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用差异显示PCR法筛选与血管外膜细胞表型转化相关的基因
为筛选血管外膜成纤维细胞(adventitial fibroblast, AF)与肌成纤维细胞(myofibroblast, MF)间表型转化有关的基因, 实验建立了大鼠胸主动脉AF和MF两种细胞模型, 用差异显示聚合酶链反应(DD-PCR)技术获得表达差异片段, 对差异片段进行克隆和测序分析, 并用定量PCR和Northern blot对差别显示结果进行验证.用反义核酸转染技术观察骨桥蛋白(osteopontin, OPN)对AF迁移的影响. 结果表明, 两种表型细胞存在明显的基因表达差异, 其中一个在MF下调的差异片段与GenBank 中NADH脱氢酶亚单位5 (NADH dehydrogenase subunit 5, Nd5)基因高度同源.另一个在MF上调的差异片段与OPN基因同源.上述差异表达结果被定量PCR及Northern blot证实.此外还有4个表达序列标志(expressed sequence-tag, EST)在GenBank中未查到同源序列.反义OPN寡脱氧核苷酸可抑制AF的迁移活动. 结果提示, AF转化为MF可能与ND5基因下调、 OPN上调及其它未知基因的表达改变有关.应用反义技术适度抑制OPN表达在防治血管重塑中具有重要作用.
关键词： 血管外膜 成纤维细胞 肌成纤维细胞 差异显示聚合酶链反应 反义技术 -
反义技术治疗肿瘤的临床进展
反义技术是根据核酸间的碱基互补原理,用生物合成或人工合成的互补反义核酸或其化学修饰物与细胞内的特定核酸结合以抑制或封闭其表达.在肿瘤治疗方面,人们以癌变过程中的不同突变基因为靶位,设计了许多反义抗肿瘤药物,其中部分已进入临床试验阶段.作者对已进入临床试验阶段的反义抗肿瘤药物进行综述.
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HBV感染基因封闭治疗中的两个研究热点
由于目前抗乙型肝炎病毒(HBV)感染的治疗效果并不令人满意,近年来一些学者提出了基因封闭治疗HBV感染的思路并进行了深入的研究.基因封闭涉及多个方面,其中反义技术和抑制性转录后调节序列结合蛋白是其中的两个主要部分,由于两者的高效性、高特异性和较强的可行性,使之成为现阶段基因封闭治疗研究中的两个热点.
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基因反义技术逆转恶性肿瘤多药耐药性研究进展
目前人们公认采用手术、化、放疗等方法的综合治疗方案是提高恶性肿瘤治疗效果、降低其复发率的重要措施.其中化疗在恶性肿瘤的治疗中占有重要地位.对于某些恶性肿瘤(如白血病、子宫绒毛膜上皮癌、恶性淋巴瘤等),应用化疗可以完全治愈,但对于大多数恶性肿瘤,化疗的效果并不理想,主要原因在于肿瘤细胞对化疗药物的多药耐药性(MDR).如何克服肿瘤细胞的MDR成为提高肿瘤化疗效果的研究热点.近年来基因反义治疗技术的进展为其提供了新的有效途径.
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反义技术在端粒酶研究中的应用
人类端粒是位于染色体末端的重复DNA序列(TTAGGG),具有维持染色体稳定的重要作用,端粒长短变化和稳定与细胞的衰老和癌变密切相关.端粒酶(telomerase)是一种特殊的核糖核蛋白聚合酶,它能以自身的RNA作为模板合成端粒弥补端粒丢失,对维持端粒长度,使细胞获得永生化起重要作用.
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基因沉默技术在斑马鱼研究中的应用
模式生物斑马鱼主要应用于探索遗传学、发育生物学和分子生物学等研究领域的分子机制,常用的研究策略是DNA诱变和基于RNA的基因沉默.但化学诱变技术和传统反义核酸技术存在缺陷,目前在应用中已受到很大限制.反义morpholino技术具有稳定、方便的特点,广泛应用于斑马鱼基因功能的研究.新兴的锌指核酶基因敲除技术不依赖于胚胎干细胞使其前景更为广阔.
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反义技术在抗HBV感染中的应用
反义技术是近些年来随着现代分子生物学技术的发展而产生的新的生物医学治疗技术.它采用反义核酸分子抑制、封闭或破坏靶基因组的技术手段,包括反义寡核苷酸、核酶及RNA干扰等.反义分子通过与靶基因异性互补配对结合,阻断靶基因的复制、转录或翻译过程,从而发挥抗病毒作用.针对乙型肝炎病毒的反义技术也有了广泛而深入的研究.根据反义技术在分子、细胞以及动物水平上的研究表明:反义技术能够高效、特异地抑制HBV的复制与表达.
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反义核酸抑制增殖细胞核抗原表达的研究进展
反义核酸是天然存在于原核生物内或根据碱基互补原理人工合成的短片断寡聚核苷酸,通过与靶基因或mRNA配对结合,阻断基因转录和翻译,从而特异性抑制靶基因的表达.1978年Zamecnik等[1]首次将反义技术应用于抑制病毒基因表达研究并获得成功,从而进入了应用反义技术研究基因功能的新时期.由于反义核酸对基因表达的抑制具有高效性和高特异性的特点,故作为一种有别于传统化疗药物的新的基因治疗手段,具有广阔的研究和应用前景.目前应用反义技术进行研究的主要课题是调控细胞生长周期的基因及其产物,增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是其中之一.
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T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1反义核酸抑制胃癌细胞侵袭黏附的研究
T淋巴瘤侵袭转移诱导因子1(Tiam1)是与胃癌侵袭转移密切相关的细胞骨架调节因子[1].我们采用反义技术抑制胃癌高侵袭转移细胞株中Tiam 1的表达,并观察对其体外黏附和侵袭、移行能力的影响.
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反义技术与移植物动脉硬化
近年来,随着组织配型、器官保存、外科手术及临床与实验诊断技术不断提高,尤其是环孢素A(CsA)、FK506等新型强效免疫抑制剂的不断问世与合理应用,急性排斥的发生已能良好控制,移植物的1年存活率有了较大提高,但是远期疗效仍不理想.随着术后长期存活者的大量涌现,慢性排斥(CR)已成为阻碍移植物长期存活的重要原因.移植物的慢性损害过程是所有实体器官移植的特征之一,寻找更加良好和特异的方法防止或阻断这一过程的发生与发展,是器官移植领域面临的重要课题.
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肝癌基因治疗策略研究进展
自60年代末提出基因治疗概念以来，其初设想主要包括修复突变或缺失的基因以及导入治疗基因，随着近十年来对癌基因认识的深入及转基因技术的日趋完善，肝癌的基因治疗策略也得以不断丰富和发展，如自杀基因及反义技术的运用等。现就这一领域的国内外研究进展作一综述。 一、 反义疗法 肝癌的发生、发展过程中可以检测到许多癌基因及生长因子基因产物的大量表达，运用反义技术可以抑制这些产物的过度表达，从而抑制肿瘤的生长。目前肝癌基因治疗中采用的反义技术主要是反义寡核苷酸技术和核酶技术。 反义寡核苷酸技术是采用与某一些癌基因或生长因子基因互补的RNA或DNA，将其导入肝癌细胞后，可与靶基因的mRNA或其前体hn mRNA互补结合，影响mRNA的成熟及翻译，达到抑制靶基因表达的作用。Huang等［1］用可表达c-ets-2、c-myc、及N-ras基因反义RNA的重组逆转录病毒导入人肝癌细胞系SMMC-7721，经G418筛选，转基因肝癌细胞70%生长停滞于G0/G1期，在软琼脂上集落形成能力以及在裸鼠体内的致瘤能力均明显受到抑制；近来分别有学者将胰岛素样生长因子Ⅰ、Ⅱ（IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ）反义基因导入肝癌细胞系后，也均检测到肿瘤细胞的生长及致瘤能力下降，并表明这可能是由于IGF表达受抑引起肝癌细胞凋亡的缘故［2，3］。
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NHE1基因调探细胞内酸碱平衡对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响
0 引言Na+-H+交换泵第一亚型(Na+-H+ exchanger 1,NHE1)是存在于所有真核细胞的一种跨膜蛋白,是调节细胞内pH值(intracellular pH,pHi),中性或偏碱性的重要膜蛋白 [1,2].近来发现NHE1基因在肿瘤细胞中的活性明显增高,与肿瘤细胞的生长有着密切的关系 [3].为了解NHE1基因在胃癌细胞中的作用,我们利用基因转染技术,构建NHE1反义真核表达载体,将NHE1反义基因转染入SGC-7901胃癌细胞,观察NHE1反义基因对SGC-7901胃癌细胞增殖和凋亡的影响.
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Ezrin蛋白mRNA的一、二级结构分析和反义技术作用靶点设计
目的 分析肿瘤远处转移相关蛋白Ezrin Mrna的一、二级结构,寻找其各种反义技术作用的靶点.方法 利用RNAdraw和RNAstructure两种计算机程序对Ezrin Mrna进行分析计算,得到其一、二级结构信息,选择两种程序计算出的共同的连续4个以上碱基未配对的单链成环区作为反义技术的靶区域,设计反义寡核苷酸(AsODNs)、核酶(Ribozyme)、脱氧核酶(DNAzyme or Deoxyribozyme)和小干扰RNA(SiRNA)等4种常用反义技术的作用靶点,再通过计算机程序OligoWalk利用低自由能原则进行筛选,后得到各反义技术的作用靶点.结果 各反义技术的靶点数目分别为:AsODNs17个,Ribozyme5个,DNAzymel5个,SiRNA10个;其中AsODNs靶点中较为理想的为G1749-A1771和C1777-G1794,Ribozyme为A2359-G2360,DNAzyme为A1789-U1790、A1756-G1757及A1784-G1785,SiRNA为G802-G808、G1749-A1771及A2354-G2360,并且A2354-G2360是所有4种反义技术共同的作用区域,可以作为一个通用靶点.结论 正确的靶点设计为应用反义技术抑制Ezrin表达从而控制恶性肿瘤的远处转移提供了有效的指导作用.
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抗病毒基因治疗
基因治疗是将治疗性基因导入到发生病变的细胞内,以替补突变基因的功能,或封闭异常基因表达的治疗方法.抗病毒基因治疗可以概括为两个方面:细胞内免疫和基因免疫技术.
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反义肽核酸技术在临床医学中的应用研究现状
肽核酸是-核酸类似物,是核酸中的糖-磷酸主链被-合成的肽链所取代,终形成一种非手性的、不带电荷的类似物.与核酸分子相比,肽核酸有更高的稳定性、碱基特异性.配体-受体、连接带正电荷基团如赖氨酸或精氨酸残基或核定位信号肽等可以提高肽核酸的通透性.肽核酸在分子生物学和诊断学域有广泛应用.活体外研究显示肽核酸可以抑制目的基因的转录和翻译,因此其反义形式也可应用于临床疾病的治疗.
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反义技术--高血压治疗新策略
本文阐明了反义技术的原理以及用反义技术治疗高血压的候选基因及其筛选方法;并介绍了反义寡聚核苷酸的化学修饰、特异性、作用靶点、转染方式以及用反义技术治疗高血压的前景.
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反义药物研究进展
反义技术是一种新的药物开发方法,一般包括反义DNA技术、反义RNA技术和核酶(Ribozyme)技术.反义技术能序列特异性地有效抑制靶基因的表达,可广泛用于功能基因组研究、药物靶标确认以及疾病治疗等多个领域.
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自体造血干细胞移植物的免疫净化研究及进展
自体造血干细胞移植(autologous stem cell transplantation,ASCT)是保证大剂量化疗和放疗安全用于治疗恶性肿瘤的有效措施.但不论是自体骨髓移植还是自体外周血干细胞移植,移植物中残留肿瘤细胞对移植后复发和总体治疗疗效均有直接影响.因此如何清除移植物中污染的肿瘤细胞成为研究热点之一.目前应用的体外净化的方法较多,主要有物理学(高温、冷冻、微波、光等)、化学(各种化疗药物)、生物学(长期液体培养、反义技术、蛋白酪氨酸激酶抑制物)、免疫学等方法.本文就近年来免疫净化方法(immunologic purging)的研究作一简要综述.
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重组腺病毒载体携带多药耐药基因1反义RNA靶向逆转肝癌细胞多药耐药
目的 探讨携带多药耐药基因1(multidrug resistance gene 1,mdr1)反义RNA的重组腺病毒载体靶向逆转甲胎蛋白阳性(AFP+)的肝癌多药耐药细胞HepG2R的疗效及作用机制.方法 分别构建携带AFP启动子和mdr1基因反义核苷酸片段的重组腺病毒载体Adeno-asmdr及携带AFP启动子和增强绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒载体Adeno-EGFP,将Adeno-EGFP转染人正常肝细胞L02(AFP-),人官颈癌细胞HeLa(AFP-)及HepG2(AFP+)细胞,检测增强绿色荧光蛋白基因在各细胞的转录水平;将Adeno-asmdr转染HepG2R细胞,Western blot检测不同时间P-gp170的表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的脱氧三磷酸尿苷缺口末端标记法检测HepG2R细胞凋亡,流式细胞术检测HepG2R细胞在不同药物作用下细胞周期、凋亡率.结果 增强绿色荧光蛋白基因在AFP阳性的HepG2细胞可得到显著转录,而在L02细胞和HeLa细胞,其转录减少,显示了该载体的良好转录活性以及靶向特异性.Adeno-asmdr转染HepG2R细胞后,HepG2R细胞P-gp170表达明显减弱,HepG2R细胞凋亡增加,HepG2R细胞对多种化疗药物的耐受能力明显下降,细胞出现显著的周期阻滞,大量细胞被阻滞于S期和G0/M期,凋亡细胞比例增加.结论 实验构建的Adneo-asmdr重组腺病毒载体可在AFP阳性HepG2R细胞内特异靶向性表达目的 基因,并可有效降低mdrl基因产物P-gp170的表达,从而达到对HepG2R细胞多药耐药的逆转作用.
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抑制c-raf-1基因对人宫颈癌细胞放射敏感性影响的实验研究
目的:探讨用反义技术抑制癌基因c-raf-1对宫颈癌细胞(HeLa)放射敏感性的影响.方法:设立空白对照组、c-raf-1正义寡核苷酸组和脂质体组(仅加入等量的脂质体)作对照,用RT-PCR检测宫颈癌细胞处理前后c-raf-1表达水平的变化.用集落形成试验检测各实验组照射后人宫颈癌HeLa细胞株集落形成率,AO/EB荧光染色法检测细胞凋亡率的变化,流式细胞仪测定Bcl-2蛋白的表达.结果:c-raf-1反义寡核苷酸能有效抑制c-raf-1癌基因的表达,经脂质体介导的c-raf-1反义寡核苷酸作用的宫颈癌细胞经60Coγ射线照射后其集落形成率较正义寡核苷酸组及单纯照射组明显下降,而凋亡率明显增加,Bcl-2蛋白的表达显著下调,与对照各组比较有显著差异(P＜0.01).结论:c-raf-1反义寡核苷酸通过抑制c-raf-1基因降低人宫颈癌HeLa细胞放射抗性.其辐射增敏作用可能与c-raf-1反义寡核苷酸抑制了辐射抵抗信号转导途径,增加照射后肿瘤细胞的凋亡率有关.
关键词： 人宫颈癌细胞株HeLa c-raf-1 反义技术 放射敏感性
