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长期接触高浓度游离脂肪酸对大鼠胰岛β细胞凋亡的影响
目的 研究高浓度游离脂肪酸(FFA)对大鼠胰岛β细胞凋亡的影响.方法 将胰岛β细胞长期的暴露在高浓度的游离脂肪酸(2 mmol/L,油酸/ 软脂酸 2∶1)下,观察胰岛β细胞的凋亡情况.主要通过2种方法来评价凋亡的情况:①膜联蛋白V标记偶联异硫氰酸荧光素(annexin-V FITC)和碘化丙啶(PI)对细胞进行染色;②酶联免疫吸附测定法(ELISA)来定量细胞质中的DNA片段.结果在高浓度的游离脂肪酸的持续培养下:①培养5 d之后,被annexin-V FITC和PI双染的细胞数量明显增多.在第7天,高浓度FFA接触组的凋亡细胞数量与对照组的差异显著,为18.8%±4% 与5.6%±2%,(n = 5;P<0.001).②PI确定的坏死细胞的数量在两组中没有差异,高FFA组与对照组分别为4.8%±0.3% 和 4.5%±0.5%.③通过对培养的细胞进行酶标记免疫吸附测定法,得到高FFA组的凋亡细胞要明显多于对照组(1.97±0.6 与 0.49±0.1,n=5;P<0.001).结论 长期接触高浓度游离脂肪酸处理过的细胞,与对照组相比,会有较多的细胞凋亡和DNA片段.长期接触高浓度游离脂肪酸会造成胰岛β细胞脂性凋亡,因此可推测在2型糖尿病患者体内经常会出现的β细胞功能的丧失与体内的高FFA有关,可能涉及到氧化应激方面的机制.
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微小RNA-375调控NIT-1胰岛细胞脂性凋亡
目的 探讨提高或降低内源性微小RNA-375(miRNA-375)的水平是否影响小鼠胰岛β细胞NIT-1的脂性凋亡.方法 以500μmol/L长链不饱和游离脂肪酸棕榈酸孵育NIT-1 48 h,建立脂性凋亡模型,并以蛋白免疫印迹法(Western blot)检测重组胰岛素样生长因子1(V1)表达水平.将NIT-1分为:空白组(正常培养细胞),空转组(等量lipo 2000),阴性对照miRNA组(等量lipo 2000+阴性对照miRNA),miRNA-375组(等量lipo 2000+miRNA-375)(提高内源性miRNA-375水平),2'-O-me-375组(等量lipo 2000+2'-O-me-375)(降低内源性miRNA-375水平).在2 ml转染体系,通过转染脂质体lipo 2000 5 μl(空白组不加),以80 nmol/L miRNA或对照物(空转组不加)转染NIT-1,72 h后各组分别予500μmoL/L棕榈酸孵育48 h.72 h后各组分别予500μmol/L棕榈酸孵育48 h.以Hochest 33342染色和脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记法(TUNEL)检测并计算凋亡率,以Western blot检测V1表达水平.结果 棕榈酸组凋亡细胞数明显比对照组增多,而V1表达水平比对照组下降约66.8%(t=5.051,P＜0.0001).与其他三组比较,miRNA-375组脂性凋亡率高,比空白组升高73.7%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001),比阴性对照miRNA组升高1.47倍(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001).miRNA-375组V1表达水平降低,比阴性对照miRNA组降低56.06%(P＜0.05).而另一方面,与其他三组比较,2'-O-me-375组脂性凋亡率低,比空白组降低64.7%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P＜0.0001),比阴性对照miRNA组下降49.6%(Hochest:P＜0.0001;TUNEL:P=0.001).2'-O-me-375组V1表达水平高,比空白组升高5.33倍(P＜0.0001),比阴性对照miRNA组升高75.9%(P=0.021).结论 棕榈酸诱导小鼠胰岛细胞凋亡伴有V1表达水平下降;miRNA-375参与调节小鼠胰岛β细胞的脂性凋亡.
关键词： RNA干扰 脂性凋亡 微小RNA-375 Myotrophin 反义技术 -
JNK/c-Jun信号通路对非酒精性脂肪性肝炎脂性凋亡的影响
非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是非酒精性脂肪性肝病的一个重要病理阶段,其可以发展为肝硬化,甚至肝细胞癌,对疾病的进展起决定性作用.对NASH发生、发展机制的研究普遍接受"二次打击"学说.其中,肝细胞脂毒性凋亡是NASH的一个重要病理组织学特征.c-Jun氨基端激酶(JNK)是丝裂原活化蛋白激酶家族的成员.JNK/应激活化蛋白激酶应激信号通路与NASH的发病机制密切相关,在NASH中多种应激刺激都能激活肝脏内的JNK信号通路,诱导细胞凋亡.
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脂毒性导致胰岛β细胞衰竭的机制
脂毒性可通过抑制β细胞胰-十二指肠同源盒因子-1(PDX-1)和肌腱膜纤维肉瘤癌基因同源核A(MafA)的表达,使胰岛素基因表达减少,并通过上调同醇调节元件结合蛋白-1c(SREBP-1c)激活其下游靶分子,导致β细胞胰岛素分泌功能受损.脂毒性还可通过激活氧化应激、导致各种凋亡因子失衡、内质网应激、microRNA途径引起β细胞凋亡.
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ERp46在棕榈酸诱导的内质网应激中的保护作用
探讨新发现的内质网蛋白ERp46对棕榈酸诱导的βTC6细胞“内质网应激-凋亡”通路的可能调控作用,为治疗2型糖尿病提供新思路.结果显示ERp46对内质网应激的三条通路均有抑制作用,进而减少βTC6细胞的凋亡率,对细胞起保护作用(P＜0.01).
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肾气丸对非酒精性脂肪性肝炎大鼠肝细胞脂性凋亡的影响
[目的]探讨肾气丸对高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)大鼠肝细胞脂性凋亡的影响.[方法]采用高脂饲料连续喂养12周建立大鼠NASH模型,40只大鼠随机分为4组,正常组予以标准饲料喂养,其余3组进行高脂饮食造模,除模型组外,其他2组分别以肾气丸、二甲双胍进行干预12周.全自动生化仪检测血脂及血清酶学,ELISA法检测血清游离脂肪酸( FFA)水平；苏木精-伊红染色光镜下观察肝组织病理学变化,计算非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)炎症活动度积分(NAS);TUNEL法检测肝细胞凋亡水平,计算凋亡指数(AI).[结果]NASH模型组大鼠血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸转氨酶(AST)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、FFA水平均较正常组明显增高(P＜0.05,＜0.01),血清三酰甘油(TG)水平较正常组明显降低(P＜0.05),肝组织NAS、AI明显高于正常组(P＜0.01).应用肾气丸和二甲双胍干预后,血清ALT、AST、TC、LDL-C、FFA水平均较模型组明显降低(P＜0.05),血中TG、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05).肝组织NAS和AI较模型组显著降低.相关性分析发现,大鼠肝细胞的AI与肝组织NAS及血清 FFA水平呈明显正相关(均P＜0.01).[结论]NASH大鼠存在着脂质代谢紊乱和肝细胞的脂性凋亡.肾气丸与二甲双胍作用相似,可能是通过调节脂质代谢,影响FFA,阻断其引发的促肝细胞脂性凋亡的级联启动,从而有效地防治NASH的进展.
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肾气丸对非酒精性脂肪性肝炎大鼠Bcl－2／Bax、Fas／FasL信号通路的影响
目的：观察Bcl－2／Bax、Fas／FasL介导的信号转导通路在高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎大鼠的作用及肾气丸对其的影响。方法：采用高脂饲料连续喂养12周建立大鼠非酒精性脂肪性肝炎模型，同时以肾气丸进行干预12周。 HE染色观察大鼠肝组织病理组织学变化，免疫组织化学检测肝组织中Fas、FasL、Bcl－2、Bax、Caspase－8蛋白的表达； Realtime－PCR法检测肝组织Caspase－8 mRNA表达。结果：模型组大鼠肝组织Bcl－2、Bax、Fas、FasL蛋白以及Caspase－8 mRNA和蛋白表达均较正常组显著增加（P＜0．01），Bcl－2／Bax比值较正常组明显的降低（P＜0．05）；大鼠肝组织Caspase－8蛋白表达与Fas、FasL蛋白表达均呈明显正相关（ r分别为0．907、0．804，P均＜0．01）；予以肾气丸干预后，Bax、Fas、FasL蛋白的表达以及Caspase－8 mRNA和蛋白的表达均较模型组明显的降低（P＜0．05），Bcl－2／Bax比值较模型组明显的增加（P＜0．05），Bcl－2蛋白的表达与模型组比较差异无显著性意义（P＞0．05）。结论：肾气丸可能通过影响Bcl－2／Bax、Fas／FasL信号转导通路，下调Bax、Fas、FasL、Caspase－8表达，减少肝细胞的脂性凋亡，从而防治大鼠非酒精性脂肪性肝炎的发生发展。
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JNK信号通路对胰岛βTc3细胞脂性凋亡的影响及吡格列酮的干预作用
目的:探讨c-Jun氨基末端激酶(JNK)信号通路对胰岛βTc3细胞脂性凋亡的影响及吡格列酮(PGZ)的干预作用.方法:采用游离脂肪酸(FFA)诱导小鼠13Tc3细胞凋亡;以MTT法观察FFA对细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率;免疫细胞化学和Western Blot法检测在FFA、特异性JNK抑制剂SP600125及PGZ作用下磷酸化JNK(pJNK)、磷酸化c-jun(p-c-jun)的表达.结果:FFA对体外生长的βTc3细胞具有明显抑制作用,并可诱导细胞凋亡,JNK阻断剂及PGZ可显著减少这一过程引起的凋亡;且FFA诱导βTc3细胞凋亡伴随着JNK信号通路中p-JNK和p-c-jun的升高;用SP600125预处理细胞后,可明显减少p-JNK和p-c-jun的活化;而PGZ未能抑制FFA引起的JNK活化.结论:JNK信号通路参与了FFA诱导的小鼠βTc3细胞凋亡;PGZ可明显抑制胰岛βTc3细胞凋亡,但这一过程可能没有通过JNK信号通路.
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二甲双胍对胰岛细胞脂毒性的保护作用
目的 探讨二甲双胍(MF)在游离脂肪酸(FFA)诱导的胰岛细胞凋亡中的作用及机制.方法 采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法观察FFA对小鼠βTc3细胞增殖的抑制作用;流式细胞术检测细胞的凋亡率;免疫细胞化学和Western blot法检测p-JNK、p-c-jun在FFA、特异性JNK抑制剂(SP600125)阻断JNK信号转导通路情况下及MF作用下的表达.结果 FFA对体外生长的βTc3细胞具有明显的抑制作用,并可诱导细胞凋亡;MF可显著减少这一过程中的细胞凋亡.细胞免疫化学及Western blot结果显示,FFA诱导βTc3细胞凋亡伴随着p-JNK和p-c-jun的升高而增加;用SP600125预处理βTc3细胞后,可以明显减少p-JNK和p-c-jun的活化,而MF没有能够抑制FFA引起的p-JNK活化.结论 MF可以抑制FFA介导的小鼠βTc3细胞凋亡,但不是通过JNK信号转导通路发挥作用的.
