首页 > 文献资料
-
聚合酶链反应技术在出入境人员HIV检测中的应用
[目的]应用聚合酶链反应技术(PCR)检测HIV DNA,可避免在窗口期检测mV抗体时出现的假阴性,以及在HIV抗体检测出现不确定结果时,可及时判断是HIV的早期感染,还是非特异性反应,避免了此时进行随访带来的种种问题.此外,PCR技术还可用于预测疾病病程和监控病毒治疗的疗效病毒水平,也可用于HIV-1血清阳性母亲的婴儿的HIV检测和判断母婴垂直感染与否,对提高检验检疫工作质量和工作时效具有重要意义,在对出入境人员的HIV检测中有一定的应用前景.
-
rrn操纵元序列PCR鉴定术后龟分支杆菌暴发感染的研究
目的 本研究旨在采用分子生物学技术,从基因水平上确认医院内术后暴发感染的致病菌,并建立一套快速的PCR方法鉴定龟分支杆菌脓肿亚种.方法 根据分支杆菌的rrn操纵元序列即16s rDNA和16s-23s rDNA间隔区序列,分别设计合成一对引物,采用聚合酶链反应技术,并以结核分支杆菌和常见速生长非结核分支杆菌作对照,对临床分离株进行PCR扩增,并根据DNA带的大小和数量鉴定分支杆菌.结果 53株龟分支杆菌脓肿亚种临床分离株和标准株,用16s rDNA扩增,均被扩增出一条特异的584bp DNA带,相应的16s-23s rDNA扩增,为特异的380bp DNA带.而速生长的非结核分支杆菌均扩增出不同大小的1或2条DNA带.结论 基因水平上确认此次引起医院内术后暴发感染的致病菌为龟分支杆菌脓肿亚种.rrn操纵元PCR扩增检测体系灵敏、特异,能鉴定龟分支杆菌脓肿亚种临床株,并与其它速生长分支杆菌区别开.
-
阻断传播途径前后产婴室内轮状病毒污染情况的调查
轮状病毒(HRV)是引起婴幼儿秋季腹泻的主要病原体.自1975年以来国内外文献报道HRV可侵犯新生儿,甚至出生24小时内的新生儿也可能被感染[1].为探讨HRV母婴传播状况,笔者于1998年~1999年秋冬季用聚合酶链反应技术(PCR)对97例孕产妇及新生儿进行HRV监测,并对阻断传播途径前后的HRV感染情况进行了比较,现将结果报告如下.1 资料和方法
-
实时逆转录聚合酶链反应快速鉴别呼吸道合胞病毒亚型
呼吸道合胞病毒(RSV)是婴幼儿时期急性下呼吸道感染主要的病原体[1].近年发展起来的实时聚合酶链反应技术具有灵敏度高、特异性好、方法简便等特点,广泛应用于病原体的检测[2].为此,我们设计并建立了用SYBR GreenⅠ实时逆转录PCR结合融解曲线分析快速鉴别呼吸道合胞病毒A、B亚型的方法.
-
等位基因特异性多重聚合酶链反应技术对载脂蛋白E基因多态性检测的评价
载脂蛋白E(apolipoproteinE,apoE)是血浆主要载脂蛋白之一,具有明显的遗传多态性,3种常见的等位基因(ε2、ε3、ε4)分别编码3种主要异构体(E2、E3、E4),产生6种不同的基因型(ε2/ε2、ε2/ε3、ε2/ε4、ε3/ε3、ε3/ε4、ε4/ε4).apoE基因多态性不仅是心血管疾病的一种重要易患因素,而且与Alzheimer病密切相关.目前国内外检测apoE基因多态性的方法很多,因而快速简便的检测方法也就成为研究中关注的焦点.等位基因特异性多重聚合酶链反应(PCR)技术(multi-ARMS)是利用TaqDNA聚合酶对引物3′端核苷酸的特异性,在不同的反应体系中分别加入与待检测位点野生型、突变体相配的一对引物,通过扩增产物的有无来判定该位点是否突变.
-
定量聚合酶链反应技术及在临床实验室应用的价值
随着分子生物学技术的发展,聚合酶链反应(PCR)技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断,如检测临床标本中病原体核酸序列、肿瘤基因突变情况、遗传性疾病的基因序列、人类白细胞表面抗原(HLA)配型、法医学方面的鉴定工作等。目前基因芯片的问世,将分子生物学技术又推向一个新的高潮。现就临床实验室开展PCR技术及PCR技术检测病原微生物及肿瘤基因的临床意义和定量PCR技术,谈谈我们的看法。 1.目前国内临床实验室应用PCR技术存在的问题:在设施方面,如仪器显示的温度与孔内的温度不一致,有孔内差;自动化程度较低,人工操作人为误差较大;实验室布局不合理,不能满足3个分开的房间进行分阶段操作(第1间实验室为混合试剂和质控,第2间实验室为标本提取和试剂混合,第3间实验室为PCR扩增及产物检测,工作人员应从第1间依次到第3间实验室,不能返回工作。室内空气流向依次从第1间到第3间实验室,不能逆流,以防止空气污染);加样器及试剂等容易污染导致假阳性。另外,标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。例如检测痰中结核杆菌,标本采集一定是痰而不是唾液。血清中检测HCV-RNA标本保存不当,使病原体被破坏.操作者不戴手套或说话唾液溅入标本,RNA降解,失去PCR的模板,造成假阴性结果。合理设计寡核苷酸序列,好在保守区,特异性强,无干扰。 琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。如模板量大则拖尾现象严重,非特异性干扰带多。结果难于清楚判断。标本中有抑制物(Hb,高浓度尿素)均可出现假阴性。 目前美国病理学会(CAP)等组织以及临床实验室改进修正案(CLIA 1988)要求正规检测方法是先行PCR扩增,然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室,如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中乙肝病毒(HBV)、EB病毒(EBV)、人巨细胞病毒(CMV)的DNA。他们认为在他们的实验室里,用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的两种判断结果是一致的。因为他们实验室条件非常严格,而且每年都要通过美国CAP检查。但仍有些检测项目未得到美国FDA的批准。 2 .PCR技术检测的临床意义:我们认为对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术,不必一律采用PCR技术。目前没有其他诊断技术可以检测的疾病,如基因缺失、易位、突变及病原体需要较长时间培养或培养难度较大的疾病应考虑用PCR方法。如人类免疫缺陷病毒(HIV)是一种慢性病毒,在细胞内的繁殖水平比较低,感染后潜伏期较长,病毒难以培养而且需要较长时间培养。在对HIV抗原(HIV-Ag)和抗体(HIV-Ab)的检测结果难以判断时,可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国,血液制品既检测HIV-Ab也检测HIV-P24Ag 。国外有学者报道,感染HIV的患者血清HIV-P24Ag出现早于HIV-Ab10天左右。发现HIV-P24Ag(+)者,HIV PCR(+)。但HIV PCR(+)者,HIV- P24Ag可呈现(-),此时患者已具有传染性。PCR技术可用于艾滋病的早期诊断,定量PCR技术还是艾滋病疗效观察的有效检测手段。 用PCR和杂交方法对HCV基因分型、早期诊断和治疗监测均具有较大的临床意义,这已被国内外医学界的工作者公认。 结核分枝杆菌(MTB)培养时间一般要30~50天,培养出来的分枝杆菌还要鉴定是人型还是鸟型。涂片检查所需的抗酸杆菌也要一定的浓度。因此可以采用PCR方法检测。但PCR技术不能完全取代结核杆菌培养。PCR在药敏结果判断方面亦不理想。 当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒,特异性高,但敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定,对临床常规检验工作有一定的难度。应用PCR技术检测沙眼衣原体有一定的临床意义。 美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒。也批准了HPV的过筛检测,对于HPV各型的检测,目前尚未批准。MTB的靶序列是16 s DNA的584bp。其后带用杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒于1993年通过FDA批准,目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法检测。
-
实时荧光定量聚合酶链反应技术开始用于临床常规基因诊断
聚合酶链反应(PCR)技术问世20年来,已经成为致病基因分析的重要手段.但是,多年来PCR一直很难直接用于临床疾病的常规诊断,其原因主要是PCR常规实验中存在的污染问题难以解决.常规PCR是将样品和实验反应剂加入小试管进行基因扩增,PCR后汲取反应产物行琼脂糖或聚丙烯酰胺电泳,用PCR产物是否出现特异性条带来判断样本中有无疾病中发生变异的基因片段.尽管这种方法简便易行,但很难避免试管中的PCR产物飞散于实验室,污染下一次检测的结果,导致出现假阳性,影响疾病诊断.长期进行PCR的许多实验室都有污染造成试验失败的经验和教训.常规PCR的另一缺陷是PCR产物不易定量.
-
基因表达谱芯片技术筛选乙型肝炎病毒X蛋白反式调节基因
目的:乙型肝炎病毒(HBV)基因组编码的HBxAg是一种很强的反式激活(transactivation)病毒蛋白,在正常肝细胞的恶性转化(transformation)以及肝细胞癌(HCC)的形成过程中具有十分重要的作用.为了阐明HBxAg的表达对于肝细胞基因表达谱的影响,我们应用基因芯片技术,对于转染和未转染的HepG2细胞进行了分析.方法:以含有全长乙型肝炎病毒基因的pCP10质粒作为模板,应用聚合酶链反应技术(PCR)扩增的HBxAg基因片段,常规分子生物学技术构建HBxAg的真核表达载体pcDNA3-HBxAg,利用脂质体转染技术转染HepG2细胞,HBxAg蛋白的表达以Western blot杂交技术证实.从转染和非转染细胞HepG2中提取总mRNA,逆转录为cDNA,并进行基因芯片技术分析.结果:经过限制性内切酶分析和序列测定,证实pcDNA3-HBxAg构建正确.HBxAg在HepG2细胞中的表达以Western blot杂交技术得到证实.对于HBxAg重组表达载体和空白载体转染的HepG2细胞的基因表达谱,利用基因芯片技术进行分析.结果表明,16种基因的表达水平上调,58种基因的表达水平下调.这些基因包括细胞生长、细胞凋亡、信号转导等基因,相信这些类型的基因在HBxAg的恶性转化中具有十分重要的作用.结论:HBxAg是一种病毒反式激活蛋白,对于肝细胞基因表达谱有显著影响;基因芯片技术是分析病毒反式激活蛋白反式调节基因表达谱的重要技术途径.
-
定量聚合酶链反应技术研究进展
自Mullis等于1985年创建了聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术以来,该技术经过十几年的发展与完善,已在基础研究领域得到了广泛的应用,并在临床疾病的诊断方面进行了一些探索性研究。根据PCR扩增策略和检测产物手段的不同,可分为定性PCR(qualitative PCR,以下简称PCR)和定量PCR(quantitative PCR,Q-PCR)。 一、PCR在结核分支杆菌检测中的研究现状 1989年Hance等[1]将PCR用于结核分支杆菌的检测,1990年我国引进该项技术,从而在我国开辟了以PCR为代表的分子生物学技术检测结核分支杆菌阶段。该方法的敏感性和特异性与扩增系统中的引物、模板DNA的提取及纯化等多种因素有关,其中很大程度上决定于扩增的引物,因此,检测结核分支杆菌时各家采用过多种不同引物。PCR具有很高的敏感性,一般可检测出1~100 fg纯化结核分支杆菌DNA[2,3],相当于1~20个结核分支杆菌。随着研究技术的不断深入,为了进一步提高PCR的敏感性,有些学者对PCR技术进行了发展,如将Southern blot与PCR结合起来的PCR-Southern blot、巢式PCR(nested PCR)技术等。
-
扩张型心肌病102例临床分析
本研究旨在探讨原发性扩张型心肌病(DCM)的病因、发病情况、病情演变和临床特征。资料与方法:回顾性分析1994年1月~1999年1月间住院的DCM患者102例。DCM采用WHO/ISFC(1995)标准作出诊断,部分患者还做心肌活检(3例)、冠脉造影(6例)等检查,以排除其他常见心脏病。外周血白细胞肠道病毒核糖核酸用逆转录聚合酶链反应技术,血清柯萨奇B病毒中和抗体用微量板法,上述二者合称病毒标志物。心功能用同位素心血池法。资料分析以x±s表示,采用t或x2检验。
-
PCR技术在前列腺液细菌检测中的应用
目的 应用聚合酶链反应(PCR)技术检测慢性前列腺炎患者前列腺液中病原菌的阳性率.方法 收集97例慢性前列腺炎患者的前列腺液,分别用16S rRNA基因PCR方法和细菌培养法进行检测,比较两种方法检测 病原菌的敏感性.结果 97例慢性前列腺炎患者前列腺液中,PCR方法检测出58例,阳性率为59.79%,培养法检出10例,阳性率为10.31%,PCR方法检出率明显高于培养法(P<0.01).结论 16S rRNA基因PCR检测方法具有快速,特异性和敏感性高等特点.
关键词: 聚合酶链反应技术 慢性前列腺炎 16S rRNA基因 -
半乳糖凝集素3基因在眼部静脉畸形组织中的检测及临床意义
目的 检测半乳糖凝集素3(Galectin-3)基因在眼部静脉畸形组织中的表达,探讨其与眼部静脉畸形发生和进展的关系.方法 收集12例新鲜眼部静脉畸形组织标本为静脉畸形组,12例单纯性大隐静脉曲张组织近端正常静脉组织标本为对照组,采用实时荧光定量聚合酶链反应技术(Real-time PCR)和Western Blot检测Galectin-3的表达.结果 静脉畸形组和对照组Galectin-3mRNA及蛋白的相对表达量分别为5.26×10-3±8.78×10-4、4.89×10-4±5.37×10-5和0.861+0.394、0.223+0.206;眼部静脉畸形组织中Galectin-3 mRNA及蛋白水平上的表达量明显高于对照组(P<0.05),并随着病变侵及深度及范围的加重有递增的趋势.结论 Galectin-3 mRNA及蛋白在眼部静脉畸形组织中呈高表达,可能与静脉畸形局部侵袭发生发展和预后密切相关,可用于判断眼部静脉畸形的局部侵犯程度.眼部静脉畸形的发病机制可能与Galectin-3基因的参与有关,待通过基因芯片等技术进行更深入地研究.
-
应用多重巢式及荧光聚合酶链反应技术对β地中海贫血进行植入前遗传学诊断
目前,国外对β地中海贫血的植入前遗传学诊断,主要应用巢式PCR结合突变检测技术[1,2].但由于β地中海贫血基因的高度异质性,我国β地中海贫血突变基因类型与国外报道的不同.本研究根据我国常见的β地中海贫血突变基因类型,应用多重巢式PCR及荧光PCR技术,于2003年对4例β地中海贫血患者进行了临床植入前遗传学诊断,获得1例临床妊娠.现将结果报道如下.
-
荧光定量聚合酶链反应技术在产前诊断中的应用
上世纪70年代开始应用细胞遗传学染色体核型分析技术进行产前诊断,应用这一方法诊断妊娠期胎儿染色体数目及结构异常,即对绒毛、羊水、脐带血细胞进行培养而获取染色体,经分带、染色后在光学显微镜下分析染色体数目及结构从而得出诊断,但整个过程需要细胞培养,故产前诊断所需的时间较长,从取材到诊断大约2周左右.
-
荧光定量-聚合酶链反应技术产前快速诊断染色体异常的临床应用
预防重大出生缺陷已经成为社会及每个家庭关注的问题之一.大多数染色体异常为21、13、18号染色体及性染色体的非整倍体异常,占高风险人群的99.8%~99.9%.血清筛查结果为高风险及年龄在35岁以上的孕妇均需进行产前诊断.而产前诊断染色体异常的传统方法是核型分析,染色体核型分析结果一般需要2~3周.荧光定量-聚合酶链反应(FQ-PCR)技术通过对染色体等位基因多态位点上的重复序列扩增来检测染色体数目,24~48 h即可给出诊断结果,缩短了从检测到终止妊娠的时间,为缓解孕妇压力及决定是否终止妊娠争取了宝贵的时间.现将结果报道如下.
-
产前诊断除外肌营养不良蛋白基因外显子44移码突变一例
先证者,男,1+岁,临床诊断为杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy,DMD).该病发生主要原因是编码肌营养不良蛋白(dystrophin)基因的大片段缺失或突变[1].首先采用多重聚合酶链反应技术针对先证者及其父母的肌营养不良蛋白基因26个外显子(包括3、4、6、8、12、1 3、16、17、19、32、34、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、60、Pm、pb)进行检测,未见上述外显子缺失.进而采用多重连接依赖的探针扩增(multiplex ligation-dependcnt probe amplification,MLPA)法检测肌营养不良蛋白基因79个外显子,均未见缺失或重复.终经全基因测序发现先证者第44号外显子一处移码突变:NM_004006.1:c.6391_6392delCA(p.Gln2131AsnfsX3),而先证者父母的44号外显子同步测序均未见异常,且此突变未见报道.通过寡核苷酸多态性数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/SNP)、国际人类基因组单体型图计划(www.hapmap,org)和“华大基因千人基因组计划( www.genomics.cn)”中72个中国人样本的数据分析排除多态可能,同时经PDB数据库(www.pdb.org)蛋白功能预测可能造成膜蛋白结构域的改变,因此考虑此突变为新发或生殖腺嵌合造成的致病突变.
-
人乳头状瘤病毒感染与胎膜早破
胎膜早破是一种可威胁母婴健康的常见产科并发症,感染是其主要病因之一,已知胎膜早破与孕妇生殖道多种病原体有关,然而生殖道感染率相当高的人乳头状瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是否与胎膜早破有关,目前还不清楚.为此,我们以31例正常孕妇作对照,应用聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction,PCR)对30例胎膜早破孕妇的宫颈分沁物进行HPV-DNA的检测,以探讨HPV感染与胎膜早破的关系.
-
唾液标本聚合酶链反应技术筛查新生儿巨细胞病毒感染
先天性巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)感染是听力丧失的重要原因,但由于巨细胞病毒感染检出困难,导致许多有CMV相关听力丧失风险的婴儿难以在生后早期得到诊断.目前,新生儿CMV筛查的标准方法是在其出生时收集唾液标本进行CMV的快速培养,但该方法不能实现自动化,难以进行大规模筛查.为了解决这一问题,利用唾液液体标本或干燥标本进行的实时聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术应运而生.《新英格兰医学杂志》2011年6月发表的前瞻性多中心研究显示,这种新的CMV感染筛查方法具有很高的敏感性和特异性[1].
-
实时荧光聚合酶链反应技术用于Bart水肿胎儿产前诊断
α-地中海贫血(α-地贫)是一种常染色体隐性遗传性贫血病,在我国主要由α-珠蛋白基因3种严重缺失造成,即--SEA、-α3.7、-α4.2[1].患者基因型不同,临床症状轻重不一.其中症状重的为Bart水肿胎儿综合征,通常为死胎.其次为血红蛋白H病(HbH),患儿能成活,但贫血、甚至肝脾肿大.上述缺陷基因的携带者用一般实验室检查方法不能发现;运用基因诊断技术能够检出.我们于2003年12月至2005年2月探讨运用荧光染料SYBR Green1进行荧光PCR(SYBR-PCR)结合融解曲线分析(D.C)技术对α-地贫进行基因检测,并用此方法和单管多重PCR技术(mPCR)为来自福建省福州市的一对夫妇及其孕27周的畸形胎儿进行了基因诊断,报道如下.
-
柴胡对人乳头瘤病毒杀灭作用的实验研究
目的筛选柴胡抗人乳头瘤病毒(HPV)的有效成分.方法用溶媒(石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、乙醇、蒸馏水)对柴胡分别进行提取,应用荧光定量聚合酶链反应技术(FQ-PCR)对各提取物进行体外抗病毒药效学实验,检测离体尖锐湿疣皮损中HPV-DNA的扩增情况.结果HPV-DNA经柴胡水提物作用后,其PCR扩增检测为阴性,低有效浓度为0.2g/mL,而用其他有机溶剂提取部分PCR扩增检测为阳性.结论柴胡的水提成分有抗人乳头瘤病毒作用.