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唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14毒力相关基因解析
目的 了解1株引起致死性食物中毒事件的唐菖蒲伯克霍尔德菌椰毒致病型菌株Co14的全基因组序列特征,对其基因组中米酵菌酸(BA)和毒黄素(TF)的生物合成相关基因进行了预测和分析.方法 通过第三代高通量测序技术(PacBio)对Co14进行全基因组测序,使用BLAST软件预测BA和TF的生物合成相关基因.结果 Co14基因组中含有2个闭合的环状染色体,大小分别为4.1和4.0 Mb,鸟嘌呤和胞嘧啶所占比例(GC含量)分别为67.82%和68.32%.Co14基因组中还携带有一个146 kb的闭合环状质粒,GC含量为63.25%,编码149个基因.通过同源序列比对,在Co14染色体1上发现了BA和TF的生物合成相关基因簇bonR1 R2LJKFGABDEHIM和toxRABCDE.结论 Co14全基因组数据为研究唐菖蒲伯克霍尔德菌食物中毒菌株的致病性和毒力因子产生机制奠定了遗传学基础.
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瘦素及其临床功能研究进展
1 瘦素的发现大约40多年前,肯尼迪在其猜想中提到有一种可以调节体重,尤其是脂肪组织数量的激素存在,且这种物质由脂肪组织自身产生,并分泌入血.位于下丘脑的新陈代谢控制中心根据自身设定的标准,监测该物质的血中浓度;如果其浓度超过标准值,中心将采取措施改变能量的摄取或消耗,从而达到机体能量平衡.从那以后,无数生理实验证实了该物质的存在,但却不能探明其真实身份.直至1994年,英国学者Zhang等[1]利用定位克隆技术,首次成功地克隆了遗传性肥胖小鼠(ob/ob小鼠)的肥胖基因及其人类的同源序列.
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利用同源序列确定人GIPC2核心启动子和寻找可能的顺式作用元件
目的 利用同源序列确定人GIPC2核心启动子区和寻找可能存在的基因调控区域.方法 1)利用Vista比对不同物种GIPC2基因编码区和非编码区序列,得到GIPC2同源序列;2)分别构建插入人和大鼠GIPC2翻译起始位点ATG上游不同长度截短片段的重组质粒,转染人HEK293T细胞和大鼠PC12细胞;3)根据报告基因荧光强度推断人和大鼠GIPC2的核心启动子区;4)将人GIPC2内含子区同源序列置于核心启动子前面,构建重组质粒,转染HEK293T,HT-29和PC12细胞,检测启动子活性.结果 人GIPC2核心启动子区确定为+32至+190序列区域;人和大鼠GIPC2 ATG上游一段同源序列有抑制GIPC2启动子活性的功能;人和大鼠GIPC2第一个内含子内的同源序列有促进启动子活性的功能.结论 利用同源序列方法确定了人GIPC2基因的核心启动子区,并且找到能抑制和促进GIPC2启动子活性的可能的顺式作用元件.
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RNA干扰技术治疗恶性肿瘤的靶点选择和靶向导入
一、RNA干扰技术的简介RNA干扰(siRNA)是指小分子双链RNA抑制同源序列的基因表达的现象,是生物进化过程中保留下来的机制.
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HBV核心蛋白结合蛋白1编码基因C1的克隆化
目的:对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白结合蛋白l的基因C1进行克隆化研究.方法:对应用酵母双杂交技术筛选的白细胞中与HBV核心蛋白结合的新蛋白基因,利用分子生物学与生物信息学技术相结合的方法获得新基因的编码序列,根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为C1,在GenBank中注册,注册号为AY555145.结果:C1基因编码区为366个核苷酸(nt),编码产物由121个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性,表明我们克隆的C1基因属于未知功能新基因.结论:成功克隆了HBV核心蛋白结合蛋白新基因C1.
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乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化
目的:研究乙型肝炎病毒前-前-S蛋白结合蛋白新基因PPSBP9的克隆化.方法:构建前-前-S的酵母细胞表达载体,采用酵母双杂交系统筛选人肝细胞cDNA文库,利用核苷酸数据库及生物信息学技术,对于筛选结果进行分析.发现其中有1个未知功能的新基因.根据GenBank中的序列信息设计引物,以HepG2细胞系cDNA文库为模板,以逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)技术扩增获得该新基因的全长编码序列,并经测序证实,命名该新基因为PPSBP9并在GenBank中注册,注册号为AY553877.结果:PPSBP9基因的编码序列全长为840个核苷酸(nt),编码产物由279个氨基酸残基(aa)组成.经核苷酸序列数据库(GenBank)和蛋白质一级结构序列数据库(SwissProt)同源序列的搜寻,与已知基因序列和蛋白序列之间没有显著同源性.结论筛选并成功的克隆了乙型肝炎病毒前-前-S蛋白与肝细胞cDNA文库中结合蛋白新基因PPSBP9,为进一步研究HBV前-前-S及其肝细胞结合蛋白新基因在HBV致病中的作用奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白与载脂蛋白A1结合的研究
目的:为了探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心(core)蛋白在肝脂肪变性中起作用的分子机制,研究了核心蛋白是否与脂肪代谢相关蛋白存在相互作用.方法:应用酵母双杂交系统3,构建HCV核心蛋白诱饵质粒,转化酵母AHl09后与含文库质粒的酵母Y187进行配合,在营养缺陷培养基上进行双杂交筛选.筛选出30个克隆,对能在涂有X-α-gal的四缺营养缺陷培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上生长并变蓝的菌落,提取酵母克隆的质粒转化大肠杆菌后测序,进行生物信息学分析.结果:发现了一个与载脂蛋白Al(apoAl)同源序列,同源性99%.结论:载脂蛋白Al在酵母双杂交中能与HCV核心蛋白相互作用,推测此蛋白参与了脂质代谢紊乱,部分解释了HCV感染后普遍引起肝脂肪变性的发病机制.
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微小RNA介导的基因沉默与神经退行性疾病
微小RNA(microRNA,miRNA) 是一类内源性的22个核苷酸左右的非蛋白编码单链短序列RNA,介导同源序列依赖的基因沉默.目前,miRNA数据库miRBase(16.0版)已收录了人类miRNA 1048个.miRNA及其靶基因构建了细胞内全方位多层次的基因表达调控网络系统,参与众多生命活动的调节并与人类疾病密切相关.miRNA的功能失常在多种神经退行性疾病的发生发展中均具有重要作用.
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瘦素与肝病
1994年Friedman等[1]应用定向克隆法(positional cloning)从肥胖与糖耐量异常的动物ob/ob小鼠中首次成功克隆出肥胖基因(ob gene)及人类的同源序列,人和小鼠之间的ob基因的编码序列同源性高达84%,基因的高同源性提示ob基因及其表达产物功能的高度保守性.ob基因结构和序列的改变可以导致肥胖.Halaas等[2]于1995年应用DNA重组技术,由大肠杆菌中合成出人和小鼠ob基因的表达产物,该产物是一种分泌蛋白,其前体由167个氨基酸残基组成,N末端有21个氨基酸残基信号肽,该前体的信号肽在循环血液中被切掉而成为146个氨基酸,分子量为16 000,由于其基本作用是使动物的体重降低而变瘦,故Halaas等将该蛋白命名为瘦素(leptin).现已发现,瘦素主要由白色脂肪细胞及胎盘、胃等部位表达[3,4],具有中枢性抑制摄食、免疫调节和抑制血管新生作用[5-7].
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瘦素(Leptin)与运动
1 瘦素的生物学1994年Zhang等利用定位克隆技术首次成功地克隆了小鼠的肥胖(Obese,Ob)基因及人类的同源序列[1].Leptin是由肥胖基因Ob编码,脂肪细胞分泌的一种含167个氨基酸组成的蛋白质类激素,在分泌入血过程中,去除其中由21个氨基酸组成的N-端信号肽,形成Leptin.成熟的Leptin含146个氨基酸,分子量为16kD.人和其他种属的瘦素蛋白质有很高的同源性,如与小鼠的同源性为84%,与大鼠的同源性为83%.肥胖基因的克隆具有两方面的重要意义:第一,证实了将近40年前Kennedy[2] 的脂源性因子的假设,尽管人们对脂肪组织还不能象对一个内分泌器官一样完全了解,但这在生理学史上翻开了重要的一章;第二,有力促进了各学科对瘦素生物学的研究,更重要的是促进了对能量平衡的总体生物学的研究.自从Zhang等人[1]首次报道以来,有将近3000篇研究瘦素的文章发表,说明了研究者对此的极大兴趣.
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瘦素及其与肥胖、糖尿病的关系
1994年首次成功克隆出肥胖基因及人类的同源序列[1],Halaas等[2]又于1995年合成出人和小鼠ob基因的表达产物.该产物是一种分泌蛋白,其前体由167个氨基酸残基组成,N末端有21个氨基酸残基信号肽,该前体的信号肽在循环血液中被切掉而成为146个氨基酸,分子质量为16 000,Halaas等将其命名为瘦素(leptin).现将leptin及其与肥胖、糖尿病的关系的研究作简述如下.
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慢病毒载体介导RNAi的研究进展
一、慢病毒及慢病毒载体目前RNAi技术作为一种主要的分子生物学研究手段,被广泛应用于特异性抑制基因的表达研究.RNAi的作用机制表明:双链RNA分子首先被细胞内RNA酶Dicer降解成21~23个碱基大小的小分子干扰RNA(small interfering RNA,siRNA),siRNA结合一个核酶复合物形成RNA诱导沉默复合物(RNA-in-duced silencing complex,RISC),RISC通过碱基配对定位到有同源序列的mRNA上,并在特定位置切割该mRNA,从而抑制该同源基因的表达[1].siRNA被认为是RNAi的主要效应物.
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瘦素与肥胖、糖尿病关系研究
1994年首次成功克隆出肥胖基因及人类的同源序列,Halass等又于1995年合成出人和小鼠ob基因的表达产物,该产物是一种分泌蛋白,其前体由167个氨基酸残基组成,N末端有21个氨基酸残基信号肽,该前体的信号肽在循环血液中被切掉而成为146个氨基酸,分子量为16 000,Halaas等将该蛋白命名为瘦素(lcptin)lcptin.又称苗条素或瘦素基因,现将lcptin及其与肥胖、糖尿病的关系的研究作简述如下.
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骨髓增生异常综合征和急性髓系白血病中转录因子CCAAT/增强子结合蛋白ζ转录本的定量研究
转录因子CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)是一组具有同源序列的转录因子,在细胞增殖、分化、凋亡和免疫调节多种细胞反应中发挥着重要作用[1,2].C/EBPα基因突变如碱基替换、缺失、重复等可见于骨髓增生异常综合征(MDS)和急性髓系白血病(AML)[3].C/EBPζ,又称为生长阻滞和DNA损伤诱导基因3(GADD153)、DNA损伤诱导的转录因子3(DDIT3)、CHOP10,目前对其在各种疾病状态中的表达状况研究甚少.我们在应用cDNA微阵列技术对10例MDS患者的表达谱研究时发现C/EBPζ在9例患者中的表达均明显降低.为此,我们应用实时定量PCR(RQ-PCR)方法进一步分析了C/EBPζ在MDS和AML中的转录本水平,发现C/EBPζ基因表达异常可能与MDS和AML发病相关.
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慢性髓细胞白血病患者干扰素同源序列结合蛋白的表达及其临床意义
干扰素同源序列结合蛋白(interferon consensus sequence binding protein, ICSBP)是干扰素调节因子(IRFs)家族成员之一,是一重要转录因子[1],主要表达于造血起源的细胞系[2],在免疫系统和干扰素介导的信号传导中起平衡调节作用[2,3],在造血细胞的生长和分化中起调节作用[4].Schmidt等[5]报道ICSBP mRNA在人类髓系白血病尤其是慢性髓细胞白血病(CML)中多呈低表达,而在慢性淋巴细胞白血病(CLL)中却呈高表达,此与髓系白血病的发病机制是否有关,国内尚未见报道.我们对CML患者ICSBP的表达以及经干扰素或羟基脲治疗的患者ICSBP表达情况进行了研究,并探讨其临床意义.
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瘦素与冠心病关系的研究进展
1994年,Zhang等[1]经过首次利用位点克隆技术成功从小鼠和人的脂肪组织中分离克隆了小鼠的肥胖(ob)基因及人类的同源序列,其编码产物为瘦素(1eptin).Scotland大规模冠心病防治的前瞻性研究中,发病组瘦素水平明显高于对照组,瘦素每增加1个标准差,发生心脏冠脉事件的相对危险增加125%,瘦素独立于年龄、体重指数(BMI)、血压和血脂,成为预示冠心病发病的危险因素[2].
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RNA干扰技术的研究进展
RNA干扰已经成为敲除特定基因表达的重要工具.将一段双链RNA序列导入机体或细胞中,使具有同源序列的基因表达受到抑制,由于这是一种在RNA水平上的基因表达抑制,也称之为RNA干扰,简称RNAi.该项技术的优点在于不仅可用于研究基因的功能,还可以研究药物干预的候选染色体或者筛选疫苗的靶基因[1].在哺乳动物细胞,RNAi技术已经成为研究基因功能的有利工具,并有望在今后对疾病的治疗中发挥重要作用[2].本文对RNAi技术的研究进展综述如下.
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MS4A基因家族的特性
MS4A(membrane-spanning 4-domain family,subfamily A)是编码人类和老鼠20多个不同蛋白质的大基因家族,包括CD20、高亲性IgE受体β亚单位(FcεRIβ)和具有造血细胞特性的横跨膜蛋白-IV(HTm4).人类的CD20被指定为MS4A1、FcεRIβ被指定为MS4A2、HTm4被指定为MS4A3,剩余的基因则分别被指定为MS4A4A等6种;老鼠MS4a基因家庭成员被指定为MS4al等15种[1].每个MS4A蛋白质包含4个假定的跨膜域,这些跨膜域有细胞内的N-和C-端;所有MS4A膜大小相似,且具有一个高度相似的同源序列,而一致性的区域是在前3个跨膜域中.MS4A蛋白质在各种组织中均有表达,尤其在淋巴组织中更为显著[1].然而,即使它们在不同的细胞类型中被表达,但因为在基因座位的保守性和在结构及序列方面的一致性,故MS4A家族成员可能在很大程度上共同参与一些功能.目前,对于大部分MS4A蛋白质的生理学作用仍然未被阐明,然而,该基因家族的下列基因已经被部分地确认.
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RNAi干涉技术与神经生物学的实验研究
RNA干涉是双链RNA在细胞内介导的同源序列的mRNA转录后表达抑制,导致基因沉默.它是一种比反义技术更为有效的方法,具有更高的特异性.自从其问世以来,在肿瘤研究.遗传性疾病,基因诊断,基因治疗以及药物设计等领域得到快速发展和广泛应用.在神经生物学及神经性疾病的应用研究方面,RNA干涉技术也显示了独特的优势,如神经的发生发育过程研究及神经退行性疾病的治疗等.本文就RNA干涉技术在神经生物学领域的实验及应用研究做一综述.
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同源比较法克隆单抗CAb-1重链可变区基因
目的获得抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区VH的准确基因.方法结合生物信息学同源比较分析,利用高兼并的FR1 5'端处引物扩增的单抗CAb-1的VH基因,并与数据库中序列比对,在同源性高的抗体序列的信号肽处二次设计引物,用RT-PCR法获得抗体基因VH的准确序列.结果选定了与已知抗体VH高度同源的序列进行引物设计.凝胶电泳可见预期大小DNA条带.经测序表明,配对于信号肽处的扩增产物不仅与配对于抗体可变区FR1的结果一致,而且也纠正了配对于CAb-1的VH的FR1的兼并引物所引入的氨基酸突变.结论所优化设计的引物能够扩增完整的抗人大肠癌单抗CAb-1重链可变区基因,为小分子工程抗体改造奠定了基础.