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增强CpG免疫刺激作用途径的研究进展
CpG 基序(CpG motifs)是指含有非甲基化的胞嘧啶(C)和鸟嘌呤(G)核苷酸核心的寡聚脱氧核苷酸(ODN)序列,又称为免疫刺激序列,一般为 6 个寡聚核苷酸.1995年,Krieg 等[1]研究发现非甲基化的 CpG 二寡聚核苷酸是病原体 DNA 免疫刺激活性的结构基础,自此,对 CpG 基序的各种研究得以展开,包括 CpG 基序免疫刺激机制、CpG 基序个数及结构对免疫刺激活性影响、CpG 寡聚脱氧核苷酸作为佐剂使用等.
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更新版血液透析血管通路临床实践建议及研究方向解读
2006年更新版血管通路实践指南分为三大部分,即临床实践指南(CPG)、临床实践建议(CPR)和研究建议.我们在本刊第6期已经对第一部分做了解读,本文将主要解读第二和第三部分.其中第二部分是对第一部分八条CPG中的1-5,7-8所做的建议,第三部分是对血管通路研究方向所做的指导.
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乙肝疫苗联合含CpG基序寡脱氧核苷酸和卡介苗对小鼠的免疫应答影响
目的:观察乙肝疫苗联合CpG ODN和卡介苗免疫小鼠,对小鼠抗HBs水平和细胞免疫的影响.方法:不同剂量乙肝疫苗单用或联合CpG ODN或卡介苗免疫小鼠,用ELISA方法检测抗HB s水平,流式细胞仪检测外周血CD4+和CD8+T淋巴细胞亚群的百分比和比值.结果:免疫4 wk后,中、高剂量乙肝疫苗联合CpG ODN组抗HBs水平显著高于低剂量乙肝疫苗组(420.56±55.66 vs 181.62±41.25,t=0.013,P＜0.05;403.38±63.85 vs 181.62±41.25;t=0.024,P＜0.05).但中、高组间无差别.CpG ODN联合组与单用乙肝疫苗组比较,联合低、中剂量乙肝疫苗抗HBs水平较单用乙肝疫苗明显升高(181.62±41.25 vs59.16±18.43,t=0.022,P＜0.05;420.56±55.66 vs241.82±23.84,t=0.018,P＜0.05).但高剂量乙肝疫苗联合组与单用乙肝疫苗比较两组间未显示明显差别.且以CpG ODN联合中等量乙肝疫苗产生的抗HBs水平高.卡介苗联合组与单用乙肝疫苗组无差别,但在联合低、中剂量乙肝疫苗抗HB s水平低于CpGODN联合组.CpG ODN联合组CD4+T淋巴细胞百分比和CD4+/CD8+比值明显高于单用乙肝疫苗组和卡介苗联合组(CD4+:38.30±1.68 vs 31.47±2.15,t=0.018,P＜0.05;38.30±1.68 vs 29.31±2.97,t=0.013,P＜0.05;CD4+/CD8+:9.01±0.38 vs 6.45±0.39,t=0.000,P＜0.05;9.01±0.38 vs 6.99±0.79,t=0.029,P＜0.05).结论:CpG ODN联合乙肝疫苗不仅能诱导出高水平的抗HBs,而且对细胞免疫也有调节作用.
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Toll样受体9与自身免疫性糖尿病
近年来,在自身免疫性糖尿病发病机制的探讨中,免疫炎症学说备受关注.天然免疫中的Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是连接天然免疫和获得性免疫两者之间的桥梁,是近年来学者们关注的热点[1].本文拟围绕Toll样受体9信号通路和自身免疫性糖尿病的关系对其做一综述,旨在从分子免疫学水平探索自身免疫性糖尿病的发病机制,以寻求新的有效防治措施.
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CpG寡核苷酸在肿瘤治疗中的应用研究进展
肿瘤的免疫治疗可以追溯至19世纪后期,当时纽约的一个外科医师William Coley就已开始运用细菌的提取物治疗肿瘤.
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CpG ODN作为黏膜免疫佐剂的研究进展
经黏膜免疫因其简便易行、可同时激发黏膜免疫和系统免疫应答等优点受到极大关注.但由于存在黏膜屏障,能有效介导黏膜免疫应答的佐剂已成为研究热点.在诸多在研佐剂中,CpG ODN具有极强的黏膜免疫激活作用,诱导以Th1型为主的免疫应答,具有广阔的应用前景,本文综述了CpG ODN作为黏膜免疫佐剂的研究进展.
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CpG联合X射线照射对Lewis肺癌小鼠IL-10和TNF-α的影响
肺癌是常见的恶性肿瘤,放射治疗是重要的治疗手段,但治疗效果多不令人满意,肺癌患者免疫力低下是原因之一,而放射治疗又可使机体的免疫功能下降.
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氯吡格雷抵抗相关机制及对策
氯吡格雷(clopidogrel,CPG)是临床应用为广泛的新型噻吩吡啶类抗血小板聚集药物之一,其作用明显优于阿司匹林.有研究结果显示,CPG联合阿司匹林比起单用阿司匹林可使非ST段抬高型急性冠脉综合征(ACS)患者的终点事件明显下降.目前,CPG已广泛用于ACS等疾病和经皮冠状动脉介入治疗(PCI)后的抗血栓治疗.然而,大量体外实验证实个体对CPG的反应存在较大的差异性.部分患者尽管长期服用常规剂量的CPG,但临床上仍不能有效地防止血栓事件的发生,且血小板功能检测证实血小板聚集不能被有效抑制,这种现象被称为CPG抵抗,亦称CPG无反应、CPG低反应等.越来越多的证据表明,心脏再发缺血性事件与CPG抵抗有关.然而CPG抵抗的发生机制至今尚未完全阐明,可能与多种因素有关.因此CPG抵抗正日益受到研究者的重视.
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新型CpG佐剂——BW006协同乙型肝炎病毒表面抗原活化小鼠B、T淋巴细胞的作用
目的 探讨新型CpG佐剂BW006协同乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)对小鼠B、T淋巴细胞活化的影响.方法 以BW006和(或)HBsAg体外刺激小鼠脾单个核细胞,检测B细胞膜表面分子CD80、CD86和T细胞早期活化分子CD69的表达水平.小鼠免疫BW006和(或)HBsAg后24h取脾,无菌分离单个核细胞,检测CD80、CD86和CD69的表达水平.结果 40 μgHBsAg +5μg BW006体外刺激24h时,B细胞CD80、CD86阳性率显著高于对照组(27.36％±1.77％ vs 10.41％±0.72％；98.92％±0.09％ vs74.85％±5.13％,P均＜0.01),T细胞CD69阳性率显著高于对照组(12.47％±3.31％vs 7.15％±1.37％,P＜0.01).4μg HBsAg +20μg BW006联合免疫后,小鼠脾B细胞CD80的阳性率显著高于BW006免疫组(12.26％±2.33％vs 9.80％±1.17％P＜0.05)和生理盐水免疫组(12.26％±2.33％vs 8.50％±1.34％,P＜0.05),CD86阳性率显著高于生理盐水免疫组(63.84％±1.48％ vs 56.69％±1.33％,P＜0.05),T细胞CD69表达阳性率显著高于BW006组(33.97％±2.17％ vs 31.32％±2.78％,P＜0.05)和生理盐水组(33.97％±2.17％ vs27.77％±2.51％,P＜0.05).结论 BW006佐剂能有效辅助HBsAg活化B和T细胞,上调B细胞表面协同刺激分子CD80、CD86及T细胞早期活化分子CD69的表达.
关键词： CpG 乙型肝炎表面抗原(HBsAg) 淋巴细胞 免疫 -
CpG ODN佐剂序列的筛选及其免疫刺激活性研究
目的 设计和筛选对入PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpG ODN序列,研发能用于人用疫苗的有效核酸佐剂. 方法 根据具有免疫刺激活性的CpG ODN序列结构特点,设计并合成出15条候选序列,分别合成并进行非硫代和硫代修饰.分选健康人PBMC细胞及Balb/c小鼠脾细胞,以不同CpG ODN进行体外刺激,MTT法检测CpG ODN诱导细胞增殖水平.随后将筛选出的有效CpG ODN序列与人类基因组序列进行同源性比较,以评估其安全性. 结果 在刺激人PBMC和小鼠脾细胞72h后,硫代和非硫代修饰的15条序列A值均高于阴性对照组,其中IMB-AC5序列刺激人PBMC后A值分别达到0.377和0.334,与阳性对照ISS1018序列A值(0.387和0.338)接近;刺激小鼠脾细胞72h后,A值同样高于其他序列,达到0.571和0.486,与阳性对照ISS1018序列A值(0.588和0.464)接近.综合上述结果,选择5号非硫代序列作为候选佐剂.同源性比较结果显示,该序列与人类基因组序列没有同源性,与部分蛋白编码基因的同源性只有50％ ～65％,此外其部分序列与入18号染色体上的一些重复序列有同源性,高同源性达62％.证明筛选出的新型CpG ODN佐剂IMB-AC5安全性较高.结论 设计筛选出对人PBMC细胞和小鼠脾细胞具有免疫刺激活性的CpG ODN序列IMB-AC5,与人类基因组序列具有较低同源性,为进一步研发人用疫苗佐剂奠定基础.
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维持气管导管合适套囊压方法探讨
全麻气管插管时,导管气囊压力不当可致气管黏膜缺血损伤、术后声嘶、咽喉痛等并发症[1,2].常用的套囊充气法有:手指捏感法、小容积阻塞法和套囊充气测压仪(Cuff Pressure Gauge,CPG)充气法.手指捏感法盲目性很大,小容积阻塞法太繁锁,套囊充气测压仪(Cuff Pressure Gauge,CPG)充气法是一种科学、理想的方法,但不是每家医院或每个手术间都能配备套囊充气测压仪.因此,寻找一种简单实用的替代方法具有很好的临床意义.
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以DNA四面体为载体研究CpG对免疫Melan-A抗原肽协同作用
目的:通过将Melan-A抗原肽与CpG连接在DNA四面体上,并控制肽链与CpG之间的距离和CpG的个数,研究CpG对具有免疫原性的Melan-A抗原肽的协同作用.方法:将特定设计合成好的四面体-肽、四面体-肽-CpG(Ⅰ)、四面体-肽-CpG(Ⅱ)注射到小鼠体内,运用ELISA法检测小鼠血清中IL-6的浓度.结果:相应产生的IL-6的浓度为9.238 pg/mL、17.150 pg/mL、18.865 pg/mL.结论:CpG增强了Melan-A抗原肽的免疫作用,并且CpG个数越多增强效果越好.
关键词： DNA四面体 Melan-A抗原肽 CpG 协同作用 小鼠 -
人类DNA甲基化与癌症等相关的研究
DNA甲基化一般与基因的沉默(gene silence)相关,而去甲基化(demethylation)往往与一个沉默基因的重新激活(re activation)相关.当机体衰老或呈病理状态,特别是肿瘤发生时,抑癌基因CPG岛以外的CPG序列非甲基化程度增加,而CPG岛中的CPG则呈现高度甲基化,致使抑癌基因表达的失活及染色体螺旋程度增加.笔者通过对基因组DNA甲基化理论研究进行综述,使广大医学研究工作者掌握DNA甲基化如何影响染色体结构、基因的沉默与重新激活、基因印记、以及遗传 病和癌症发生发展的规律.
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CpG寡脱氧核苷酶对2型糖尿病患者外周血Th1/Th2型免疫应答的调节作用
目的观察CpG寡脱氧核苷酶(ODN)对2型糖尿病(T2DM)患者外周血单个核细胞(PBMC)γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-12以及IL-10表达的影响.方法将20例T2DM患者和20名健康人PBMC根据刺激物不同分为空白对照组、CpG ODN组(2 μmol/L).用实时足量聚合酶链反应(real time-PCR)法检测PBMCIFN-γmRNA、IL-12 mRNA和IL-10 mRNA的表达.结果T2DM患者PBMC空白对照组IFN-γ mRNA和IL-12 mRNA的表达低于健康人(P＜0.01,P＜0.05),IL-10 mRNA的表达与健康人相似(P＞0.05).经CpGODN刺激,IFN-γ mRNA和IL-12 mRNA的表达高于空白对照组(P＜0.01,P＜0.01),但低于健康人(P＜0.01,P＜0.05),IL-10 mRNA的表达与空白对照组相似(P＞0.05),与健康人差异无统计学意义(P＞0.05).结论CpGODN可促进T2DM人PBMC产生IFN-γ和IL-12,增强Th1型免疫反应.
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牛种布鲁氏菌TLR9-CpG-DNA免疫信号通路活性检测
目的 检测牛种布鲁氏菌TLR9-CpG-DNA免疫信号通路活性.方法NCBI网站上下载Brucella abortus A13334全部基因组序列,利用生物信息学的方法筛选CpG基序,合成天然骨架的脱氧寡核苷酸(ODNs),转染小鼠单核巨噬细胞株RAW264.7收集上清,Elisa检测炎性因子干扰素IFN-α的分泌水平.结果共筛选出1 935条牛种布鲁氏菌CpG,选其中二级茎环结构较好的5条序列合成ODNs,Elisa结果显示,序列M1分泌的IFN-α浓度与对照序列相比表达量增高差异有统计学意义.结论宿主TLR9识别牛种布鲁氏菌CpG基序,从而活化免疫信号通路.
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IL-12和CpG疫苗佐剂体内对特异性CD4+T细胞免疫应答的影响
目的:观察IL-12和CpG作为疫苗佐剂在体内促进抗原特异性CD4+T细胞的分化和IFN-γ的产生异同.方法:自CD4+T细胞受体转基因(TCR-Tg)小鼠脾和淋巴结分离CD4+T细胞,体外利用CFSE进行标记,然后被动输给相同基因的正常小鼠.经OVA、OVA+IL-12或OVA+CpG免疫后,观察抗原特异性CD4+T细胞的组织分布,IFN-γ的表达以及与细胞分裂之间的关系.结果:未经OVA抗原免疫的小鼠,抗原特异性CD4+T细胞未见有增殖反应.当经OVA抗原免疫后,可见脾和肺组织中细胞增殖;IFN-γ+细胞在脾脏、淋巴结和肺组织表达的阳性率很低,其范围为0.93%～2.17%.当经OVA+IL-12免疫后,IL-12促进IFN-γ的表达,阳性率为4.53%～26.79%;而经OVA+CpG免疫后,CpG只促进淋巴结中IFN-γ的表达(3.84%).IFN-γ表达的细胞主要为分裂3～5次的细胞.结论:IL-12和CpG作为疫苗佐剂均可促进IFN-γ产生,促进细胞免疫应答.
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Rab7负向调控巨噬细胞中CpG诱导的细胞因子的表达
目的:研究Rab7过表达及失活突变(Rab7T22N)对CpG刺激的RAW264.7巨噬细胞中分泌细胞因子的影响.方法:采用RT-PCR和Real-time PCR检测RAW264.7细胞中Rab7在CpG刺激下表达模式.将Rab7真核表达质粒及失活突变质粒Rab7T22N 通过脂质体法转染RAW264.7细胞,G418稳定筛选,Western法鉴定表达效果.用CpG刺激稳定表达Rab7的RAW264.7细胞系,RT-PCR和Real-time PCR检测细胞因子IL-6、IL-1β、IFN-β的表达量变化.结果:CpG刺激RAW264.7后,Rab7 mRNA表达水平逐渐增高,在8小时达到高峰,表达增高近4倍.Rab7过表达后,CpG刺激后产生的IL-6、IL-1β、IFN-β显著降低.巨噬细胞中Rab7失活突变后,在CpG刺激后IL-6、IL-1β、IFN-β的表达又显著增加.结论:CpG促进RAW264.7巨噬细胞中Rab7 mRNA的表达,Rab7抑制了CpG刺激的巨噬细胞中IL-6、IL-1β、IFN-β的表达,该抑制作用的发挥与其酶活性的GTP结合有关.该研究为进一步阐明Rab7在CpG/TLR9信号通路中的作用奠定了基础.
关键词： RAB7 CpG Rab7T22N RAW264.7细胞 -
Rab5a促进CpG诱导的巨噬细胞中炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达
目的：采用稳定表达Rab5a及其显性负性突变体Rab5aN133I的巨噬细胞系RAW264.7，研究Rab5a及其突变体过表达后对 CpG 诱导的炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达的影响。方法：通过脂质体法将 Rab5a 及其突变体Rab5aN133I的真核表达载体转染到RAW264.7细胞中，用G418选择性培养基进行筛选，建立稳定表达Rab5a、Rab5aN133I的细胞系。通过RT-PCR、Real time-PCR和Western blot方法鉴定稳定表达的细胞系。用CpG刺激稳定表达Rab5a、Rab5aN133I的细胞系8 h后检测细胞因子TNF-α、IL-1β和IFN-β的表达量变化。结果：RAW264.7转染Rab5a真核表达载体后Rab5a的表达量显著高于对照质粒转染细胞（ P＜0.05）。 Rab5a过表达后，在CpG刺激作用下RAW264.7分泌的TNF-α、IL-1β显著升高（P＜0.01），IFN-β的分泌也显著升高（P＜0.05），而Rab5aN133I过表达后上述细胞因子的分泌均有所恢复。结论：Rab5a促进了 CpG诱导的巨噬细胞中炎性细胞因子和Ⅰ型干扰素的表达，Rab5a可能是TLR9信号通路的正向调控蛋白。
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脐带来源间充质干细胞对人B细胞系细胞的调控
目的:探讨脐带来源的MSC对B细胞生长、活化、功能、信号通路的影响,为阐明MSC对B细胞的调控以及作用机制提供理论基础.方法:以人非Hodgkin淋巴瘤B细胞系Daudi、Namalwa和Raji为研究模型,在CpG刺激和不刺激下,与脐带MSC分别共培养3天后,收集悬浮的B细胞,进行细胞计数,PI染色检测细胞周期,Annexin V染色检测凋亡;流式细胞仪检测表面免疫球蛋白、MHC分子和共刺激分子的表达,Transwell实验证明细胞接触的依赖性.实时定量PCR检测与MSC共培养6、12、24、48 h后细胞因子的mRNA水平.Western blot检测MAPK、JAK-STAT、PI3K信号通路蛋白的激活情况,抑制剂证明信号通路对细胞功能的影响.结果:MSC可阻滞Namalwa和Raji于G0/G1期,对3种B细胞系增殖和凋亡没有显著影响;显著抑制Daudi、Namalwa表面IgM的表达和3种B细胞表面CD86的表达,且抑制效应不依赖细胞接触和COX2的作用;显著上调Daudi内CCL2、COX2、IL-8的mRNA水平.但不影响TNF-α;显著激活3种细胞株上的ERK信号,ERK抑制剂可减弱MSC对Daudi表面分子和CCL2的调控.结论:MSC可阻滞B细胞系周期,通过分泌可溶性因子抑制B细胞系表面分子的活化、促进细胞因子的产生,ERK信号通路参与了MSC对B细胞系上述功能的调控,提示MSC抑制B细胞的免疫效应从而在治疗免疫疾病上发挥重要作用.
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含CpG序列PRRSV ORF5基因真核质粒对猪体免疫作用研究
目的:为了增强猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)DNA疫苗免疫效力,以pVAX1为真核表达载体,以PRRSV ORF5基因为目的基因,构建了含有CpG和PRRSV ORF5的真核表达质粒CpG-pVAX1-ORF5,并在猪体进行了免疫试验.方法:检测猪PRRSV的特异性抗体滴度、IL-2水平以及淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平,并做了攻毒保护试验.结果:试验结果表明本试验构建的含CpG基序真核重组表达质粒CpG-pVAX1-ORF5能诱导产生针对PRRSV的体液免疫与细胞免疫(显著的淋巴细胞增殖反应水平).攻毒结果表明CpG-pVAX1-ORF5组能够有效地抵抗经鼻攻毒,可以保护猪轻微病毒血症,比对照组减少80%,也不表现临床症状,对肺的损害能提供部分保护.结论:CpG的加入可使免疫猪的病变减轻或消失.从而表明含有CpG-ODN能作为PRRSV DNA疫苗的有效佐剂.
关键词： 猪繁殖与呼吸综合征病毒 ORF5基因 CpG DNA免疫
