivated receptors,PPARs)是一种配体活化的转录因子,有3种类型.配体与之结合后调节靶基因的转录,调控多种细胞功能和病理生理过程.
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PPARγ在滋养细胞疾病中的表达及意义
过氧化物酶体增殖物激活型受体γ(PPARγ)属于核内激素类受体家族,是配体激活的转录因子,它能够结合位于靶基因增强子中的过氧化物酶体增殖反应元件,调节靶基因的转录,从而在细胞分化、肿瘤侵袭、转移中发挥重要作用.常见的妊娠滋养细胞疾病(GTD),包括葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒毛膜上皮癌,它们大的不同之处在于侵袭性存在明显差异.本研究应用免疫组织化学方法检测PPARγ蛋白在正常早孕绒毛、葡萄胎、侵蚀性葡萄胎和绒毛膜上皮癌组织中的定位和表达变化,探讨PPARγ与GTD的关系.
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法尼酯衍生物X受体与肝纤维化
法尼酯衍生物X受体(FXR)是一种在肝肠系统等组织器官表达的胆汁酸受体,属于激素核受体超家族的一员,在胆汁酸代谢及胆固醇代谢中发挥重要作用.当FXR配体与FXR羧基末端配体结合区(LBD)直接结合后,核受体空间构象发生改变并与视黄醛衍生物受体(RXR)形成异源二聚体,后与靶基因特定FXR DNA反应元件结合从而调节靶基因的转录.初级胆汁酸鹅脱氧胆酸是FXR有效的配体,次级胆汁酸石胆酸和脱氧胆酸也可以激活FXR.目前还有合成FXR配体(如6-ECDCA、GW4064等),其与FXR结合力比天然配体强数倍.FXR的主要靶基因包括胆盐输出泵(BSEP)、小异源二聚体伴侣受体(SHP)等,FXR通过和这些基因启动子上的FXR反应元件(FXRE)结合从而调控这些基因的表达.但如胆固醇7α羟化酶(CYP7α1)等主要FXR调控基因的启动子序列中没有典型FXR结合反应序列,FXR则是间接通过诱导转录抑制因子SHP表达,然后SHP与CYP7α1启动子肝受体同源物1(LRH-1)形成抑制性复合物,从而阻断CYP7α1和其它LRH-1靶基因转录.由于FXR在胆汁酸及胆固醇代谢中的重要作用,这将使其和肝脏相关疾病关系日益受到关注[1,2].
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Smads家族在肝纤维化中的作用
转化生长因子β(TGF-β)及其下游信号传导通路是目前国际上信号传导研究的一个热点.从正常和转化的细胞中分泌的TGF-β以前体的形式存在,需经过活化才有生物学活性,活化的TGF-β直接结合转化生长因子受体Ⅱ(TBRII),或通过B-多聚糖间接结合TBRII,从而形成TGF-β/TBRII复合物并迅速导致转化生长因子受体Ⅰ(TBRI)的磷酸化,磷酸化的TBRI可以活化受体特异性Smad(Smad2或Smad3)使其磷酸化,并与通用型Smad(Smad4)结合形成异源复合物,转位到核内,调节靶基因的转录.
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Wnt信号通路与神经母细胞瘤关系的研究进展
Wnt蛋白是一类广泛存在的分泌型蛋白生长因子,以旁分泌的形式与细胞膜上的受体相结合,激活靶细胞内不同的信号级联放大系统,调节靶基因的表达.其在胚胎的发育过程中对细胞的增殖、分化、迁移、极性化和凋亡均起到重要的作用[1,2].同时Wnt信号通路成分的异常与肿瘤的发生存在相关性,Wnt信号级联放大反应在肿瘤的发展和失控性方面起着决定性的作用,故近几年来大量研究开始重视在胚胎形成、生长发育及肿瘤发生发展过程中Wnt信号转导通路的作用[1,3].
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MicroRNAs在p53信号通路中的调节作用
MicroRNAs(miRNAs)是一类内源性的具有调控功能的非编码小RNAs,其大小为20~25个核苷酸.编码miRNAs的基因是一类进化上高度保守的基因家族,各种属间具有很高的保守性.根据生物信息学研究预测,大约30%的人类蛋白编码基因直接受到miRNAs的调控[1].目前已发现了1 000多种人类miRNAs,它们参与调节大约92%的人类基因,被认为是重要的调节分子之一.p53作为重要的抑癌基因,其在恶性肿瘤的发生和发展过程中起着关键性的作用.p53信号通路包含上百种基因和基因产物.当DNA损伤时,p53蛋白表达量增加,进而调节靶基因,以发挥阻滞细胞周期、促进细胞凋亡、维持基因组稳定和抑制肿瘤血管生成等作用[2].近年来的研究表明,p53与miRNAs具有紧密联系.一方面,p53可以调节miRNAs的转录;另一方面,miRNAs也可以直接抑制p53或p53上下游基因的表达.miRNAs调控p53的系列研究揭示了一批新的受p53调节的基因.大量研究资料表明,p53信号通路的众多基因已成为miRNAs的重要调节靶点.
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RNA结合蛋白HuR的研究进展
RNA结合蛋白HuR 是胚胎致死异常视觉(ELAV)基因家族中的成员,又被称为类胚胎致死性异常视觉基因1(ELAV1).ELAV家族目前已鉴定的成员包括HuR、HuB、HuC与HuD 4种,它们在细胞中主要通过基因的转录后调控机制来调节靶基因的表达,其中HuR基因在机体各组织中广泛表达,而后三者仅在神经系统中表达[1].HuR是一种在机体各组织中广泛表达的重要RNA结合蛋白,其通过调控靶mRNA的稳定性和(或)翻译效率来影响靶基因在细胞中的表达水平,从而参与细胞生命活动的调控.近年来的研究揭示:HuR蛋白是细胞分裂、细胞衰老、免疫细胞激活及肌肉分化等生命活动的重要调控因子,其功能异常与炎症、肿瘤等疾病的发生发展密切相关.
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微小RNA与内分泌肿瘤
微小RNA(microRNA,miRNA)是一种能够调节蛋白质编码基因的非编码RNA.成熟的miRNA长度约22个核苷酸,在动植物中均有表达,通过与靶mRNA的3′非翻译区(3′-untranslated region)互补结合,降解靶mRNA或抑制其翻译,在转录后水平调节靶基因的表达,从而参与调控细胞生长、干细胞分化、发育时序、信号转导等重要的生物学过程,许多人类肿瘤的发生、发展和预后都与miRNA的异常缺失、突变或过表达密切相关.现将miRNA与内分泌肿瘤的新研究进展综述如下.