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反义基因治疗乙型肝炎研究近况
反义技术为乙型肝炎治疗提供了新策略,其中反义RNA与核酶具代表性.HBV的S与C区似乎是反义RNA抗HBV的佳靶区;核酶库的构建、核酶的改造及多聚体核酶的设计促进了核酶抗HBV的研究进展.HBV感染动物模型研究有助于推动反义基因治疗乙型肝炎向临床的过渡.
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α2,6-唾液酸转移酶 (ST6Gal I) 的表达对结肠癌细胞唾液酸化的影响
目的研究结肠癌细胞LS174T转染正义和反义的α2,6唾液酸转移酶(ST6Gal I)cDNA对结肠癌细胞表面唾液酸化及肿瘤细胞粘附功能的影响.方法结肠癌细胞株LS174T转染正义ST6Gal I cDNA或反义ST6Gal I cDNA的部分序列的表达载体pcDNA3.1, 以RT-PCR检测转染子ST6Gal I mRNA的表达, 流式细胞仪检测细胞表面α2,6唾液酸含量. 结果转染正义ST6Gal I cDNA的克隆显示ST6Gal I mRNA的表达增强以及接骨木凝集素(SNA)与细胞表面成分的结合增加;而转染反义ST6Gal I cDNA的部分序列的细胞克隆的ST6Gal I mRNA的表达减少, SNA与细胞表面成分的结合力降低. 结论 ST6Gal I的表达直接影响细胞表面α2,6-连接的唾液酸水平并调节肿瘤细胞的粘附功能. 利用反义核酸技术抑制ST6Gal I的表达并降低肿瘤细胞表面α2,6-唾液酸水平可能成为减少癌细胞转移的一种手段.
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单羧酸转运蛋白基因对肿瘤细胞内pH值及生长特性的调节作用
目的 以反义技术抑制肿瘤细胞的单羧酸转运蛋白基因第一亚型(MCT1)表达,观察其对肿瘤细胞内pH值(pHi)调节、乳酸转运及生长性质的影响.方法 (1)应用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)从人肺癌细胞系A549中扩增MCT1目的 基因片段,将克隆的基因片段反向插入逆转录病毒载体pLXSN,构建反义表达重组载体pLXSN-MCT1,并对其进行DNA测序验证.(2)通过电穿孔法将pLXSN、重组载体pLXSN-MCT1转染于肺腺癌细胞系A549中,经G418筛选转染细胞阳性克隆.用PCR方法 鉴定pLXSN-MCT1重组载体在基因组的转染整合及表达;以分光光度法测定细胞内pH及乳酸含量变化,并以细胞生长曲线研究细胞的生长情况.结果 (1)对所构建的重组载体进行双酶切电泳分析及DNA序列分析证明反义载体构建成功.(2)与未转染的A549细胞比较,转染MCT1反义表达重组体的细胞pHi降低、乳酸显著升高(P＜0.001);且细胞的生长受到明显抑制.结论 单羧酸转运蛋白MCT1基因在肿瘤细胞pHi调节、乳酸转运及细胞的生长中起着重要的调节作用.
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微小RNA-375调控NIT-1胰岛细胞脂性凋亡
目的 探讨提高或降低内源性微小RNA-375(miRNA-375)的水平是否影响小鼠胰岛β细胞NIT-1的脂性凋亡.方法 以500μmol/L长链不饱和游离脂肪酸棕榈酸孵育NIT-1 48 h,建立脂性凋亡模型,并以蛋白免疫印迹法(Western blot)检测重组胰岛素样生长因子1(V1)表达水平.将NIT-1分为:空白组(正常培养细胞),空转组(等量lipo 2000),阴性对照miRNA组(等量lipo 2000+阴性对照miRNA),miRNA-375组(等量lipo 2000+miRNA-375)(提高内源性miRNA-375水平),2'-O-me-375组(等量lipo 2000+2'-O-me-375)(降低内源性miRNA-375水平).在2 ml转染体系,通过转染脂质体lipo 2000 5 μl(空白组不加),以80 nmol/L miRNA或对照物(空转组不加)转染NIT-1,72 h后各组分别予500μmoL/L棕榈酸孵育48 h.72 h后各组分别予500μmol/L棕榈酸孵育48 h.以Hochest 33342染色和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测并计算凋亡率,以Western blot检测V1表达水平.结果 棕榈酸组凋亡细胞数明显比对照组增多,而V1表达水平比对照组下降约66.8%(t=5.051,P＜0.0001).与其他三组比较,miRNA-375组脂性凋亡率高,比空白组升高73.7%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001),比阴性对照miRNA组升高1.47倍(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001).miRNA-375组V1表达水平降低,比阴性对照miRNA组降低56.06%(P＜0.05).而另一方面,与其他三组比较,2'-O-me-375组脂性凋亡率低,比空白组降低64.7%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001),比阴性对照miRNA组下降49.6%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P=0.001).2'-O-me-375组V1表达水平高,比空白组升高5.33倍(P＜0.0001),比阴性对照miRNA组升高75.9%(P=0.021).结论 棕榈酸诱导小鼠胰岛细胞凋亡伴有V1表达水平下降;miRNA-375参与调节小鼠胰岛β细胞的脂性凋亡.
关键词： RNA干扰 脂性凋亡 微小RNA-375 Myotrophin 反义技术 -
PCNA反义cDNA基因转导抑制人膀胱癌细胞增殖的研究
目的 探讨增殖细胞核抗原(PCNA)基因反义cDNA对人膀胱癌细胞体外增殖活性的抑制作用。 方法 构建PCNA反义cDNA真核表达载体并转染膀胱癌EJ细胞, 通过细胞生长曲线、MTT比色分析、H3-TdR掺入法检测癌细胞增殖活性, 流式细胞仪（FCM）分析细胞周期时相变化，SABC免疫组化观察癌细胞PCNA蛋白表达水平。 结果 PCNA反义cDNA导入后, 膀胱癌EJ细胞生长速率显著减慢（P<0.01），增殖活性抑制率59.02%（P<0.05），DNA合成速率降低52.31%(P<0.01)，S期细胞减少， 细胞周期阻滞于G0/G1期， PCNA蛋白表达显著减弱(P<0.05)，差别均有显著性意义。 结论 PCNA反义cDNA基因转导能有效抑制膀胱癌细胞的PCNA蛋白表达及体外增殖活性, 为肿瘤基因治疗提供了有效途径。
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反义TGF-β1抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖的研究
目的应用反义技术抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞(KF)体外增殖,为应用基因治疗手段改善创伤愈合提供实验依据.方法应用脂质体将反义TGF-β1转染至KF,通过细胞计数绘制细胞生长动力学曲线,流式细胞仪检测细胞的凋亡情况.结果①转染反义TGF-β1的KF体外增殖明显降低.②与未转染反义TGF-β1的KF相比,转染反义TGF-β1的KF凋亡发生率明显增高(差异有显著性意义,P＜0.05).结论反义TGF-β1可抑制体外培养的KF增殖,并促进KF的凋亡.
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反义技术逆转多药耐药的现状与展望
多药耐药(multidrug resistance,MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药的同时,对其他结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药的现象,是导致化疗失败的主要原因.
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TGFα、EGFR反义寡聚核苷酸对大肠癌生长的抑制作用
研究转化生长因子α(TGFα)、表皮生长因子受体(EGFR)反义寡聚核苷酸(ASODN)对人大肠癌生长增殖的作用.反义TGFα、反义EGFR及无关对照ODN经阳离子脂质体包裹后转染人大肠癌HR8348细胞.采用噻唑蓝比色法(MTT法),细胞周期分析,裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化.与对照组HR8348细胞相比,经TGFα反义ODN处理的HR8348细胞体外增殖速度减慢(抑制率达80%)、DNA合成受抑、裸鼠体内成瘤率下降(25% ∶ 100%).经EGFR反义ODN处理的HR8348细胞也得到了类似的结果.TGFα反义ODN、EGFR反义ODN均能有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖.
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一条肺癌多药耐药相关基因的功能鉴定及染色体定位
目的进一步分析从肺癌多药耐药细胞株(SPC-A-1/CDDP)克隆出的差异表达基因染色体的定位,并鉴定其耐药相关功能.方法登录美国国家生物技术信息中心网(www.ncbi.nlm.nih.gov),根据克隆的目的基因序列数据,查询人类基因库,分析确定该基因在人类染色体上的位置.以DNA重组技术构建该目的基因的反义表达载体,电穿孔法将其转染多药耐药细胞株SPC-A-1/CDDP,采用半定量RT-PCR研究该基因表达受抑情况,并以MTT法分析转染细胞对几种化疗药物的敏感性改变.结果电子信息学确定该目的基因定位在人类染色体的19q13.3～19q13.4位点上.成功构建该基因的反义表达载体,转染反义表达载体的SPC-A-1/CDDP细胞的目的基因mRNA含量明显减少,即基因表达受抑.MTT药敏测试发现转染了反义表达载体的SPC-A-1/CDDP细胞对顺铂、阿霉素、5-氟尿嘧啶、长春新碱、足叶乙苷和丝裂霉素6种化疗药物的耐药指数分别是3.87、3.28、6.71、2.65、2.11、5.02;对前五种化疗药物的耐药指数与对照细胞相比分别下降了2～3倍.表明该基因与肿瘤细胞的化疗敏感性密切相关.结论该差异表达基因是一条肺癌耐药相关新基因,其在人类染色体的位置为19q13.3～19q13.4.
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反义技术及其抗HBV研究进展
反义技术是采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基 因组的技术手段，包括反义DNA、反义RNA及核酶等。反义分子通过与靶基因异性互补配对结 合，阻断靶基因的复制、转录或翻译过程，从而发挥抗病毒作用。本文就反义核酸抗HBV研 究进展作一综述，就反义核酸抗HBV存在的问题及发展趋势作一讨论。
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DNAzymes针对Ezrin mRNA的反义技术靶点筛选及验证
目的 分析肿瘤远处转移相关蛋白(Ezrin mRNA)的结构,寻找并验证DNAzymes作用的佳靶点.方法 利用RNAstructure与RNAdraw程序分析Ezrin mRNA结构,计算其一、二级结构,两种程序同时计算出碱基未配对的单链成环区,且连续存在4个以上,则将其设为反义技术的靶区域,在此区域内设计DNAzymes的作用靶点,再依据低自由能原则,运用计算机中的OligoWalk程序进行筛选,以此方式得到各反义技术的作用靶点,以实验方法验证预测结果.结果 两种软件预测的共同的单链区共42个,其中完全匹配的单链区21个,编码区具27个.AU1655、AU1751、AU 1766、AU1789及GU2623位于连续未配对碱基超过10个的单链区,仅AU1655、AU1751、AU 1766、AU1789符合要求.酶切反应结果显示DNAzymes在AU1751位点能够为理想地切割Ezrin mRNA.结论 相对于传统的单纯依靠实验来寻找靶点,核酸二级结构联合热动力学参数能够更精确、快速地处理靶点的设计和选取问题.AU1751位点相对应的DNAzymes不易形成稳定的自身杂合体,有利于DNAzymes结合RNA.
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RNAi干涉技术与神经生物学的实验研究
RNA干涉是双链RNA在细胞内介导的同源序列的mRNA转录后表达抑制,导致基因沉默.它是一种比反义技术更为有效的方法,具有更高的特异性.自从其问世以来,在肿瘤研究.遗传性疾病,基因诊断,基因治疗以及药物设计等领域得到快速发展和广泛应用.在神经生物学及神经性疾病的应用研究方面,RNA干涉技术也显示了独特的优势,如神经的发生发育过程研究及神经退行性疾病的治疗等.本文就RNA干涉技术在神经生物学领域的实验及应用研究做一综述.
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mTOR反义RNA真核表达载体的构建及其在血管平滑肌细胞中的表达
目的:构建哺乳类动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的反义RNA真核表达载体,观察其对血管平滑肌细胞(VSMC)功能的影响.方法:提取人VSMC总RNA,反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)扩增mTOR基因cDNA序列,经pGEM-T载体克隆后双酶切,将cDNA序列反向插入绿色荧光蛋白表达载体pEGP-C1,构建mTOR基因反义RNA真核表达载体.转染VSMC,采用Westem blot法检验反义表达载体对mTOR蛋白表达的影响,流式细胞仪检测细胞周期的变化.结果:经RT-PCR获得664 bp产物,T载体克隆后,经DNA测序,确定该片段为mTOR基因cDNA,进而构建反义RNA真核表达载体pEGFP-C1-mTOR,测序证明序列正确后转染VSMC,证实其能够显著抑制mTOR蛋白产物表达,VSMC的分裂、增殖过程受阻.结论:已经成功构建mTOR基因的反义RNA真核表达载体.
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反义基因治疗白血病的研究现状
白血病是一种细胞恶性克隆性疾病,分子水平的靶向治疗成为研究的热点问题.反义核酸技术是近十年来研究比较活跃的一个领域.它包括反义DNA、反义RNA、核酶(ribozyme)和三股螺旋DNA(DNA-Trip-lex).反义技术用于白血病是利用AS ODN下调目的基因,抑制细胞增殖,诱导其凋亡,增强白血病细胞对化疗药物的敏感性,改善其耐药性.现就反义核酸技术在白血病治疗中的应用现状作一综述.
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查美尼克在分子生物学方面的贡献
查美尼克是分子生物学的奠基人之一,第一个开发了无细胞蛋白质合成体系,发现了蛋白质合成中氨基酸ATP活化机制,发现了tRNA及其在基因表达中的作用,特别是发明的反义技术创造了一个新的生物技术原理.通过查美尼克的成就我们可以对分子生物学历史面貌有一个了解从而对生命科学的发展有一个新的视点.
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转录后水平的基因沉默技术在HSP47中的应用
热休克蛋白47(47 kDa heat shock protein,HSP47)是位于内质网内一种应激蛋白,它能与胶原特异性结合,在哺乳动物细胞内参与原胶原的折叠、装配、修饰、转运等过程.除了应激诱导之外,在正常情况下HSP47的表达通常与各种细胞组织中的胶原相关.HSP47先在内质网内与前胶原暂时结合,到达高尔基体后与胶原分离.因此HSP47作为胶原特异性的分子伴侣可能具有如下功能:防止原胶原链聚合,影响原胶原的修饰,抑制胞内原胶原的降解,参与应激状态下调控机制,以及影响原胶原从内质网到高尔基体的分泌过程等[1].近年来,随着研究人员对HSP47功能认识的深入和基因沉默技术的日趋成熟,已经有学者利用基因沉默技术来研究HSP47的功能,通过降低或抑制HSP47的基因表达,观察相关的组织器官病理学改变及可能具有的潜在临床价值.本文主要就近年来国内外对基因沉默技术及其在HSP47功能研究中的应用进展做一概述.
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反义寡核苷酸类药物及给药系统的研究
与传统药物相比,反义寡核苷酸(ASODN)类药物具有高特异性、高效性,低毒、安全,易于设计适合对照物以及合成相对较易等诸多优点.但由于这类药物在体内易被酶降解且细胞透过率较低,临床应用受限.为了解决这些缺陷,一方面通过对ASODN类药物自身结构进行修饰和改造,以提高稳定性和细胞透过率,另一方面通过药物传递系统来帮助ASODN类药物躲避酶的识别,并使之具有一定靶向性,终使更多的ASODN类药物能应用于临床.
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BHRF1反义寡核苷酸对BHRF1-CNE2细胞生存能力的影响
目的:探讨BHRF1反义寡核苷酸对表达BHRF1的鼻咽癌细胞株CNE2生存能力的影响.方法:检测反义阻断BHRF1表达后BHRF1-CNE2细胞在喜树碱作用下增殖能力和凋亡指数的变化.结果:在喜树碱作用下,应用BHRF1反义寡核苷酸组的癌细胞较对照组的增殖率下降,凋亡率增高.结论:反义阻断BHRF1的表达可降低CNE2细胞的生存能力,这在鼻咽癌的治疗中可能具有一定的价值.
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反义寡核苷酸技术的进展及应用
随着分子生物学和遗传工程的发展,基因治疗应运而生,得到广泛的肯定,其中包括反义核酸技术,简称反义技术.那些能与特定的DNA或RNA以碱基互补配对的方式结合,并阻止其转录和翻译的短核酸片段,称为反义寡核苷酸(antisense oligonucleotide).研究反义寡核苷酸作用机理和应用的技术叫反义技术.
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反义寡核苷酸防治血管吻合口内膜增生性再狭窄的机制探讨
目的探讨医用生物蛋白胶携载c-myc反义寡核苷酸防治血管吻合口内膜增生性再狭窄的机制.方法将8只新西兰大白兔颈外静脉间置于同侧颈总动脉后,随机分成实验组及对照组.对照组静脉间置后即缝合伤口;实验组将300μg反义c-myc涂于2.5 ml医用生物蛋白胶中,并均匀涂于血管吻合口外周.术后7 d取材,提取组织总RNA,进行RT-PCR和Northern Blot分析,图像扫描后进行计算机分析.结果RT-PCR显示实验组的c-myc扩增产物量明显低于对照组,产物半定量分析提示两者差异有显著性(P＜0.01);Northern Blot图像扫描分析显示实验组的积分密度值(2.25±0.16)明显低于对照组(4.63±0.48)(P＜0.05).结论反义c-myc可通过碱基互补与其相应基因结合,封闭该基因的表达,使其促细胞增殖作用减弱,终达到防治血管吻合口内膜增生性再狭窄的目的.
