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两种启动子调控下PNP基因载体的构建和差异性表达
目的:分别构建巨细胞病毒(cytomegalovirus,CMV)通用启动子和甲胎蛋白(α-fetoprotein,AFP)杂合启动子[HRE]AF调控的PNP基因表达载体并检测、分析二者的差异表达.方法:将[HRE]AF启动子插入载体pcDNA3.0,构建肝癌细胞特异表达载体p[HRE]AF;将PNP基因分别插入pcDNA3.0和p[HRE]AF,构建两种启动子调控的PNP基因表达载体pcDNA3.0/PNP和p[HRE]AF/PNP;经酶切、PCR及测序鉴定各重组体.用脂质体介导法将两PNP基因载体转染不同细胞株,RT-PCR检测PNP基因在各细胞株中表达,分析二者表达的特点.结果:各目的片段均成功插入相应载体中,CMV启动子调控的PNP基因在各株细胞中均实现了表达,而[HRE]AF启动子调控的PNP基因则在AFP阳性和阴性肝癌细胞中实现了组织特异性表达.结论:两PNP基因表达载体是肝癌基因治疗中新型、高效的治疗载体,p[HRE]AF/PNP还实现了在AFP阳性,尤其是AFP阴性肝癌细胞中的靶向性表达.
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腺病毒增强转铁蛋白受体介导的针对突变型P53的大酶转染可促进肝癌细胞凋亡
目的:通过腺病毒增强的转铁蛋白受体介导法(AVET)将针对突变型p53(mtp53)的大酶(Maxizyme)基因转入肝癌细胞后篌对肝癌细胞凋亡的影响,探索AVET用于肝癌基因治疗的可行性,为肝癌的基因治疗探索一条新途径.方法:以带有mtp53基因的人肝癌细胞株MHCC97细胞为模型,用腺病毒增强转铁蛋白受体介导法将针对mtp53的pEGFP-Maxizyme基因和空载体pEGFP分别导入MHCC97细胞,荧光显微镜观察细胞转染情况,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)检测mtp53 mRNA表达水平的变化,DNA琼脂糖凝胶电泳和流式细胞仪检测转染后对细胞凋亡的影响.结果:转染后48h荧光显微镜下可见呈细胞形态的绿色荧光.收集细胞检测,实验组mtp53 mRNA表达水平与空载体组和空白对照组相比,基因扩增条带亮度明显减弱,mRNA表达水平下降(P<0.05);DNA琼脂糖凝胶电泳出现典型的凋亡梯带(DNA Ladder);流式细胞仪分析显示细胞凋亡水平增高,凋亡指数22.95%,显著高于对照组的2.37%(P<0.05).结论:腺病毒增强转铁蛋白受体介导的基因转移系统可将pEGFP-Maxizyme有效的转染到肝癌细胞株MHCC97中,Maxizyme在细胞内成功的切割了mtp53 mRNA,促进了肝癌细胞的凋亡,这为腺病毒增强转铁蛋白受体介导法在肝癌基因治疗中的应用提供了实验依据,也为肝癌的基因治疗提供了一条新途径.
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镇痛抗肿瘤肽基因真核表达载体构建及其体外抗肝细胞癌作用
肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)在我国的发病率及病死率均高.西医治疗肿瘤有起效快的优点,但往往有较大的副作用和局限性.我国传统中药中许多成分具有抗肿瘤作用,作为中药蝎毒成分之一的东亚钳蝎镇痛抗肿瘤肽(analgesic-antitumor peptide,AGAP)近来备受关注,将其与现代生物技术结合开发新的抗肿瘤药物具有很好的发展前景.本研究通过构建甲胎蛋白(AFP)启动子及增强子调控的AGAP真核表达载体,观察其对HCC的治疗作用,为蝎毒在肝癌基因治疗方面的价值提供实验依据.
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肝癌基因治疗研究进展
肝癌是世界上恶性程度极高,且预后极差的恶性肿瘤之一,每年全球约有125万人患病。在我国肝癌目前已处于恶性肿瘤死亡率的第二位,每年至少有10万名新发现病人,和11万名肝癌病人死亡〔1〕。尽管目前肝癌的治疗方法有许多种,但治疗效果都十分有限,并未显著延长病人的生存期。大部分肝癌病人对化疗及放疗等治疗均不敏感,能手术根治的病人仅占15%。随着分子生物学和免疫学理论及技术的不断发展和对肿瘤发病机制的不断认识,人们可以利用基因工程的手段进行肝癌的基因治疗,且在该领域已显示出一定的临床治疗效果。如Habib等〔2〕使用野生型p53基因治疗原发性肝细胞癌的临床治疗试验,取得了很大的成功,引起人们的普遍关注。本文就目前肝癌基因治疗的研究现状和发展趋势作一综述。 一、肝癌基因治疗中所使用的载体系统和治疗途径的选择 目前在肝癌基因治疗实验当中使用多的是病毒载体系统,包括腺病毒载体〔3〕、逆转录病毒载体〔4〕、腺相关病毒载体〔5〕等,非病毒载体系统主要是使用脂质体〔2,6〕介导,且已进入临床试验阶段。在肿瘤基因治疗中,腺病毒载体系统具有许多优点,如制备容易,能获得高纯度、高滴度的腺病毒体;无遗传毒性,以游离型状态存在,不整合进入宿主DNA中;表达时间相对短暂,一般15~20 d左右,不会造成对免疫系统的长期慢性刺激〔7〕;感染宿主范围相对较广,尤其是能感染复制、分裂期的细胞。近几年临床上使用腺病毒载体治疗恶性肿瘤的例子越来越多〔8〕。体外实验证实,数个人的肝癌细胞系HepG2、Hep3B、Hnh7、HLE、HLF、SK-HEP-1和大鼠肝癌细胞系McA-RH7777等,均对腺病毒十分易感,50MOI可使近100%的细胞被感染〔9〕。作者曾在军事医学科学院百环生物医学研究中心吴祖泽院士指导下,以腺病毒载体介导绿色荧光蛋白基因作为标记基因,也证实3个人的肝癌细胞系HepG2、SMMC7721、BEL-7402,一个胆管癌细胞系QBC939,一个正常肝细胞系L02,均对腺病毒易感,50MOI可使90%左右的靶细胞受感染。Castell等〔10〕利用携带LacZ基因的腺病毒体,感染体外原代培养的正常肝细胞,结果证实:肝细胞对腺病毒十分易感,15MOI感染1 h,可使80%的肝细胞受感染,20MOI感染1 h可使100%的肝细胞受感染;导入的目的基因可以在肝细胞内高效表达;感染腺病毒后,并不影响肝细胞的正常生化功能,如肝细胞的尿素合成、胞膜蛋白合成、生物转化活性等,认为使用腺病毒载体进行肝脏疾病的基因治疗,是十分有效的工具载体。但有实验表明大剂量腺病毒载体对肝功能还是有影响的〔11〕,随感染病毒量的加大,肝脏的毒性作用也加大,且感染腺病毒的靶细胞刺激机体产生免疫反应,从而使腺病毒的转化效率降低,限制了重复使用。使用逆转录病毒载体进行肝脏疾病的基因治疗,也有其有利之处:因逆转录病毒只感染处于复制、分裂期的细胞,而处于非复制期的细胞则不受感染。因肿瘤细胞多处于分裂期,而肿瘤周围的正常肝细胞多处于静止期,故逆转录病毒载体具有一定的靶细胞特异性〔4〕。Kitten等〔12〕使用逆转录病毒载体,通过门静脉注入大鼠肝内,有46%±17%的肝细胞受到感染,随病毒滴度的升高,细胞的转导效率也 增加。虽然逆转录病毒载体能将目的基因有效地导入肝癌细胞内,对肝脏这样的低分裂组织局部应用较为合适,但系统体内(in vivo)法应用,就会对骨髓、生殖细胞、肠上皮细胞等分裂增殖旺盛的组织,产生致死性杀伤作用,有产生与放、化疗相似副作用的危险。对于原发性肝细胞癌,癌细胞的增殖生长一般比较缓慢〔12〕,因此使用逆转录病毒载体可能转化效率较低,但对于肝转移癌,因为细胞增殖较为旺盛,故使用逆转录病毒载体较为合适。对于使用腺相关病毒载体进行肝癌的基因治疗,目前还研究较少,但腺相关病毒无致病性,有广泛的宿主范围,能感染不分裂的S期细胞,并能整合到宿主DNA的特异部位中,故减少了发生插入突变的危险性。Su等〔5〕使用AAV介导AFP/HSV-TK基因,证实目的基因能在肝癌细胞中高效表达,并具有杀伤肝癌细胞的作用。
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白细胞介素12融合基因联合白细胞介素2对肝癌的基因治疗
我们在肝癌基因治疗目的基因筛选的实验中发现,在大鼠肝癌模型中,IL-12的基因治疗作用为显著[1,2],若同时联合IL-2,有望进一步提高对肝癌的治疗效果.1.材料与方法:大鼠肝癌细胞株CBRH3由中科院细胞所谢弘教授惠赠.以质粒GCp35Ep40PN为模板,PCR分别扩增p35和p40亚基基因.以PCR产物为模板,用p40上游引物和p35下游引物再次进行PCR反应,构建mIL-12融合基因.mIL-12和hIL-2基因分别插入逆转录病毒载体GCXEXPN,命名为GCIL12EXPN和GCXEIL2PN、GCIL12E-IL2PN.按常规方法筛选逆转录病毒载体GCIL12EXPN、GCXEIL2PN、GCIL12E-IL2PN的PA317包装细胞株,测病毒滴度.用CBRH3建立大鼠接种肝癌模型,分为生理盐水、LacZ载体对照组和IL-2、IL-12、IL-12+IL-2治疗组,每组10只大鼠,将包装细胞株脾内注射进行治疗.方差分析结果.
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基因体内导入法与肝癌基因治疗
研究表明,基因导入方法在实现基因治疗目的上起关键性作用,本文就肝癌基因治疗中基因体内导入方法的应用作一综述.
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肝干细胞作为肝癌靶向基因治疗载体的体内实验研究
肝癌基因治疗作为现代分子药物治疗,为肝癌的治疗带来了新的前景,但目前肝癌基因治疗的研究结果尚不能令人满意,缺乏良好的基因转移载体是其重要原因[1],改进现有思路,提供一个靶向肝癌细胞的新的基因转移策略十分必要.
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肝癌基因治疗的发展趋势及其思考
1 肝癌基因治疗的策略按作用机制的不同,肝癌的基因治疗可分为反义基因治疗、抗癌基因治疗、免疫基因治疗及药物基因治疗.
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肝癌基因治疗策略
肝癌作为常见的肿瘤之一,临床上常用的治疗方法有:手术肝叶切除,原位肝移植,经导管肝动脉栓塞术,经皮无水酒精注射,肝动脉化疗或联合治疗.然而这些方法的应用均有一定的局限性,基因治疗是应用理化或病毒介导的DNA转移方法,将正常有功能的基因置换缺陷基因或将新的基因转移到靶细胞内,使其表达而发挥作用.目前,肝癌基因治疗虽处于不成熟阶段,但日益受到人们的关注,其应用前景颇为乐观.本文就肝癌基因治疗策略的研究进展作一综述.
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肝癌基因治疗研究进展
肝癌是常见且死亡率较高的恶性肿瘤之一,我国为肝癌高发国家,每年新发患者在10万以上,死亡率高,生存期短,严重威胁人民健康.在我国以HBV与肝癌发生的关系为显著.肝癌临床上手术切除率低,对放、化疗敏感性差,转移情况普遍,预后极差,迫切需要新的治疗方法[1].近年来随着人们对肝癌分子病理机理研究的不断深入,为正在兴起的肝癌基因治疗提供了理论依据,促进了人们用分子手段治疗肝癌的探索性研究[2].癌基因和抑癌基因是研究癌变分子机制的中心问题,寻找更具特异性和普遍性的肝癌抗原是解决基因治疗靶向性的关键,根据疾病和患者的具体情况选择合适的基因转运系统和调控元件是未来基因治疗的方向[3].
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肝癌基因治疗研究进展
原发性肝癌恶性程度高,预后差,治疗效果不理想,迫切需要研究和发展新的治疗方法.肿瘤基因治疗是近年来研究的热点,国内外学者对肝癌基因治疗做了大量工作[1,2],虽然目前肝癌基因治疗尚处于体外研究和动物实验阶段,但亦取得了一些令人鼓舞的结果.
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原发性肝癌基因治疗目的基因筛选的初步研究
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肝癌基因治疗研究
原发性肝癌是我国特别高发的恶性肿瘤,手术切除仍是治疗肝癌的首选方法,但总体疗效不理想,迫切需要研究和发展新的治疗方法.肿瘤基因治疗是近年来研究的热点,国内外许多学者针对肝癌基因治疗做了大量工作,虽然目前肝癌基因治疗尚处于体外研究和动物实验阶段,但取得了一些令人鼓舞的结果.
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血管内皮生长因子-C短发夹RNA对肝癌细胞的抑制作用
我们通过构建靶向血管内皮生长因子(VEGF)-C的短发夹RNA(shRNA)质粒载体,观察其对肝癌细胞增殖及侵袭转移能力的抑制效应,探讨靶向VEGF-C的RNA干扰(RNAi)应用于肝癌基因治疗的可行性[1].
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肝癌基因治疗策略研究进展
自60年代末提出基因治疗概念以来,其初设想主要包括修复突变或缺失的基因以及导入治疗基因,随着近十年来对癌基因认识的深入及转基因技术的日趋完善,肝癌的基因治疗策略也得以不断丰富和发展,如自杀基因及反义技术的运用等。现就这一领域的国内外研究进展作一综述。 一、 反义疗法 肝癌的发生、发展过程中可以检测到许多癌基因及生长因子基因产物的大量表达,运用反义技术可以抑制这些产物的过度表达,从而抑制肿瘤的生长。目前肝癌基因治疗中采用的反义技术主要是反义寡核苷酸技术和核酶技术。 反义寡核苷酸技术是采用与某一些癌基因或生长因子基因互补的RNA或DNA,将其导入肝癌细胞后,可与靶基因的mRNA或其前体hn mRNA互补结合,影响mRNA的成熟及翻译,达到抑制靶基因表达的作用。Huang等[1]用可表达c-ets-2、c-myc、及N-ras基因反义RNA的重组逆转录病毒导入人肝癌细胞系SMMC-7721,经G418筛选,转基因肝癌细胞70%生长停滞于G0/G1期,在软琼脂上集落形成能力以及在裸鼠体内的致瘤能力均明显受到抑制;近来分别有学者将胰岛素样生长因子Ⅰ、Ⅱ(IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ)反义基因导入肝癌细胞系后,也均检测到肿瘤细胞的生长及致瘤能力下降,并表明这可能是由于IGF表达受抑引起肝癌细胞凋亡的缘故[2,3]。
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肝癌基因治疗研究进展与介入医学
目前研究表明肝癌的发生是一个多步骤的复杂过程,在这个过程中,有多种癌基因和抑癌基因的改变,肝癌的癌基因谱已逐渐明朗.肝癌的基因治疗是目前学术界研究的热点,已取得了很大的进展.本文综述肝癌基因治疗的研究进展并对介入医学在肝癌基因治疗中的地位和作用作一展望.
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磁性阳离子纳米脂质体的制备及其性能表征
目的 探讨磁性阳离子纳米脂质体的制备方法及其性能特征.方法 采用薄膜分散法制备磁性阳离子纳米脂质体,并且对其形貌、粒径、磁场响应性、细胞毒性进行表征.结果 薄膜分散法制备磁性阳离子纳米脂质体方法简单易行,制备的磁性阳离子纳米脂质体的形貌呈球形,平均粒径为98 nm;且具有超顺磁性,在水溶液中的磁场响应性能良好;MTT实验表明磁性阳离子纳米脂质体是毒性较小的基因转染载体.结论 薄膜分散法制备的磁性阳离子纳米脂质体粒径小、分布均匀、细胞毒性小,将可作为肝癌基因治疗一种理想的非病毒转染栽体.
关键词: 磁性阳离子纳米脂质体 肝癌基因治疗 基因转染 表征 -
肝癌基因治疗的基础研究与临床应用
肝癌基因治疗发展至今已有30余年,基因治疗的策略、载体和治疗基因随着科学的发展不断更新.近年来由于基础研究的重要突破,肝癌基因治疗逐步由基础研究走向临床治疗,并在临床实践过程中不断积累经验,不断成熟.本文将结合自身工作就肝癌基因治疗的基础研究与临床应用作一简短综述.
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肝癌基因治疗研究近况
肝癌是全球恶性程度极高、预后极差的恶性肿瘤之一,在我国肝癌目前已处于恶性肿瘤死亡率的第2位[1].尽管目前肝癌的治疗方法有许多种,但治疗效果都十分有限,并未显著延长病人的生存期.肝癌的发生、发展涉及多方面多层次的问题,随着分子生物学和免疫学理论及技术的不断发展,对癌基因的认识不断深入,以及转基因技术的日趋完善,肝癌的基因治疗领域已显示出一定的前景.本文就目前肝癌基因治疗的研究现状和发展趋势作一综述.
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PNP-TK融合自杀基因及PNP单自杀基因对肝癌细胞杀伤效率
目的 分析PNP-TK融合自杀基因系统及PNP单自杀基因系统对肝癌细胞的杀伤作用及二者对肝癌细胞潜在的杀伤机制. 方法构建融合基因表达载体pcDNA3.0/PNP-TK,经酶切、PCR及测序鉴定重组体,G418筛选获得稳定转染了pcDNA3.0/PNP-TK的HepG2细胞克隆.RT-PCR和Western Blotting检测融合基因在HepG2细胞中的表达.台盼兰排斥法检测细胞的生长曲线,MTT法检测细胞对相应前药的敏感性及分别在一种和两种前药作用下所导致的旁观者效应.结果 融合基因片段PNP-TK正确插入了pcDNA3.0载体中,pcDNA3.0/PNP-TK在肝癌细胞株HepG2中实现了表达.抗性细胞克隆对相应的前药十分敏感.在两种前药的联合作用下,pcDNA3.0/PNP-TK所导致的旁观者效应明显强于只给予MeP-dR一种前药以及pcDNA3.0/PNP单基因系统所致的旁观者效应.结论 具有双自杀基因功能的表达载体pcDNA3.0/PNP-TK对肝癌细胞的杀伤效果优于PNP单自杀基因系统.