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酵母双杂交系统的研究进展与应用
酵母双杂交系统作为发现和研究在活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,在近几年来得到了广泛运用.酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的,研究活细胞内蛋白质相互作用,对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物敏感地检测得到,它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术.大量的研究文献表明,酵母双杂交系统既可以用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用,也可以用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用.因此,它在许多的研究领域中有着广泛的应用.本文就酵母双杂交的技术平台和应用加以介绍.
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治疗性人源抗狂犬病毒抗体研究进展
狂犬病是由狂犬病毒(rabies virus,RV)引起的人兽共患疾病,发病后死亡率几乎达百分之百.狂犬病毒属弹状病毒科(Rhabdoviridae)狂犬病毒属(Lyssavirus),基因组编码五种结构蛋白,其中由G基因编码的糖蛋白,是病毒与宿主细胞结合的配体,能诱导机体产生中和抗体,与病毒的毒力、致病性密切相关.
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SARS-CoV E蛋白基因的扩增及原核表达载体的构建
加拿大英属哥伦比亚癌症研究所基因组科学中心已完成了SARS冠状病毒的全基因组测序(基因库登录号:AY274119).SARS-CoV基因组编码包括S蛋白、M蛋白、N蛋白和E蛋白等结构蛋白质.E蛋白是小的结构蛋白(为糖蛋白),散布于SARS病毒的包膜,疏水性强,其核苷酸序列为231bp,编码76个氨基酸,其等电点为6.01,相对分子质量为8.361×103.推测E蛋白的作用有利于病毒形状的形成,在病毒颗粒形成过程中起主要作用.本文利用已公布的SARS-CoV基因组序列,克隆了E蛋白基因,以期为深入研究E蛋白的生物学功能和药物或疫苗开发提供研究基础.
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蛋白质芯片及其在临床医学中的研究进展
人类基因组计划的测序完成后,另一个更加艰巨的任务就是确定基因组编码的所有蛋白质结构和生物学功能.由于蛋白表达水平未完全与mRNA表达水平相一致,得到表达的蛋白要经过翻译后修饰,因此仅用基因芯片研究基因功能是不全面的.虽然,传统生物化学方法在单个蛋白功能研究方面功不可没,但不适用于细胞、组织、微生物中每个蛋白的研究,更不能满足全基因组范围内大规模检测分析的要求.于是,作为一种高通量、高灵敏度、高特异性且微型化的蛋白质分析技术,蛋白质芯片在众多蛋白质测定方法中脱颖而出.
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蛋白质组学在某些癌症早期检测中的研究进展
寻找理想的表型生物标记物,阐明疾病发生发展过程中起关键作用的蛋白质分子,以用于癌症的早期检测诊断及预后评估一直是癌症研究领域的热点和难点.由于癌症的演变是多阶段、多因素、多基因参与的复杂病理过程,早期又缺乏用于筛查分离关键分子的有效技术手段,致使癌症检测标记物的发展一直比较迟缓.近几年蛋白质组学的起步和发展为癌症早期检测研究注入活力.蛋白质组(Proteome)指细胞或组织基因组编码的全部蛋白质[1].
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痘病毒免疫调节策略
面对宿主各种非特异性和特异性免疫,病毒成功侵入宿主并产生感染性后代,须具有逃避、阻塞,甚至破坏宿主抗病毒免疫反应的能力.痘病毒凭借其庞大基因组编码的多种免疫调节蛋白,具有多种复杂、精妙的免疫调控策略[1],成为近年来痘病毒研究的重点和热点.
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丙型肝炎病毒与MAPK信号转导系统
0引言丙型肝炎病毒(HCV)是一种正链RNA病毒,其致病机制与DNA病毒和逆转录病毒有明显的区别[1].在病毒的生活周期中,HCV基因组编码多种结构和非结构蛋白,自身结合形成同二聚体形式,或与其他HCV病毒蛋白、细胞蛋白结合形成异二聚体,甚至是多聚体形式在肝细胞内存在[2].
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丙型肝炎病毒NS5A蛋白的反式激活作用研究
0引言丙型肝炎病毒(HCV)是一种单股正链RNA病毒,编码一种多蛋白分子,在病毒和宿主细胞蛋白酶的共同裂解作用下,至少裂解为3种结构蛋白(C、E1和E2)和6种非结构蛋白(NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[1,2].NS5 A是非结构蛋白的一种,哺乳动物细胞表达的NS5A蛋白以两种形式存在,分子量分别为56 kD和58 kD.HCV NS5A是HCV基因组编码的一种为重要的具有多种生物学活性的非结构蛋白质[3-5],是HCV基因组编码的一种具有反式激活作用等多种生物学活性的非结构蛋白质.其基因序列的变异,决定部分HCV病毒株对于IFN-α治疗的疗效应答.HCV NS5A蛋白还具有结合双链RNA激酶(PKR)的生物学活性,对于HCV感染的靶细胞的细胞周期与细胞凋亡的分子生物学调节机制密切相关[6].
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基因表达谱芯片技术筛选丙型肝炎病毒非结构蛋白3反式调节靶基因
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的非结构蛋白3(non-structural protein 3,NS3)是由HCV基因组编码的具有多种功能的蛋白质.NS3蛋白的表达对于HCV感染肝细胞的基因表达谱具有显著影响.为了研究NS3蛋白反式调节的靶基因,我们应用基因芯片技术对于pcDNA3.1(-)和pcDNA3.1(-)-NS3分别转染的HepG2细胞的基因表达谱进行分析.方法:以含有HCV-H全基因组cDNA的质粒pBRTM3011作为模板,应用聚合酶链反应(PCR)技术扩增NS3蛋白编码基因片段,以常规的分子生物学技术构建表达载体pcDNA3.1(-)-NS3.以脂质体技术转染肝母细胞瘤细胞系HepG2,提取总mRNA,逆转录为cDNA,与转染空白表达载体pcDNA3.1(-)的HepG2细胞进行DNA芯片分析并比较.结果:构建的表达载体经过限制性内切酶分析和DNA序列测定,证实准确无误.以单链可变区抗体的Western blot杂交技术证实构建的表达载体转染hepG2细胞之后有NS3蛋白的表达,提取高质量的总mRNA并进行逆转录成为cDNA,进行DNA芯片技术分析.在1 152个基因表达谱的筛选中,发现有34个基因表达水平显著上调,37个基因表达水平显著下调.结论:HCV的NS3蛋白是一种反式激活因子.NS3基因的表达对于肝细胞基因表达谱有显著影响.DNA芯片技术是分析反式激活靶基因的有效技术途径.
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基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因
目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组编码的HBxAg是一种很强的反式激活(transactivation)病毒蛋白,在正常肝细胞的恶性转化(transformation)以及肝细胞癌(HCC)的形成过程中具有十分重要的作用.为了阐明HBxAg的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:以含有全长乙型肝炎病毒基因的pCP10质粒作为模板,应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的HBxAg基因片段,常规分子生物学技术构建HBxAg的真核表达载体pcDNA3-HBxAg,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,HBxAg蛋白的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2中提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3-HBxAg构建正确.HBxAg在HepG2细胞中的表达以Western blot杂交技术得到证实.对于HBxAg重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,16种基因的表达水平上调,58种基因的表达水平下调.这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导等基因,相信这些类型的基因在HBxAg的恶性转化中具有十分重要的作用.结论:HBxAg是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响;基因芯片技术是分析病毒反式激活蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径.
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丙型肝炎病毒核心蛋白结合视黄醇脱氢酶11蛋白
目的:丙型肝炎病毒(HCV)的核心蛋白是HCV基因组编码的一种主要的结构蛋白,研究表明这种病毒的蛋白具有复杂的生物学调节作用.方法:以HCV的核心蛋白作为诱饵(bait),利用酵母双杂交技术,对于肝细胞表达型酵母细胞cDNA文库进行筛选.对于在缺陷型培养基上生长的真阳性酵母集落,进行回交实验,并对于cDNA文库表达载体质粒中插入的基因片段进行序列分析和生物信息学分析.结果:其中一个克隆命名为HCBP12,后来证明为视黄醇脱氢酶ll(retinol dehydrogenase ll,RDHll),或称为雄性激素调节的短链脱氢酶/还原酶l(androgen-regulatedshort-chain dehydrogenase/reductase l,ARSDRl).结论:这是首次发现和证实HCV核心蛋白与视黄醇脱氢酶ll之间存在着相互结合和相互作用,为充分阐明HCV核心蛋白在HCV感染发病机制中的作用,开辟了新的研究方向.
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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS5A反式激活基因1的克隆
目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)及生物信息学技术(bioinformatics)筛选并克隆丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白NS5A反式激活新型靶基因,进一步阐明HCV感染相关疾病的发病机制.方法:以HCV NS5A蛋白表达质粒pcDNA3.1(-)-NS5A转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行抑制性消减杂交分析.应用分子生物学技术,结合生物信息学技术,分析并克隆HCV NS5A反式激活作用的新的靶基因.结果:对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,从转染pcDNA3.1(-)-NS5A的HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列,并测序证实,命名为NS5ATP1.NS5ATP1基因的编码序列全长为1011个核苷酸(nt),编码产物由336个氨基酸残基(aa)组成.结论:HCV NS5ATP1是一种典型的病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白,而SSH是一种鉴定、分离组织细胞中选择性表达基因的技术.通过这种技术,发现了HCVNS5ATP1反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为进一步研究HCV NS5ATP1蛋白反式激活作用的分子生物学机制和探索新型治疗技术奠定了基础.
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乙型肝炎病毒X蛋白反式激活基因5的克隆
目的:为了阐明乙型肝炎病毒(HBV)感染相关疾病的发病机制,筛选并克隆丙型肝炎病毒非结构蛋白HBx反式激活新型靶基因.方法:以HBV X蛋白(HBx)表达质粒pcDNA3.1(-)-X转染HepG2细胞,以空载体pcDNA3.1(-)为平行对照,提取mRNA并进行SSH分析.对于所获基因片段序列分析表明,其中之一为新型基因片段,与GenBank中注册的已知功能基因序列没有同源性,利用表达序列标签(EST)序列的搜索和比对,确定新型基因序列并命名为XTP5.从HepG2细胞提取总RNA,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长序列.结果:XTP5基因的编码基因序列全长为1527个核苷酸(nt),编码产物由508个氨基酸残基(aa)组成.结论:HBx是一种由病毒基因组编码的具有反式激活作用的蛋白.应用SSH技术发现了HBx反式激活作用的新的靶基因,这一发现,为阐明HBx蛋白的反式激活作用及其机制,开辟了新的研究方向.
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微小RNA表达在糖尿病视网膜病变中的作用研究进展
微小RNA(microRNA)是一类进化中高度保守基因编码的内源性小分子RNA ,长度小于30个碱基。它可通过与靶基因的3'端结合,或直接与靶基因结合,或通过碱基互补配对抑制mRNA,在转录后水平调控目的基因的表达。 microRNA 调节靶基因mRNA主要通过降解或直接结合抑制其翻译。数据显示,人类基因组编码的microRNA估计有1100多种,它们可调节哺乳动物约60%的蛋白质编码[1]。自1993年microRNA 被首次从线虫发现,关于它的研究日益广泛深入,被证明在细胞的生长分化、增殖凋亡、生物的发育及物质代谢等方面均发挥作用。microRNA作为一个生物学标志物,是可以衡量的客观指标,可以反映特定疾病状态的发生和发展,并可以被有效测量。它在糖尿病诱导的视网膜病变动物模型中能够被有效监测,更准确地反映疾病病理状态的变化,这对于糖尿病视网膜病变的诊断、治疗及判断预后具有重要的意义。现就其在糖尿病视网膜病变发生发展中的作用进行综述。
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细胞间粘附分子-1与肝癌诊断及预后
细胞间粘附分子-1(ICAM-1)是由19号染色体基因组编码的一种单链跨膜糖蛋白,属粘附分子免疫球蛋白超家族(IgSF)成员之一,由5个Ig样功能区组成,其分子量为80~110KD,可随分布细胞种类的不同而有差异,这种差异主要是因为该分子的糖基化程度不同所致.ICAM-1分布于多种细胞表面,即组织中细胞膜表面ICAM-1,炎性细胞因子如IL-1、IFN-r、TNF-α等可调节其表达.近年来发现正常人血清中存在循环ICAM-1(cICAM-1),有肿瘤细胞株培养上清液中的ICAM-1又称为可溶性ICAM-1(sICAM-1).本文就ICAM-1与肝癌的诊断、治疗、预后间关系作一综述.
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人细小病毒B19感染与神经系统疾病
本文就人细小病毒B19(Human parvovirus B19,简称B19)的生物学特征、脑病患者B19基因组特点、B19相关神经系统疾病的发病机制、临床表现、诊断、防治等,综述如下。1 B19病毒的生物学特征 B19是动物病毒中体积小、结构简单的一种直径为23nm、无包膜、单链线状DNA病毒,含5.6kb碱基对。B19基因组编码两种衣壳蛋白即VP1(83ku)、VP2(58ku)和一个非结构蛋白NS1-1(77ku)。VP2氨基酸序列包含在VP1中,它们组成衣壳包裹在B19-DNA表面,构成B19的抗原性,参与机体的免疫反应;NS-1蛋白与B19毒力有关。B19的宿主范围为从红系爆式集落形成单位(BFU-E)到有核红细胞的红系细胞,其易感性随细胞分化而增加[1]。
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负链RNA病毒反基因操作技术发展之启示
1 反基因操作技术的来源和概念病毒具有体积小和基因组编码能力有限等特点,使得对许多病毒在分子水平上的认识达到了对细胞生物目前所不能达到的深度.在DNA病毒、正链RNA病毒和负链RNA病毒中,对于DNA病毒进行的基因操作困难小,因此先开始进行.使用编码病毒基因组的质粒转染细胞,亦或通过对携带病毒基因组序列的质粒之间进行异源重组来得以实现.而对RNA病毒进行基因操作却困难得多,一度陷入停滞不前的状态,直到一种新的分子生物学研究方法--反基因操作技术的出现和发展才得以解决.
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血清蛋白质组学在肝细胞癌的应用进展
蛋白质组学是以基因组编码全部蛋白质为研究对象,采用高分辨率的蛋白质分离手段,结合高通量的蛋白质鉴定技术,全面研究在特定情况下蛋白质表达谱[1],从细胞水平和整体水平研究蛋白质的组成及其变化规律,深入认识机体的各种生理和病理过程,因而具有发掘和寻找潜在肿瘤标志物的能力,倍受肿瘤研究者的高度重视.
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microRNAs 在炎性反应与肿瘤关系中的作用
miroRNA (miRNA )由真核生物基因组编码、RNA聚合酶II或III转录,依次经细胞核中Drosha和细胞质中Dicer酶(RNase III家族)剪切,终形成约含22个核苷酸的小分子非编码单链RNA[1‐2]。miRN A作为一种重要的基因表达调控因子,主要在转录后水平负调控靶基因的表达。Virchow 首次提出了慢性炎性反应与癌变的关联假说[3‐4],而Al‐lavena等[5]将炎性反应与肿瘤间相互作用的机制概括为基因调控和炎性反应两个途径。近年来,miR‐NA在炎性反应、肿瘤、免疫反应中的作用逐渐被揭示[6]。miRNA是免疫系统的一把双刃剑,既可维持机体内环境稳定,也可促进疾病的恶性循环[7]。目前,有关炎性反应与胃癌、结肠癌、肝癌、肺癌、食管癌、甲状腺癌、宫颈癌、膀胱癌、前列腺癌等肿瘤的关系的研究已较多,而有关炎性反应与乳腺癌的研究相对较少[3,8]。本文就miRNA 在炎性反应与肿瘤(尤其是乳腺癌)间的桥梁作用作一综述。
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非编码RN A与肝细胞癌的研究进展
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma ,HCC )是临床上的常见恶性肿瘤之一,也是第三大导致癌症病死的原因[1]。由于缺少有效的治疗措施,晚期 HCC常常导致患者快速死亡。与其它多种恶性肿瘤相似,HCC的发生中存在着多种基因网络及信号通路的调控异常。这些改变的基因包括可编码蛋白质的基因及非编码RNA (noncoding RNA ,ncRNA )。近年来,随着对微小RNA(micro‐RNA ,miRNA)研究的深入,逐渐认识到包括miRNA在内的ncRNA在HCC的发生、发展及转移中扮演着十分重要的角色。ncRN A是一种不翻译为蛋白质的功能性RNA ,人类的基因组中只有不足2%的基因序列终翻译为功能性蛋白质,其他很大比例是转录为ncRNA ,并通过多种途径直接发挥生物学作用[2]。ncRNA 具有多种类型,且不同类型的转录谱是存在着巨大差异的。同时,人基因组编码的ncRNA数量仍属未知,也不断有研究发现全新的功能性ncRNA[3]。长链非编码RNA (long noncoding RNA ,lncRNA)是大小超过200个核苷酸长度的ncRNA。虽然与microRNA相比其生物学功能尚不明确,但是越来越多的研究显示lncRNA可通过多种机制来干预相关基因的表达。在 HCC中,ncRNA作为致病、诊断、预后及治疗相关的研究靶点也逐渐引起学者的关注。在此,我们对ncRNA与HCC的关系进行简要的综述。