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琼脂糖凝胶电泳与核酸印迹杂交法检测细菌毒力基因PCR产物的灵敏度比较研究
目的 探讨核酸印迹杂交法在检测细菌毒力基因方面的应用价值.方法 分别以10倍连续稀释的0157:H7肠出血性大肠埃希菌和血清2型猪链球菌染色体提取物为模板,与志贺毒素2基因(stx2)和荚膜多糖2J基因(cps2J)特异性引物进行聚合酶链式反应(PCR).用1%琼脂糖凝胶电泳及核酸印迹杂交法检测PCR产物,比较两种方法的低检测限.结果 1%琼脂糖凝胶电泳对EDL933菌株:stx2基因PCR产物的低检测限为6.7 × 10(2)cfu(56.87 pg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的低检测限为4.3 × 10(2)cfu (12.65 pg)/PCR体系;核酸印迹杂交法对EDL933菌株stx2基因PCR产物的低检测限为6.7 × 10(-1)cfu (56.87 fg)/PCR体系,对SC84菌株cps2J基因PCR产物的低检测限为4.3 × 10(-1)cfu (12.65 fg)/PCR体系.结论 用核酸印迹杂交法检测肠出血性大肠埃希菌stx2基因和猪链球菌cps2J基因PCR产物的灵敏度均比普通琼脂糖凝胶电泳检测法高了1000倍.
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质粒提取及酶切图谱鉴定
本实验是采取碱变性方法从重组大肠杆菌中提取质粒DNA,并用EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ两种限制性内切酶对质粒DNA进行适当酶切,然后进行琼脂糖凝胶电泳对DNA酶切图谱加以鉴定.通过在紫外灯下观察电泳结果,证实利用碱变性方法提取质粒,同时通过酚氯仿抽提,得到的质粒DNA纯度比较高.并且证实酶切图谱与预计相符.从而说明在一般工厂的实验条件下可以进行操作.
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全自动琼脂糖凝胶电泳检测地中海贫血7 500例结果分析
目的:探讨全自动琼脂糖凝胶电泳仪在地中海贫血(简称地贫)筛查中的应用.方法:采用全自动琼脂糖凝胶电泳仪对7 500例标本进行Hb电泳,测定异常Hb、HbA2及HbF含量,其中439例同步做地贫基因检测.结果:7 500例中检出β地贫615例,异常Hb245例;439例电泳对比基因检测结果显示β地贫、HbH病的电泳检测结果与基因检测结果完全吻合,HbCS的检测结果吻合率达99.77%.以HbA2≤2.55%诊断α1地贫,敏感度和特异度分别为88.9%和73.3%,以HbA2≤2.65%诊断α2地贫敏感度和特异度分别为81.3%和66.3%.结论:全自动琼脂糖凝胶电泳分辨率高,能准确分析出HbA2、HbH、HbCS、HbF异常增高及其它异常Hb,能很好诊断β地贫、HbH病和HbCS.
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血管紧张素转换酶基因多态性与心肌梗死、脑梗死、肾小球肾病的关系探讨
应用聚合酶链式反应技术,扩增心肌梗死、脑梗死、肾小球肾病病人外周血血管紧张素转换酶(ACE)基因第16内含子目的片段,琼脂糖凝胶电泳确认等位基因,计算各组的基因频率,作为预测心肌梗死、脑梗死、肾小球肾病发病和预后.
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一种适用于不同发育期山楂果实总RNA提取的方法
目的:筛选从不同发育期山楂果实中提取RNA的佳方法.方法:对不同发育期山楂果实总RNA提取方法进行了探索,考察了Trizol法、改良Trizol法、经典十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)法和改良CTAB法提取RNA的效果,采用琼脂糖凝胶电泳和核酸蛋白定量仪检测RNA质量.结果:Trizol法、改良Trizol法对成熟期山楂果实RNA提取效果不佳,琼脂糖凝胶电泳检测几乎看不到条带;经典CTAB法对各发育期样本RNA提取质量均不理想;改良CTAB法对不同发育期山楂果实总RNA有良好的提取效果,A260nm/A280nm均在2.0左右,28 S和18S条带完整,满足反转录和聚合酶链式反应(PCR)扩增反应的需求.结论:建立的改良CTAB法是一种有效的山楂果实总RNA提取方法,适用于不同发育期山楂果实RNA的提取,为开展山楂有效成分的生物合成研究奠定了基础.
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动物病毒诱导的细胞凋亡及其生理意义
细胞凋亡是指细胞受到内外信号刺激时发生的一种由细胞内部基因控制的主动性死亡行为,是细胞内在的机制,也是决定生物个体发育和组织平衡的一个重要机制,对于抵御外界各种因素干扰起着非常关键的作用.它呈现一系列典型的生化和形态学特征,如染色质凝集、趋边化以及凋亡小体(apoptotic body)的产生.伴随着形态学上的变化,凋亡细胞的染色质在核小体间被活化的DNase特异水解,形成大约为180～200bp或其多聚体组成的寡核苷酸片段,被包裹在凋亡小体内,琼脂糖凝胶电泳表现为DNA"梯带"(DNA ladder)[1].大量的研究证实,很多病毒在其感染周期过程中可诱导细胞凋亡[2,3],病毒感染诱发的细胞凋亡也常与一些疾病的发生密切相关.所以,研究病毒诱导细胞调亡及其生理意义对于阐明细胞凋亡分子机制和病毒与宿主的相互作用具有重要的意义.
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姜黄素诱导永生化人HaCaT细胞凋亡
目的 探讨姜黄素对人永生化上皮细胞凋亡的诱导作用.方法 应用细胞计数、流式细胞术、琼脂糖凝胶电泳、Hoechst33258染色、苏木素-伊红(HE)染色和透射电镜检测经姜黄素诱导处理后人永生化上皮HaCaT细胞的凋亡.结果经7.5mg/L姜黄素诱导处理后,人永生化上皮HaCaT细胞的增殖活动受到明显的抑制,细胞生长抑制率达83.03%;细胞周期检测出现亚二倍体(亚G1期)细胞峰值,细胞凋亡率达13.1%,并发生G2/M期阻滞;琼脂糖凝胶电泳出现细胞凋亡典型的DNA"梯状"条带;细胞核经Hoechst33258染色出现浓染致密的固缩形态和颗粒状荧光;光镜和电镜观察结果显示,姜黄素处理组细胞体积缩小,细胞核固缩,染色质凝聚,线粒体肿胀,有凋亡小体形成等显著的凋亡特征.结论姜黄素对人永生化上皮HaCaT细胞凋亡有显著的诱导作用,从而为进一步研究表皮细胞衰老、凋亡机理提供了重要基础和研究依据.
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热休克蛋白70在人食管癌EC9706细胞凋亡过程中的表达与定位变化
目的 探讨姜黄素对人食管癌EC9706细胞凋亡的诱导作用,热休克蛋白70(HSP70)在肿瘤细胞凋亡过程中在核基质上的变化及其与凋亡调控相关蛋白的关系.方法 用细胞计数和流式细胞仪检测姜黄素对人食管癌EC9706细胞的增殖抑制作用,以光学显微镜和透射电镜观察姜黄素诱导人食管癌EC9706细胞凋亡前后的细胞结构变化,琼脂糖凝胶电泳观察人食管癌EC9706细胞凋亡前后的DNA结构变化.双向凝胶电泳和质谱鉴定分析HSP70在核基质中的存在与变化;并以Western blotting进行确证;激光扫描共焦显微镜观察HSP70在EC9706细胞凋亡过程中的定位及其与Bax、Bcl-2等基因产物的共定位关系.结果 姜黄素能显著抑制人食管癌EC9706细胞增殖并诱导人食管癌EC9706细胞凋亡,双向凝胶电泳、质谱鉴定和结果 发现并证实,HSP70在姜黄素处理前后的EC9706细胞核基质蛋白中的存在及其表达下调变化.激光扫描共焦显微镜观察结果 显示,HSP70在EC9706细胞凋亡过程中与Bax、Bcl-2等基因产物具有共定位关系,且其共定位区域发生了变化.结论 姜黄素对人食管癌EC9706细胞具有显著的凋亡诱导作用;HSP70作为一种新发现的核基质蛋白,在姜黄素诱导人食管癌EC9706凋亡过程中的表达与分布发生了显著变化.HSP70与凋亡相关基因的关系对EC9706细胞凋亡具有重要影响.
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琼脂糖凝胶中DNA检测方法的研究进展
作为研究生命遗传物质载体——核酸的工具,琼脂糖凝胶电泳已成为高效分离和分析核酸分子的必备手段,而在电泳后对DNA的检测是关键环节,因为它直接关系到实验结果显现与否.目前,常用的琼脂糖凝胶上DNA检测方法有荧光染色法、染料染色法、金属离子染色法、负染法等.近几十年来,许多研究者对染色方法进行了改进,使灵敏度和线性动态范围都有较大程度提高.本文主要对琼脂糖凝胶电泳后的DNA检测技术方面的研究历程进行总结,并展望其未来的发展方向.
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人巨细胞病毒与大肠癌相关关系的研究
人巨细胞病毒(human cytomegalovirus，HCMV)与宫颈癌关系十分密切，但与大肠癌关系的报道较少。本文就HCMV感染及大肠癌p53基因与HCMV感染的相关性进行了研究。 1 材料和方法 1.1 标本来源 收集1994年～1996年白求恩医科大学中日联谊医院外科切除大肠癌组织共60例，存放于-80℃。均经病理证实，并结合临床进行了Dukes分期和组织分化程度分型。患者年龄在38～72岁之间，男42例，女18例。 1.2 DNA模板制备取-80C冻存组织约1 g，经组织研磨器研磨，加入1mlDNA裂解缓冲液置55℃ 1 h，95C 15mmin，经13 000 r／m min离心10 min，上清即为DNA模板。再0.8％～1％低电渗琼脂糖凝胶电泳，以排除降解的模板。
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血红蛋白浓度对Hb琼脂糖凝胶电泳中HbA2定量的影响
目的 探讨点样前血红蛋白(haemoglobin,Hb)浓度对全自动琼脂糖凝胶电泳中HbA2定量的影响,以固定合适的点样前的Hb浓度范围,建立本实验室正常成人HbA2的参考值.方法 35例正常人标本按点样前Hb浓度分为4组(各组浓度约为80、16、8和4 g/L),用全自动琼脂糖凝胶进行Hb电泳测定各组HbA2含量,以方差分析对各组之间均数作两两比较.固定上样前Hb 4～8 g/L条件下测定100例正常成人HbA2含量.结果 点样前4组不同Hb浓度下HbA2含量分别为(8.0±1.2)%、(4.4±0.36)%、(3.5±0.39)%、(3.3±0.22)%.经方差分析,Hb浓度约为8g/L、4 g/L之间HbA2含量差异无显著性(P＞0.05),其他各组之间HbA2含量差异均有显著性.固定上样前Hb浓度4～8 g/L条件下,测定100例正常成人HbA2的含量为(3.2±0.29)%(正常参考值范围2.7%～3.8%).结论 点样前不同Hb浓度对全自动琼脂糖凝胶电泳中HbA2定量有显著性影响,合适的点样前Hb浓度应为＜8 g/L.固定点前Hb浓度在4～8 g/L条件下,得出本实验室正常人HbAs的参考值范围为2.7%～3.8%.
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两种DNA探针杂交检测结核分枝杆菌的研究
我们比较了结核分枝杆菌(结核菌)基因组DNA及其聚合酶链反应(PCR)产物的灵敏度与特异性，并对结核病人痰标本进行了检测。 一、材料和方法 1.菌种来源：24种分枝杆菌来自中国药品生物制品检定所，11种非分枝杆菌来自中国科学院微生物学研究所。 2.标本收集：90份痰标本来自本院结核科住院病人，经X线检查、临床表现确诊。30份非结核病人痰标本来自本院呼吸科、肿瘤科及北京大学第三医院呼吸科住院病人。 3.标本DNA提取：采用本室研制的标本前处理试剂盒。 4.引物：引物a：根据文献［1］报道设计。扩增产物为350 bp，5′-GAAGTCGTAACAAGC，5′-CAAGGCATCCACCAT；引物b：根据引物a扩增产物测序结果，选择碱基差异性设计，扩增产物为250 bp，5′-CGGCAGCGTATCCATTGATG，5′-CACGAAAACGCCCCAACTG。 5.PCR扩增：引物a扩增参数：94℃，1 min；45℃，3 min；72℃，1 min；循环30次，后72℃延伸10 min。引物b扩增参数：94℃，1 min；61℃，1 min；72℃，1 min；循环30次，后72℃延伸10 min。扩增产物经2%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。
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一次腹泻病原菌的随机扩增多态DNA特征
RAPD(随机扩增多态DNA)分析细菌基因组结构的突出优势是无须知道待测细菌的遗传背景,技术成熟简便,从扩增产物可以比较不同属、种、型及株系间的DNA指纹特征.1998年6～10月,呼和浩特地区发生小儿急性肠炎,为进一步认识腹泻的病原菌,对保存菌株进行了RAPD分析.一、材料与方法12株福氏志贺菌2a型、2株福氏志贺菌6型和5株奇异变形杆菌进行细菌基因组DNA的RAPD分析.随机引物选择CyberSyn生物工程公司的CY10系列套式引物,PCR扩增在PE 480型上进行.收集生长对数期菌体,0.9% NS洗涤2次,15 000 r/min离心5 min,用EB平板测定DNA含量,稀释至4 ng/ml.25 μl常规反应体系,40个循环,退火温度根据引物的不同选择从37℃到40℃.1.5%的琼脂糖凝胶电泳,紫外灯下拍照记录.
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定量聚合酶链反应技术及在临床实验室应用的价值
随着分子生物学技术的发展，聚合酶链反应（PCR）技术已逐渐应用于遗传性疾病、肿瘤及感染性疾病等方面的诊断，如检测临床标本中病原体核酸序列、肿瘤基因突变情况、遗传性疾病的基因序列、人类白细胞表面抗原（HLA）配型、法医学方面的鉴定工作等。目前基因芯片的问世，将分子生物学技术又推向一个新的高潮。现就临床实验室开展PCR技术及PCR技术检测病原微生物及肿瘤基因的临床意义和定量PCR技术，谈谈我们的看法。 1．目前国内临床实验室应用PCR技术存在的问题：在设施方面，如仪器显示的温度与孔内的温度不一致，有孔内差；自动化程度较低，人工操作人为误差较大；实验室布局不合理，不能满足3个分开的房间进行分阶段操作（第1间实验室为混合试剂和质控，第2间实验室为标本提取和试剂混合，第3间实验室为PCR扩增及产物检测，工作人员应从第1间依次到第3间实验室，不能返回工作。室内空气流向依次从第1间到第3间实验室，不能逆流，以防止空气污染）；加样器及试剂等容易污染导致假阳性。另外，标本采集及保存不合适和操作不当易出现假阴性。例如检测痰中结核杆菌，标本采集一定是痰而不是唾液。血清中检测HCV-RNA标本保存不当，使病原体被破坏.操作者不戴手套或说话唾液溅入标本，RNA降解，失去PCR的模板，造成假阴性结果。合理设计寡核苷酸序列，好在保守区，特异性强，无干扰。 琼脂糖凝胶电泳鉴别PCR产物的影响因素较多。如模板量大则拖尾现象严重，非特异性干扰带多。结果难于清楚判断。标本中有抑制物（Hb,高浓度尿素）均可出现假阴性。 目前美国病理学会（CAP）等组织以及临床实验室改进修正案（CLIA 1988）要求正规检测方法是先行PCR扩增，然后进行杂交来判断结果。但美国一些实验室，如印第安纳大学医学中心的病理和医学实验室用PCR方法检测临床标本中乙肝病毒(HBV)、EB病毒(EBV)、人巨细胞病毒(CMV)的DNA。他们认为在他们的实验室里，用琼脂糖凝胶电泳和电泳后再杂交的两种判断结果是一致的。因为他们实验室条件非常严格，而且每年都要通过美国CAP检查。但仍有些检测项目未得到美国FDA的批准。 2 .PCR技术检测的临床意义：我们认为对灵敏度和特异性基本上达到临床需要的检测技术，不必一律采用PCR技术。目前没有其他诊断技术可以检测的疾病，如基因缺失、易位、突变及病原体需要较长时间培养或培养难度较大的疾病应考虑用PCR方法。如人类免疫缺陷病毒（HIV）是一种慢性病毒，在细胞内的繁殖水平比较低，感染后潜伏期较长，病毒难以培养而且需要较长时间培养。在对HIV抗原（HIV-Ag）和抗体（HIV-Ab）的检测结果难以判断时，可用PCR技术作为确认手段。当前临床标本一般仅检测HIV-Ab。在美国，血液制品既检测HIV-Ab也检测HIV-P24Ag 。国外有学者报道，感染HIV的患者血清HIV-P24Ag出现早于HIV-Ab10天左右。发现HIV-P24Ag（+）者，HIV PCR（+）。但HIV PCR（+）者，HIV- P24Ag可呈现（-），此时患者已具有传染性。PCR技术可用于艾滋病的早期诊断，定量PCR技术还是艾滋病疗效观察的有效检测手段。 用PCR和杂交方法对HCV基因分型、早期诊断和治疗监测均具有较大的临床意义，这已被国内外医学界的工作者公认。 结核分枝杆菌（MTB）培养时间一般要30～50天，培养出来的分枝杆菌还要鉴定是人型还是鸟型。涂片检查所需的抗酸杆菌也要一定的浓度。因此可以采用PCR方法检测。但PCR技术不能完全取代结核杆菌培养。PCR在药敏结果判断方面亦不理想。 当前有检测沙眼衣原体抗原的试剂盒，特异性高，但敏感性不甚满意。衣原体需在细胞中培养后进行鉴定，对临床常规检验工作有一定的难度。应用PCR技术检测沙眼衣原体有一定的临床意义。 美国FDA已批准HIV、MTB、沙眼衣原体的PCR或杂交检测试剂盒。也批准了HPV的过筛检测，对于HPV各型的检测，目前尚未批准。MTB的靶序列是16 s DNA的584bp。其后带用杂交检测。沙眼衣原体的检测试剂盒于1993年通过FDA批准，目前用特殊探针进行杂交后用免疫化学法检测。
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白介素-1受体拮抗剂基因多态性与胃癌易感性关系的研究
目的:探讨白介素-1受体拮抗剂(IL-1RN)基因在国人胃癌及正常人群中的多态性,初步分析其基因型与其胃癌的相关性.方法:收集50例胃癌癌旁正常组织和50名正常健康人外周血标本,提取DNA进行PCR扩增,经琼脂糖凝胶电泳对IL-1RN基因多态性进行分析.结果:IL-1RN基因有5种不同组合的等位基因,我们的研究结果只有1/1、1/2、2/2三种多态,其余多态均为阴性.其中IL-1RN*1等位基因频率在正常人和胃癌患者中分别为73%和49%,IL-1RN*2等位基因频率则分别为27%和51%.正常人和胃癌患者中3种基因型频率分别为1/1:54%(27/50)和24%(12/50);1/2:38%(19/50)和50%(25/50);2/2:8%(4/50)和26%(13/50).携带IL-1RN*2等位基因会增加罹患胃癌的危险性,1/2杂合子和2/2纯合子比1/1纯合子分别增加2.96倍(P=2.96,95%CI=1.22-7.21;χ 2=5.68,P＜0.05)和7.31倍(P=7.31,95%CI=2.13-25.09;χ2=10.01,P＜0.01).结论:IL-1RN基因1/2、2/2多态性与国人胃癌易患性相关,可作为胃癌遗传易感性的检测指标,用于胃癌易患个体的预警和胃癌的预防.
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ntPCR-RFLP检测HBV阿德福韦耐药变异-rtN236T变异
目的:建立一种简便、快速、实用的乙型肝炎病毒(HBV)阿德福韦(ADV)耐药变异-rtN236T变异的快速检测方法.方法:根据GenBank收录的HBV基因全序设计巢式PCR引物,使野生株(rt236N)PCR产物中含有DraI酶切位点(5'TTTAAA3'),而变异株(rt236T)无此限制性酶切位点.同时PCR扩增2份已行HBVRT区基因测序证实未出现rtN236T变异的慢性乙型肝炎患者血清及自行构建的对照质粒,扩增产物经DraI酶切,30 g/L琼脂糖凝胶电泳后,进行限制性片段长度多态性(RFLP)分析.结果:所建立的ntPCR-RFLP方法灵敏度高,可以检测到106copies/L的HBV DNA;特异性强,其RFLP分析结果与DNA测序结果一致.结论:ntPCR-RFLP方法灵敏、特异、简便、实用,适用于ADV耐药变异的临床监测工作.
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鼠暴发性肝衰竭中Fas表达与肝细胞凋亡的关系
目的:研究Fas表达及肿瘤坏死因子-α(tumor necrosisfactor-α,TNF-α)在暴发性肝衰竭(fulminant hepatic failure,FHF)中与肝细胞凋亡的关系.方法:采用脂多糖(LPS)和D-氨基半乳糖(D-GalN)联合用药制备FHF小鼠模型;采用免疫组化方法检测肝组织Fas表达,分别采用ELISA方法和RT-PCR法检测血清TNF-α水平及肝组织TNF-αmRNA表达;采用肝组织DNA琼脂糖凝胶电泳和TUNEL法检测肝细胞凋亡;在用药后2,4,8,12 h的不同时期动态观察Fas表达、血清TNF-α水平及肝组织TNF-α mRNA表达及肝细胞凋亡的变化,并对模型鼠给予TNF-α mAb,动态观察上述指标的变化.结果:在FHF模型小鼠中,用药后2 h开始Fas有少量表达,至8 h和12 h表达均很多,二者比较无显著差异,与2 h组比较P＜0.01,与4 h组比较P＜0.05.用药后2-4 h肝组织TNF-αmRNA表达显著增加(0.91±0.75,正常值为0.32±0.10),伴血清TNF-α水平升高(320±87 ng/L,正常值为17±7 ng/L),8 h可出现典型的肝细胞凋亡表现,血清ALT和TBil水平显著增加(分别为9352±1 000nkat/L和163.7±34.5 μmoL/L,正常值分别为393±134 nkat/L和14.9±4.8 μmoL/L),12 h肝细胞坏死和凋亡同时存在,血清ALT和TBil水平达高峰(分别为11141±1312nkat/L和203.2±19.9lμmoL/L).给予TNF-αmAb LPS/D-GalN介导的肝细胞凋亡和损伤被阻断,Fas表达亦被阻断.结论:在F-F中,TNF-α对肝细胞凋亡及肝损伤起重要的作用,肝细胞凋亡的发生与Fas的表达增加有关.
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腺病毒增强转铁蛋白受体介导的针对突变型P53的大酶转染可促进肝癌细胞凋亡
目的:通过腺病毒增强的转铁蛋白受体介导法(AVET)将针对突变型p53(mtp53)的大酶(Maxizyme)基因转入肝癌细胞后篌对肝癌细胞凋亡的影响,探索AVET用于肝癌基因治疗的可行性,为肝癌的基因治疗探索一条新途径.方法:以带有mtp53基因的人肝癌细胞株MHCC97细胞为模型,用腺病毒增强转铁蛋白受体介导法将针对mtp53的pEGFP-Maxizyme基因和空载体pEGFP分别导入MHCC97细胞,荧光显微镜观察细胞转染情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mtp53 mRNA表达水平的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测转染后对细胞凋亡的影响.结果:转染后48h荧光显微镜下可见呈细胞形态的绿色荧光.收集细胞检测,实验组mtp53 mRNA表达水平与空载体组和空白对照组相比,基因扩增条带亮度明显减弱,mRNA表达水平下降(P＜0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的凋亡梯带(DNA Ladder);流式细胞仪分析显示细胞凋亡水平增高,凋亡指数22.95%,显著高于对照组的2.37%(P＜0.05).结论:腺病毒增强转铁蛋白受体介导的基因转移系统可将pEGFP-Maxizyme有效的转染到肝癌细胞株MHCC97中,Maxizyme在细胞内成功的切割了mtp53 mRNA,促进了肝癌细胞的凋亡,这为腺病毒增强转铁蛋白受体介导法在肝癌基因治疗中的应用提供了实验依据,也为肝癌的基因治疗提供了一条新途径.
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羟基磷灰石纳米粒子诱导人肝癌细胞凋亡模型的构建
目的:建立羟基磷灰石纳米粒子体外诱导人肝癌细胞凋亡的模型,为进一步研究纳米粒子诱导肝癌细胞凋亡的分子机制奠定基础.方法:用羟基磷灰石纳米粒子以不同终浓度、不同时间作用于人肝癌BEL-7402细胞,用细胞毒性实验(MTT比色法)观察其细胞毒性,倒置相差显微镜、荧光显微镜、透射电镜、DNA琼脂糖凝胶电泳等方法观察凋亡在形态学和生化方面的变化.流式细胞仪分析以进一步了解凋亡发生的时间和程度.结果:羟基磷灰石纳米粒子以剂量依赖和时间依赖的方式抑制BEL-7402细胞的生长.50-200mg/L的纳米粒子处理48h后,形态学上,肝癌细胞表现为细胞皱缩、核质浓缩、核碎裂、细胞起泡以及凋亡小体形成等凋亡特征.琼脂糖凝胶电泳观察到DNA"梯带".流式细胞仪定量分析,0,50、75、100、150、200mg/L浓度下凋亡率分别为2.2%,20.3%,25.3%,29.8%,45.1%和53.1%.50 mg/L作用12h后肝癌细胞出现凋亡,48h达高峰,12,24,36,48h细胞凋亡率分别为2.7%,3.5%,6.3%和21.4%.结论:羟基磷灰石纳米粒子既能抑制人肝癌BEL-7402细胞增生,又能诱导其凋亡,该凋亡模型的成功建立将有助于进一步探讨纳米粒子诱导肝癌细胞凋亡的分子机制.
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幽门螺杆菌和非甾体消炎药对胃上皮细胞动力学的影响
目的:观察幽门螺杆菌(Hpylori)和非甾体消炎药(NSAID)对胃上皮细胞增生凋亡的影响.方法:胃癌细胞株AGS与H pylori和/或消炎痛,阿司匹林体外共培养,通过MTT比色法,增生细胞核抗原(PCNA)的Western Blotting检测技术,观察细胞增生青况,FITCAnnexin-V/PI双染色流式细胞仪检测,DNA凝胶电泳,透射电镜方法等检测细胞凋亡.结果:MTT比色法和蛋白质印迹检测细胞PCNA表达结果表明细胞毒素相关基因A(CagA)阳性的H pylori菌株NCTC11637能够促进细胞增生,此外,低密度(3.2×107-4×109CFU/L)NCTC11637能促进细胞的增生,而高浓度(＞2×1010CFU/L)则抑制细胞的增生.消炎痛和阿司匹林能抑制细胞的活力.当AGS细胞与H pylori和NSAID共同孵育时,细胞的生长亦明显受到抑制.FITC-AnnexinV/PI双染色流式细胞仪检测表明消炎痛和阿司匹林可诱导细胞凋亡明显增强,而Hpylori组则未见凋亡的增强,当二者共同作用于AGS细胞时,细胞凋亡率明显升高,但与非甾体消炎药单独作用组相比,则有所下降.透射电镜和DNA琼脂糖凝胶电泳进一步证实了FITC-Annexin-V/PI双染色流式细胞仪检测的结果.结论:CagA阳性的Hpylori更加容易促进胃上皮细胞的增生.H pylori对细胞生长的影响与H pylori的密度有关.Hpylori和NSAID间的作用是相互拮抗的.
