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腓骨肌萎缩症RAB7基因突变分析
目的 探讨RAS相关GTP结合蛋白7 (RAB7)基因在中国人腓骨肌萎缩症的突变特点.方法 应用聚合酶链反应-单链构象多态性(PCR-SSCP)并结合DNA序列分析的方法,对已经排除PMP22的大片段重复突变和PMP22、MPZ、Cx32、NEFL、GDAP1、Hsp22、Hsp27点突变的33例患者进行RAB7 基因突变分析.结果 33例患者所有外显子PCR产物量和特异性均较好,但SSCP均未出现异常条带,未发现RAB7基因突变.结论 RAB7基因突变可能在中国人腓骨肌萎缩症患者中少见.
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p150glued缺失对神经元中Rab蛋白表达水平的影响
目的 探讨家族性运动神经元病致病基因DCTN1编码的p150glued蛋白缺失对于原代培养的皮质神经元细胞活性及Rab蛋白表达的影响.方法 以野生型(WT)和p150glued缺失(p150glued KO)新生小鼠为细胞来源,体外培养皮质神经元7d和14d后,分别利用MTT法和Western blot法检测皮质神经元存活率以及Rab蛋白家族成分表达水平.结果 与WT小鼠皮质神经元相比,p150glued KO小鼠皮质神经元在体外培养7d和14d时,细胞活力无明显差异,14d时Rab4、Rab5、Rab9、Rab11、Rab24蛋白表达水平未发生显著变化,而Rab7蛋白表达水平显著降低(P<0.001).结论 p150glued缺失对原代皮质神经元存活以及调控囊泡运输的Rab蛋白家族中Rab4、Rab5、Rab9、Rab11、Rab24的表达水平无明显影响,但特异性减弱晚期内体标志物Rab7蛋白的表达,可阻碍胞内溶酶体降解通路.
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Rab7GTPase负向调节巨噬细胞中poly I:C诱导的细胞因子的表达
目的:通过构建Rab7的失活突变载体tRab7(Rab7T22N),研究Rab7失活突变后对poly I:C诱导的RAW264.7巨噬细胞中细胞因子的影响.方法:利用PCR定点突变法构建Rab7的失活突变载体Rab7T22N,将Rab7的真核表达载体及其突变体tRab7通过脂质体法瞬时转染RAW264.7细胞,通过Western blot方法检测Rab7的表达情况.poly I:C刺激转染细胞不同时间后检测细胞因子IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达变化.结果:Western blot检测结果显示,与转染空质粒的对照细胞相比,转染Rab7和tRab7的细胞中Rab7的蛋白水平显著增高.Rab7过表达后,抑制了巨噬细胞RAW264.7中poly I:C刺激后IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的产生,而Rab7失活突变体tRab7(Rab7T22N)过表达后显著促进了IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达.结论:Rab7抑制了poly I:C刺激的巨噬细胞中IFN-β、IP10、TNF-α和IL-1β的表达,该抑制作用依赖于其GTP结合活性.本研究为进一步阐明Rab7在TLR3信号转导通路中的作用奠定了基础.
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Rab7负向调控巨噬细胞中CpG诱导的细胞因子的表达
目的:研究Rab7过表达及失活突变(Rab7T22N)对CpG刺激的RAW264.7巨噬细胞中分泌细胞因子的影响.方法:采用RT-PCR和Real-time PCR检测RAW264.7细胞中Rab7在CpG刺激下表达模式.将Rab7真核表达质粒及失活突变质粒Rab7T22N 通过脂质体法转染RAW264.7细胞,G418稳定筛选,Western法鉴定表达效果.用CpG刺激稳定表达Rab7的RAW264.7细胞系,RT-PCR和Real-time PCR检测细胞因子IL-6、IL-1β、IFN-β的表达量变化.结果:CpG刺激RAW264.7后,Rab7 mRNA表达水平逐渐增高,在8小时达到高峰,表达增高近4倍.Rab7过表达后,CpG刺激后产生的IL-6、IL-1β、IFN-β显著降低.巨噬细胞中Rab7失活突变后,在CpG刺激后IL-6、IL-1β、IFN-β的表达又显著增加.结论:CpG促进RAW264.7巨噬细胞中Rab7 mRNA的表达,Rab7抑制了CpG刺激的巨噬细胞中IL-6、IL-1β、IFN-β的表达,该抑制作用的发挥与其酶活性的GTP结合有关.该研究为进一步阐明Rab7在CpG/TLR9信号通路中的作用奠定了基础.
关键词： RAB7 CpG Rab7T22N RAW264.7细胞 -
Rab7基因沉默对巨噬细胞中R848激活的细胞因子及MAPK信号通路影响
目的:本实验阐述了Rab7对Raw264.7巨噬细胞中R848激活TLR7(Toll like receptor-7)所产生的细胞因子的影响,并探讨Rab7对MAPK信号转导的影响.方法:使用Rab7刺激silence-Rab7-Raw264.7细胞,检测R848激活TLR7后产生的TNF-α、IL-6、IFN-α、IFN-β与IP-10,通过Western blot检测MAPK的磷酸化水平,分析Rab7对MAPK的信号转导的作用.结果:Rab7对TLR7激活后细胞因子的产生具有抑制作用,Rab7对MAPK信号通路具有抑制作用.结论:本实验结果进一步说明Rab7 是TLR7信号转导通路的负向调控因子,并且参与到MAPK信号通路中.
关键词： RAB7 TLR7 RAW264.7细胞 MAPK -
人类Rab7的结构与功能
Rab蛋白家族是一类Ras相关的GTP结合蛋白,在细胞中发挥确保囊泡转运特异性定位的作用.作为Rab家族的一员,Rab7与其他的Rab成员间既有相似性,又有特异性.其相似性表现在:Rab7与其他的Rab成员有着相似的结构、相似的异戊二烯化过程以及相似的GDP/GTP结合功能;特异性表现在:Rab7特异识别晚期胞内体等囊泡,介导晚期胞内体与溶酶体的膜融合以完成溶酶体转运,发挥特有的生物学功能.Rab7蛋白的功能缺陷和多种人类遗传疾病相关.
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Rab7真核表达载体的构建及其在小鼠巨噬细胞RAW264.7细胞中的表达
目的 构建Rab7的真核表达载体,研究其在小鼠巨噬细胞RAW264.7中的表达.方法 RT-PCR方法分析Rab7在组织和细胞中的表达.以RAW264.7细胞的cDNA为模板,根据GenBank公布的小鼠Rab7全长序列设计引物,扩增Rab7基因的开放阅读框.将其与真核表达载体pcDNA3.1(-)连接,构建pcDNA-Rab7重组质粒.用脂质体将Rab7真核表达载体瞬时转染RAW264.7细胞,RT-PCR和Western blot法鉴定Rab7的过表达.结果 Rab7重组载体测序结果与GenBank中报道的Rab7序列的同源性为100％.RT-PCR和Western blot结果显示Rab7真核表达载体瞬时转染RAW264.7细胞后,Rab7表达显著增高.结论 成功构建了Rab7真核表达载体.为今后研究Rab7在巨噬细胞中的功能奠定了基础.
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Rab7与NPC1在小胶质细胞及小鼠小脑普肯耶细胞的定位
目的:观察Rab7与NPC1蛋白在小胶质细胞及小鼠小脑普肯耶细胞的定位及其与溶酶体的关系.方法:采用特异性识别Rab7、NPC1的抗体和溶酶体的特异性表面标记进行免疫荧光细胞化学染色及免疫荧光组织化学染色,在激光共聚焦显微镜下观察.结果:Rab7和NPC1表达于小胶质细胞及小鼠小脑普肯耶细胞溶酶体,Rab7与NPC1共定位于小胶质细胞及npc+/+与npc-/-小鼠小脑普肯耶细胞细胞质内,两者分布有良好的相关性. 结论:Rab7对NPC1蛋白的正常功能可能有重要影响.
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Rab7在乳腺癌细胞中的表达及对信号EGFR的影响
目的:Rab7在两种乳腺癌细胞中的表达以及其对EGFR信号的影响.方法:培养乳腺癌细胞MCF-7与MDA-MB231,运用Western blot法检测Rab7在乳腺癌细胞MCF-7与MDA-MB231中的表达.通过脂质体转染法转染乳腺癌细胞MCF-7,筛选稳定表达质粒,运用Real-time PCR法检测siRNA对Rab7的干扰效果.MTT实验检测干扰Rab7后对乳腺癌MCF-7细胞生长情况的影响.Western blot法检测干扰Rab7后对MCF-7细胞中EGFR表达量的影响.结果:(1)Western blot检测结果示,Rab7在乳腺癌MCF-7与MDA-MB231细胞中均有表达,且在MCF-7细胞中高表达,与MDA-MB231细胞相比较,有统计学意义(P<0.05).(2)Real-time PCR检测结果示,siRNA能够有效干扰Rab7的表达.(3)MTT实验结果示,与无干扰试剂的non-silencing组相比,Rab7-siRNA细胞组的增值能力增强.(4)Western blot结果表明,与无干扰组相比比较,干扰组中的EGFR表达量明显增多,且在25、60min时,有统计学意义(P<0.05).结论:(1)Rab7在乳癌细胞MCF-7与MDA-MB231中均有表达,且在MCF-7细胞中高表达.(2)瞬时转染的干扰因子成功地沉默了Rab7,且沉默后的Rab7基因促进了细胞MCF-7的生长,促使EGFR的蛋白表达量增加.
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SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM和Rab7的相互作用
目的 研究Rab7在结核分枝杆菌毒力因子分泌性酸性磷酸酶(SapM)诱导的自噬体-溶酶体融合阻断中的作用.方法 采用Rab7小干扰RNA(siRab7)转染Raw264.7细胞,Western blot法检测P62蛋白水平.mCherry-SapM转染Raw264.7细胞后免疫荧光检测SapM与Rab7共定位情况,免疫共沉淀分析SapM与Rab7的关系.用3种SapM的突变体SapM △ARCA,SapM△FRED和SapM △CT转染Raw264.7细胞,分析SapM的不同突变体与Rab7的关系.结果 siRab7处理后,细胞P62水平显著增高;免疫组织化学染色结果显示SapM与Rab7在胞内共定位;免疫共沉淀分析显示SapM与Rab7可相互沉淀;3种不同突变形式的SapM中,只有SapM△CT不能与Rab7相互作用.结论 SapM诱导的自噬体-溶酶体融合阻断依赖于SapM与Rab7的相互作用.
关键词： 分泌性酸性磷酸酶(SapM) 自噬 RAB7 融合 -
Rab7在自噬体和溶酶体融合过程作用的研究进展
自噬体与溶酶体的有效融合是细胞发挥自噬功能对细胞内多余物质进行降解和再利用的关键.自噬体与溶酶体的融合受控于复杂的信号通路网络,涉及多个环节及众多分子的协同作用,并与内吞机制有部分重叠.Ras相关蛋白7(Rab7,小GTP酶家族的成员)可能是自噬体与溶酶体的融合进程中为重要的分子之一,在指导自噬体成熟、胞内负荷运输及与溶酶体的对接与融合过程中发挥重要调节功能.自噬体与溶酶体的融合障碍可引起先天性及适应性免疫应答异常,导致炎症、肿瘤及胞内微生物感染的加重.因此控制Rab7的活性可能成为治疗这些疾病的潜在靶点.
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乳腺癌中相关Rab蛋白的研究进展
乳腺癌发生、发展、转移及预后涉及多基因参与,一般来说由多种癌基因激活与抑癌基因失活所致.随着分子生物学不断发展,从上世纪以来,乳腺癌发病率逐年上升,越来越影响女性健康发展,成为女性恶性肿瘤热点.本文对相关Rab蛋白(Rab5、Rab7)在乳腺癌发生、发展及转移中进行综述.
