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锁核酸研究进展
锁核酸(locked nucleic acid, LNA)是一种新型的寡核酸衍生物,结构中β-D-呋喃核糖的2' -O,4' -C位通过缩水作用形成环形的氧亚甲基桥、硫亚甲基桥或胺亚甲基桥,呋喃糖的结构锁定在C3' 内型的N构型,形成了刚性的缩合结构.LNA作为一种新的反义核酸,具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力、反义活性、抗核酸酶能力、水溶性好及体内无毒性等优点.LNA在基因诊断和基因治疗上有很多优势,如:单链核酸的多态性基因分型、LNA寡聚体具有高效抑制端粒酶活性及LNA修饰的DNA核酶(LNAzymes)高效清除高级结构的RNA等,有良好的应用研究前景.
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增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展
CpG 基序(CpG motifs)是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸(ODN)序列,又称为免疫刺激序列,一般为 6 个寡聚核苷酸.1995年,Krieg 等[1]研究发现非甲基化的 CpG 二寡聚核苷酸是病原体 DNA 免疫刺激活性的结构基础,自此,对 CpG 基序的各种研究得以展开,包括 CpG 基序免疫刺激机制、CpG 基序个数及结构对免疫刺激活性影响、CpG 寡聚脱氧核苷酸作为佐剂使用等.
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新型隐球菌甘露糖蛋白及TLR-9配体CpG-ODN对树突状细胞的激活作用
新型隐球菌病越来越引起医学界的关注.目前还没有一种针对新型隐球菌的人体疫苗.鉴别可作为候选疫苗的有免疫保护作用的隐球菌抗原已成为必要.鼠模型显示机体对新型隐球菌感染的防御主要由细胞免疫介导.其中CD4+TH1细胞起着积极的调节作用,而TH2细胞则起着消极的调节作用.CpG的寡聚核苷酸(CpG-ODN)在体内可作为佐剂介导TH1型免疫反应.为了探讨CpG-ODN在抗新型隐球菌免疫反应中的作用,我们将新型隐球菌和CpG-ODN接种于实验鼠,取气管旁淋巴节细胞与经甘露糖蛋白(mannoprotein,MP)刺激过的DC共培养可诱导淋巴细胞产生IFN-γ.实验结果提示隐球菌的MP通过DC诱导了TH1型反应并作为抗原激活了新型隐球菌特异的TH1细胞.
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酒精性肝纤维化基质降解机制的研究
[摘要]目的 揭示酒精性肝病肝纤维化基质降解的病理机制.方法 28例酒精性肝炎肝穿刺组织按其纤维化程度分为3组.利用原位杂交技术以寡聚核苷酸为探针,分别检测各组MMP-1、MMP-2、MT1-MMP和TIMP-1 mRNA的表达情况.结果 发现MMP-1、MMP-2、MT1-MMP和TIMP-1mRNA表达阳性的细胞主要是肝窦壁细胞(可能为增生的HSC)和少数肝细胞;MMP-2、MT1-MMP和TIMP-1 mRNA表达阳性细胞数随肝纤维化程度的增加而增多,相反,MMP-1 mRNA表达阳性细胞数则随肝纤维化程度的增加而减少.结论 HSC可能是肝组织内产生MMP-1、MMP-2、MT1-MMP和TIMP-1的主要细胞,在酒精性肝纤维化ECM沉积中起重要作用;MMP-1减少和TIMP-1增多可能是ECM沉积、尤其是Ⅰ型胶原过量沉积的原因;而MMP-2和MT1-MMP增多的意义尚须进一步确定.
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TGFα,EGFR反义寡聚核苷酸抑制人大肠癌细胞的增殖
目的研究TGFα,EGFR反义寡聚核苷酸抑制大肠癌HR8348细胞株恶性增殖的作用.方法采用23个碱基组成的TGFα反义寡聚核苷酸和21个碱基组成的EGFR反义寡聚核苷酸以及21个碱基组成的对照寡聚核苷酸作用于人大肠癌HR8348细胞,通过细胞生长抑制实验,3H-TdR掺入,mRNA斑点杂交及细胞周期分析以确定其对大肠癌细胞的增殖抑制作用和作用环节.结果 TGFα,EGFR反义寡聚核苷酸与对照寡聚核苷酸相比较,均能有效抑制HR8348细胞的增殖(P<0.01),DNA合成(P<0.01)和mRNA(P<0.01)的表达,并能有效地延缓HR8348细胞由G0/G1期向S期的转化,延缓了细胞的分裂增殖.结论 TGFα,EGFR反义寡聚核苷酸均能有效地抑制HR8348细胞的恶性增殖.
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硫修饰和脂质体包裹对反义寡聚核苷酸抑制HSV1复制的影响
目的:探讨硫修饰和脂质体包裹对反义寡聚核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,AODN)抑制单纯疱疹病毒Ⅰ型(herpes simplex virus Ⅰ,HSV1)复制的影响.方法:将AODN、反义寡聚核苷酸脂质体(antisense oligodeoxynucleotides liposome,AODNL)、硫代反义寡聚核苷酸(antisense phosphorothioat oligodeoxynucleotides,SAODN)和硫代反义寡聚核苷酸脂质体(antisense phosphorothioat oligodeoxynucleotides liposome,SAODNL)配制成20、10、5、2.5和1.25 μg/ml,加入至96孔培养板,再加入102组织培养半数感染量(50% tissue culture infective dosage,TCID50)病毒,培养24小时,细胞冻融后取上清液,加至24孔培养板的细胞中,吸附1小时,去病毒液,加入空斑上层液,培养72小时,空斑计数.做病毒阳性对照,计算药物的病毒抑制率.结果:各组药物浓度与抗病毒药效之间无相关性(P>0.05).AODN组与AODNL组、SAODN组和SAODNL组相比有显著性差异(P<0.05),SAODN组与SAODNL组之间有显著性差异(P<0.05),AODNL组与SAODNL组间无显著性差异(P>0.05).结论:脂质体包裹、硫修饰或两者结合抑制病毒复制的作用都显著强于游离反义寡聚核苷酸,脂质体包裹的作用比硫修饰强.
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肿瘤核素反义显像技术的研究现状与展望
反义显像具有不引起免疫反应、探针分子小、易进入瘤组织等优点,具有广阔的应用前景,但靶序列的选择、理想寡核苷酸的确定等仍是现阶段制约其发展的重要因素.因此,将反义显像引入体内研究还有很多问题需要解决,包括如何提高探针的体内稳定性、增加靶细胞的选择性摄取和滞留、降低血清蛋白非特异性结合等.
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基因芯片在人类疾病相关新基因克隆中应用的进展
人类基因组学研究已实现从结构基因组向后基因组的全面转变,现阶段致病基因的克隆实质上已不是传统意义上的基因克隆,而主要是致病基因的鉴定,就是将某一特定基因的突变与某一特定的疾病联系起来或者是筛选与某一特定疾病相关的基因.基因芯片已广泛应用于人类疾病相关基因的克隆.基因芯片包括cDNA、BACs或cosmids芯片和寡聚核苷酸芯片,它们各有优缺点.本文主要概述了基因芯片技术的新研究进展及其在新基因克隆或筛选疾病相关新基因中的应用.
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寡聚核苷酸芯片检测溃疡性结肠炎患者基因表达谱的研究
溃疡性结肠炎(UC)是一种慢性非特异性结肠炎性反应.目前国人患病率约为11.6/10万,且有升高趋势[1-2].
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TLR9诱导产生的Ⅰ型IFN对实验性大肠炎的抑制作用
细菌DNA及其来源的具有免疫刺激效应的寡聚核苷酸(ISS-ODN)(含有非甲基化CpG基序)是TLR9的配体.ISS-ODN能够刺激Th1型细胞因子的产生,上调抗原提呈细胞表达共刺激分子,增强宿主对入侵病原微生物的防御功能.ISS-ODN能够防止或明显减轻CD4+T细胞依赖和CD4+T细胞非依赖实验性大肠炎的发生或炎症程度,但这种保护作用是短暂的,不具有免疫记忆效应,表明ISS-ODN介导的抗实验性大肠炎效应是天然免疫应答.通过T细胞和B细胞缺陷的SCID和RAG-/-小鼠,发现ISS-ODN对RAG-/-小鼠发生实验性大肠炎具有保护机制,而这种效应主要是通过ISS-ODN活化TLR9信号通路产生的Ⅰ型IFN来发挥作用.
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保护薇乔缝线携载反义寡聚核苷酸的实验研究
目的:探讨手术缝线携载反义基因片断的可能性及可行性,为术中血管吻合口局部转染反义基因提供新的途径.方法:保护薇乔缝线反复浸于反义核酸溶液中72 h,溴化乙锭(EB)标记,紫外灯下观察其吸附反义基因的情况.将吸附反义基因的缝线置于生理盐水中分别于不同时间点测其释放的D值,绘出体外控释曲线.同时取释放液进行电泳分析.以在荧光标记的核酸溶液中浸过的缝线直接行兔颈总动脉吻合,24 h取材制片荧光显微镜下观察.结果:吸附核酸的保护薇乔缝线经EB标记后在紫外灯下呈烧红的铁丝样,释放曲线提示2 h释放明显增加,36 h释放达高峰.电泳则可见随时间延长而逐渐变亮的电泳带.荧光显微镜下见吻合口附近血管壁全层散在荧光分布.结论:保护薇乔缝线可较大量携载反义基因片段,可于术中血管吻合时直接将反义基因转移至吻合口并缓慢释放.
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Rb反义寡核苷酸对人结肠癌细胞凋亡及化疗药敏的影响
目的观察Rb反义寡核苷酸(AS-ODN)对人结肠癌(HT-29)细胞凋亡及化疗药物敏感性的影响.方法人工合成Rb AS-ODN经脂质体(Lip)包裹后作用HT-29细胞.采用免疫组化、Western Blot检测转染前后Rb蛋白表达状况,流式细胞术测定HT-29细胞转染前后5-Fu诱导凋亡程度,MTT法观察化疗药敏的变化.结果经Rb AS-ODN处理的HT-29细胞Rb蛋白表达量明显下降,Rb AS-ODN处理的HT-29细胞加5-Fu作用后与对照组比较,细胞凋亡率明显下降,化疗药物敏感性降低.结论 Rb AS-ODN阳离子脂质体转染具有抑制化疗药诱导大肠癌HT-29细胞凋亡的作用及降低化疗药物敏感性作用.
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特异寡聚核苷酸对猪瘟病毒在细胞中增殖抑制作用的研究
本实验探讨了寡聚核苷酸对CSFV复制的影响以及作为抗CSFV新型药物的可行性.实验结果表明针对CSFV 5'端非编码区NS3蛋白丝氨酸蛋白酶功能区的寡聚核苷酸对CSFV复制均有显著的抑制作用,而针对CSFV 3'端非编码区寡聚核苷酸仅有轻微抑制作用,5′端寡聚核苷酸具有佳抑制作用,同时发现相应序列中正义聚核苷酸的作用要优于反义寡聚核苷酸;脂质体介导转染能显著提高寡聚核苷酸对CSFV复制的抑制作用.这些初步结果也提示,CSFV 5'端和3'端非编码区对CSFV复制的重要性和作用有所不同.
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反义核酸抑制增殖细胞核抗原表达的研究进展
反义核酸是天然存在于原核生物内或根据碱基互补原理人工合成的短片断寡聚核苷酸,通过与靶基因或mRNA配对结合,阻断基因转录和翻译,从而特异性抑制靶基因的表达.1978年Zamecnik等[1]首次将反义技术应用于抑制病毒基因表达研究并获得成功,从而进入了应用反义技术研究基因功能的新时期.由于反义核酸对基因表达的抑制具有高效性和高特异性的特点,故作为一种有别于传统化疗药物的新的基因治疗手段,具有广阔的研究和应用前景.目前应用反义技术进行研究的主要课题是调控细胞生长周期的基因及其产物,增殖细胞核抗原(Proliferating cell nuclear antigen,PCNA)是其中之一.
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缺氧诱导因子-1α反义寡核苷酸对胶质瘤细胞化疗敏感性的影响
目的研究缺氧诱导因子(HIF)-1α反义寡核苷酸(ASODN)对人胶质瘤细胞化疗药物敏感性的影响.方法人工合成HIF-1α ASODN经阳离子脂质体包裹后瞬时转染人胶质瘤细胞株U251.采用RT-PCR和免疫细胞化学检测转染后HIF-1α基因表达,噻唑蓝(MTT)检测细胞增殖抑制率(PI),亚啶橙/溴化乙锭(AO/EB)染色及末端标记法(TUNEL)检测U251细胞转染后顺铂诱导的细胞凋亡指数(AI).结果 HIF-1α ASODN转染使U251细胞HIF-1α基因表达明显下调,其AI和PI分别为(42.0±3.5)%和(72.5±4.8)%,,与各对照组比较均差异有统计学意义(P<0.01),而空白对照组,脂质体组和SODN组的AI和PI分别为(7.1±0.3)%,(8.2±0.2)%,(12.3±0.4)%和(30.7±2.9)%,(34.2±3.5)%,(38.6±3.1)%,AI和PI在各对照组之间的差异无统计学意义(P>0.05).结论阳离子脂质体转染HIF-1α ASODN具有促进化疗药物诱导胶质瘤U251细胞凋亡及增强化疗药物敏感性作用.
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反义药物的作用机理与临床应用
反义药物是以反义核酸技术为基础开发的以治疗为目的的安全有效的新型药物。与传统的药物相比较,反义药物的性质和作用对象明显不同,表现为:新的化学物质-寡聚核苷酸;新的药物受体-mRNA(信息核糖核酸);新的受体结合方式:Watson-Crick杂交;新的药物受体结合后反应,如RNase H(核糖核酸酶H)介导的靶RNA的降解[1]。近年来,随着对反义寡聚脱氧核苷酸(oligodeoxynucleotides,ODN)及其结构衍生物如硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(phosphorothioate oligodeoxynucleotides,PS-ODN)反义作用机理的阐明,大批以病毒、癌基因、细胞活性因子及其他疾病相关蛋白的基因为靶点的反义药物相继进入临床试验阶段,使反义药物的研究再次进入蓬勃发展时期。本文将在综述文献的基础上,对反义药物的作用机理及临床应用作如下介绍。
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Rb反义寡核苷酸对人骨肉瘤细胞凋亡及化疗药敏的影响
目的观察Rb反义寡核苷酸(AS-ODN)对人成骨肉瘤(MG-63)细胞凋亡及化疗药物敏感性的影响.方法人工合成Rb AS-ODN、S-ODN(正义寡核苷酸)经脂质体(Lip)包裹转染MG-63细胞.采用Western Blot检测转染前后Rb蛋白表达状况,流式细胞术测定MG-63细胞转染前后阿霉素(Adriamycin,ADM)诱导细胞凋亡程度,MTT法观察化疗药敏的变化.结果经Rb AS-ODN处理的MG-63细胞Rb蛋白表达量明显下降,Rb AS-ODN处理的MG-63细胞加ADM作用后与对照组比较,细胞凋亡率明显下降,化疗药物敏感性降低.结论 Rb AS-ODN阳离子脂质体转染具有抑制化疗药诱导骨肉瘤MG-63细胞凋亡的作用及降低化疗药物敏感性作用.
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淋巴细胞凋亡在系统性红斑狼疮发病机制中的意义
系统性红斑狼疮(SLE)是一种自身免疫病,这早已为人们所熟知,但长期以来对其发病机制的具体细节一直未能明确.目前国内外许多实验证据表明:SLE发病机制与淋巴细胞的异常凋亡有密切的联系.1 淋巴细胞凋亡与系统性红斑狼疮的关系细胞凋亡(apoptosis)是一种受基因控制的细胞自灭过程.人们在SLE中发现多种自身抗体的增加与凋亡产物有关,这提示SLE的发病机制可能涉及细胞凋亡的因素.目前已知从SLE患者外周血浆中提取、纯化DNA,这些片段与细胞凋亡过程中释放出来的寡聚核苷酸一致,这提示SLE患者体内存在异常的细胞凋亡.此后,寻找这些凋亡产物的来源及其发生机制成为研究SLE发病机制领域的热点.Perniok等[1]通过SLE、原发性系统性血管炎患者和正常人的比较,发现SLE患者体内的淋巴细胞凋亡率升高,且与抗ds-DNA抗体浓度呈正相关,其中T细胞尤为显著.此结果提示SLE中的确存在淋巴细胞凋亡加速,且与其自身抗体产生有密切关系,在其发病机制中起重要作用.
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端粒酶反义寡核苷酸抗肿瘤的实验研究
一、材料与方法 1. 肝癌细胞株SMMC-7721引自中国科学院上海细胞生物研究所细胞库。 2. 试剂:端粒酶反义寡聚脱氧核苷酸(ASODN-t)及无关寡聚核苷酸(N-ODN)由上海生工生物工程公司合成,全硫代修饰。 3. 对细胞抑制作用的观察:取2×107/L肝癌细胞接种于96孔的细胞培养板中,每孔100μl,设3个复孔。分别加入ASODN-t,调节浓度使ASODN-t终浓度分别为1、2、3、4、5μmol/L,N-ODN的终浓度为3μmol/L,培养24、48、72、96h,于结束前4h加入5g/L MTT 20μl,继续培养4h,再加入SDS溶液100μl,终止反应。用酶联免疫检测仪检测各孔在波长570nm的吸光度A值。
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制备脂质体包裹的99m锝标记c-myc mRNA反义寡聚核苷酸的研究
探讨脂质体包裹的99m-锝标记c-myc mRNA反义寡聚核苷酸的制备方法,为反义显像和反义治疗的实验研究奠定基础.合成15 bp的反义寡聚核苷酸(DNA)和双功能螯合剂-联肼尼克酰胺衍生物,DNA与双功能螯合剂偶联后,用99m锝标记,然后用C18 Sep-Pak反相柱进行纯化,根据纯化结果,绘制淋洗曲线,计算标记率.再用阳离子脂质体对纯化产物进行包裹,获得脂质体包裹的99m锝-DNA.用纸层析测定脂质体包裹的99m锝-DNA的放射性化学纯度及与水、血清孵育后的稳定性.结果,不同放射性活度的99mTcO4-标记时的标记率为: 1 480 MBq时为 63.37%±3.51%,740 MBq时为62.52%±3.69%,592 MBq时为59.82%±5.12%,经χ2检验无显著性差异.脂质体包裹99mTc-DNA的放射化学纯度=96.47%±3.01%,与水、血清孵育后脱落的99mTc极少,可见99mTc-DNA的稳定性极好.由此可见,以脂质体作载体,联肼尼克酰胺衍生物作为双功能螯合剂,可制备脂质体包裹的99m锝标记的单链寡聚核苷酸.