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p38α丝裂原活化蛋白激酶在食管鳞癌细胞Eca109中的功能研究
目的 探讨p38α丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)在食管鳞癌细胞Eca109中的可能作用.方法 构建p38α特异性的shRNA干扰载体,瞬时转染Eca109细胞,运用qRT-PCR、免疫印迹分别检测p38α干扰后在mRNA、蛋白水平上的沉默效果；运用MTT和流式细胞仪检测p38α干扰后Eca109细胞增殖,细胞周期和凋亡的变化；运用细胞划痕实验检测p38α干扰后细胞迁移能力的改变.作为平行反向验证,转染含有p38α全长cDNA的真核过表达质粒,运用免疫印迹检测p38α过表达后在蛋白水平上的表达效果；运用MTT和流式细胞仪检测p38α过表达后细胞增殖,细胞周期和凋亡的变化；运用细胞划痕实验检测p38α的变化后细胞迁移能力的改变.结果 p38α基因在受干扰后,测定其蛋白水平表达水平(22.970±2.857)较空质粒组(35.658 ±2.286)降低,差异具有统计学意义(t=-4.475,P＜0.01).观察Eca109细胞的增殖变化,发现干扰48 h后吸光度值(0.951±0.086)大于对照组细胞(0.811 ±0.012)(t=3.20,P＜0.05),表明Eca109细胞增殖加快.观察细胞周期和凋亡变化发现,干扰48 h后凋亡率(17.400±5.495)较空质粒组(1.000 ±0.721)增加(t=40.06,P＜0.01)；干扰72 h后细胞迁移速度(0.034±0.031)较空质粒组(0.278±0.021)加快(t=-5.79,P＜0.01),表明浸润能力增加.p38α在过表达后,检测到其内源性p38α蛋白表达水平(41.170±2.357)高于对照组(35.658±2.286)(t=4.41,P=0.005)；48 h过表达组吸光值(0.472±0.089)与对照组细胞吸光值(0.811±0.012)相比,细胞增殖受到抑制(t=-7.50,P＜0.01),细胞生长活动在G1期受阻(t=4.80,P＜0.01),并且其细胞凋亡(32.233±1.457)高于空质粒组(1.000±0.721)(t=17.20,P＜0.01),细胞迁移[(0.770±0.054) mm]较空质粒组[(0.278±0.021) mm]减慢并且浸润受到抑制(t=11.00,P＜0.01).结论 p38dMARK抑制食管鳞癌细胞Eca109的发生发展过程.
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南蛇藤提取物对过表达mTOR的人肝癌HepG2细胞株的影响
目的:构建过表达雷帕霉素靶蛋白(Mammalian Target of Rapamycin,mTOR)的人肝癌HepG2细胞,并研究中草药南蛇藤Celastrus orbiculatus Thunb.提取物对该细胞的影响.方法:利用分子生物学技术,将GV238-mTOR重组质粒转染人肝癌HepG2细胞,分别用荧光素酶活性检测和Western Blot实验,分析转染后的细胞中mTOR的表达水平.人肝癌HepG2/mTOR++细胞中,加入不同浓度的南蛇藤提取物(20、40、80、160、320 μg·mL-1)作用24 h后,分析南蛇藤提取物对mTOR蛋白的作用.结果:经转染的人肝癌HepG2细胞中,mTOR蛋白的表达水平显著增加.南蛇藤提取物明显抑制肝癌细胞的增殖,并明显降低细胞内mTOR蛋白的表达.结论:本实验成功获得能稳定过表达mTOR的人肝癌HepG2细胞株.南蛇藤提取物明显抑制肝癌细胞内mTOR蛋白的表达水平.
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非小细胞肺癌中CCR5的表达及临床意义
目的:检测CCR5在非小细胞肺癌(NscLc)中的表达情况,探讨其临床意义.方法:采用免疫组织化学方法联合检测100例NSCLC和16例癌旁组织中CCR5的表达.结果:CCR5在NSCLX中的表达阳性率显著高于癌旁组织(71%vs 25%,p<0.05).在有淋巴结转移的肺癌组织的表达高于无淋巴结转移的肺癌组织的表达(89.3%、vs 47.7%,p<0.05),且与NscLc的TNM分期相关(P<0.05).结论:CCR5在NSCLC中有过表达现象,过表达CCR5可作为反映NSCLC细胞转移能力和临床分期的参考指标之一.
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过表达Lin28a/Lin28b对let-7家族活性的影响
研究在HeLaS3细胞中过表达Lin28a/Lin28b对let 7家族miRNA表达水平和活性的影响.首先,构建Lin28a和Lin28b的表达载体pAAV2neo-Lin28a和pAAV2neo-Lin28b,分别转染HeLaS3细胞并筛选获得Lin28a和Lin28b的稳定表达细胞株HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b.然后,以pAAV2neo-Gluc-(Fluc)为基本骨架,构建并获得检测let 7家族miRNA活性的8种质粒型载体,并包装为相应的重组腺相关病毒(Recombinant adeno-associated virus,rAAV),作为检测miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的传感器,命名为Asensor.在此基础上,以HeLaS3细胞为对照,用Western blot检测HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中Lin28a和Lin28b表达水平,用QRT PCR测定let-7家族各成员表达水平,用Asensor检测let-7家族各成员活性.Western blot结果显示,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a和HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b均能有效地表达Lin28a和Lin28b蛋白；QRT-PCR检测结果显示,相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28a细胞中let-7家族各成员表达水平都下降(除let-7e外),但不同成员下降幅度存在差异；Asensor检测结果显示,let-7家族所有成员活性水平都下降,但不同成员下降幅度也存在差异,且同一成员活性水平与表达水平及其下降趋势也不一致.相比于HeLaS3细胞,HeLaS3/pAAV2neo-Lin28b细胞中let-7家族成员的表达和活性水平均明显下降,但表达水平的下降幅度比HeLaS3/pAAV2neo Lin28a细胞大,而活性的下降幅度却与之相近.本研究建立了一种检测和比较miRNA靶序列介导的转录后抑制活性的方法,首次研究了过表达Lin28a和Lin28b对细胞中的let 7家族miRNA活性影响,并发现Lin28a和Lin28b对let-7家族miRNA表达水平的影响和对其相应活性的影响不一致性,说明在检测miRNA表达水平的同时检测miRNA活性能更全面揭示miRNA的调节功能,为进一步研究let-7家族的调控机制奠定了基础.
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PNPLA3基因表达以及干扰腺病毒的构建及鉴定
目的 构建糖脂代谢和脂肪肝相关基因PNPLA3过表达以及干扰腺病毒载体并加以鉴定.方法 根据PNPLA3基因序列设计过表达以及干扰序列引物,定向克隆人穿梭载体pAdTraek-CMV的Bgl Ⅱ和Xho I位点,干扰序列克隆人pAdTrack-U6穿梭载体,Pme I酶切线性化穿梭质粒与腺病毒载体(pAdEasy-1质粒)共转化E.coli BJ5183感受态细菌产生重组腺病毒载体,用Pac I酶切线性化的回收质粒转染293A细胞包装腺病毒颗粒,在倒置荧光显微镜下观察293A细胞绿色荧光蛋白的表达,并初步观察其感染小鼠原代细胞的效率.结果 测序、酶切鉴定证实,构建出了PNPL43基因过表达及干扰腺病毒载体.包装的腺病毒浓缩悬液滴度为1.5×10<'11>VP/mL.以120感染复数感染小鼠肝脏原代细胞,感染效率可达到90%以上,干扰效率超过80%以上.结论 成功构建了PNPLA3基因的过表达以及干扰腺病毒载体.
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慢病毒介导E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制
目的 探索E2F-1基因过表达抑制人胃癌MGC-803细胞增殖的分子机制.方法 用携带E2F-1基因的重组慢病毒颗粒(LV-E2F-1-GFP)感染人胃癌MGC-803细胞,作为实验组(LV-E2F-1-GFP组);以对照慢病毒颗粒(LV-GFP)感染人胃癌MGC-803细胞,作为阴性对照组(LV-GFP组);空白对照组常规培养,不做任何处理.用RT-PCR和Western blot技术检测细胞中Skp2、Bax、Bcl-2和survivin基因的表达.结果 与LV-GFP组和空白对照组比较,LV-E2F-1-GFP组人胃癌MGC-803细胞Skp2、Bcl-2和survivin基因的mRNA和蛋白的表达降低(P＜0.05),Bax基因的mRNA和蛋白的表达上调(P＜0.05).结论 慢病毒介导E2F-1基因过表达可能通过降低Skp2、survivin、Bcl-2 基因表达和上调Bax基因表达来抑制人胃癌MGC-803细胞增殖.
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hPOT1基因过表达对HeLa细胞细胞周期和凋亡的影响
目的观察人POT1(protection of telomeres 1)基因过表达对HeLa细胞细胞周期和细胞凋亡的影响.方法利用本课题组构建的hPOT1基因真核表达重组质粒pcDNA3-hPOT1,经脂质体介导瞬时转染HeLa细胞;通过RT-PCR和EMSA法(电泳迁移率改变分析)检测外源基因的表达效果,流式细胞术分析细胞周期,Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡.结果 pcDNA3-hPOT1重组质粒转染HeLa细胞48 h后,mRNA和蛋白质分析表明,外源性hPOT1基因能在HeLa细胞中有效表达,HeLa细胞阻滞于细胞周期S期,而对凋亡无明显影响.结论 hPOT1基因可能参与了高等真核细胞细胞周期调控过程,但与细胞凋亡无密切关系.
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人NSPc1慢病毒过表达系统的建立与鉴定
目的 建立并鉴定人NSPc1慢病毒过表达系统,以便应用过表达技术进一步研究NSPc1功能.方法 设计针对人NSPc1cDNA序列的带酶切位点引物,PCR扩增获得双链DNA后,与酶切后的pLenti6-TO-EGFP-TRIP载体片段进行连接、转化,酶切及DNA测序鉴定重组克隆.提取阳性克隆质粒,转染293T细胞并用Western blot检测质粒过表达效果.用293T细胞制备慢病毒颗粒,感染293T细胞后收集细胞全蛋白,用Western blot检测慢病毒系统过表达效果.结果 证实人NSPc1正确插入慢病毒载体,人NSPc1慢病毒过表达质粒及相应病毒颗粒能有效过表达NSPc1.结论 人NSPc1慢病毒表达系统的成功建立,为应用过表达技术研究人NSPc1功能打下了基础.
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RACK1过表达和低表达HUVEC细胞系的建立和鉴定
目的：建立有活性的蛋白激酶C受体1（RACK1）过表达和低表达人脐静脉内皮细胞系（HUVEC），为进一步从分子水平研究RACK1在心律失常中的作用机制提供有效手段。方法扩增RACK1基因的全长cDNA序列，并插入pIRES2-EGFP获得过表达载体pIRES2-EGFP-RACK1；同时，设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列，亚克隆至pGenesil-1得到相应的干扰载体；脂质体转染法将重组体及相应的空质粒分别转染至HUVEC细胞，经 G418筛选抗性细胞克隆， qRT-PCR 及 Western blot 鉴定 RACK1 mRNA 和蛋白的表达。结果RACK1真核表达载体和RNA干扰载体构建成功。重组体经脂质体法转染HUVEC 48 h后，经G418筛选3周得到细胞抗性克隆，qRT-PCR及Western blot结果证实了过表达载体和干扰载体能有效的增强和沉默HUVEC细胞中RACK1的表达。结论成功建立了RACK1过表达和低表达HUVEC细胞系。
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IMP3在区分淋巴结转移性黑色素瘤和良性痣中的诊断价值
基于原发性黑色素瘤的 Breslow 深度,前哨淋巴活检被认为是皮肤黑色素瘤的分期标准,而且是重要的预后因素之一.但是当淋巴结内良性痣细胞与转移黑色素瘤细胞相似时,对标本的组织学分析就很困难.胰岛素样生长因子Ⅱ信使 RNA 结合蛋白3(IMP3),又名K同源决定域蛋白,在癌和 523S 细胞中呈过表达, IMP 家庭中的成员,而且已经发现它在区分皮肤黑色素瘤和良性痣方面具有诊断价值.
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乳腺癌中染色体端粒延长表型与HER-2基因的过表达有关(英)
人类肿瘤中约10%～15%的染色体端粒酶无活性,其中部分病例端粒长度是通过替代性端粒延长(ALT)重组机制来维持的.ALT表型普遍存在于某些肉瘤和生殖细胞肿瘤中,而在癌中却很少见.本研究证实了乳腺癌中有ALT表型的分子亚型存在,尤其是在HER-2过表达的乳腺癌亚型中.
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乳腺癌中分子病理学的应用及进展
肿瘤临床试验虽为肿瘤的诊断、治疗提供了有效的证据,但尚缺乏对特定个体提供适合的方案.对于乳腺癌患者,雌激素受体(ER)表达阳性和阴性与否,人表皮生长因子受体2(HER2)是否过表达,这些肿瘤细胞分子对于乳腺癌的诊断、治疗、预后以及预防具有重大意义.
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PhoP/PhoR基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv的构建及鉴定
目的 构建PhoP和PhoR基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv(以下简称H37Rv),检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv菌株PhoP/PhoR基因的表达水平. 方法 提取并鉴定结核分枝杆菌重组穿梭质粒pMV361-PhoP和pMV361-PhoR,利用电转化技术将结核分枝杆菌重组穿梭质粒pMV361-PhoP和pMV361-PhoR导2H37Rv的感受态细胞中,构建PhoP/PhoR基因过表达H37Rv,应用实时荧光定量PCR检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达水平. 结果 成功构建PhoP/PhoR基因过表达H37Rv.应用实时荧光定量PCR检测不同电压条件下电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达水平,其中在电压为2 300～2 500 V的范围内,电压越高,电转化菌的PhoP/PhoR基因表达量越高. 结论 成功构建了PhoP/PhoR基因过表达H37Rv菌株,以电压为2 500 V电转化构建的PhoP/PhoR基因过表达H37Rv的PhoP/PhoR基因表达量较高.
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pup/mpa/dop/pafA基因过表达结核分枝杆菌国际标准强毒株H37Rv和无毒株H37Ra的构建
目的 构建pup/mpa/dop/pafA基因过表达结核杆菌国际标准强毒株H37Rv和无毒株H37Ra. 方法 提取已构建的结核杆菌—大肠埃希菌重组穿梭质粒PMV361pup,PMV361mpa,PMV361dop和PMV361pafA,利用电转化方法分别转入H37Rv和H37Ra感受态细胞,构建pup/mpa/dop/pafA基因过表达H37Rv和H37Ra,同时优化电转化脉冲电压,并应用QRT-PCR进行检测及鉴定. 结果 成功构建了pup/mpa/dop/pafA基因过表达H37Rv和H37Ra,重组菌均能表达目的基因,在2 100～2 300 V脉冲电压范围内构建的菌株目的基因相对表达量与电压呈正相关. 结论 构建的pup/mpa/dop/pafA基因过表达H37Rv和H37Ra均能表达相应目的基因,以电压为2 300 V电转化构建的菌株表达量较高.
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胃癌HER2检测指南
胃癌是全球常见的消化系统恶性肿瘤,中国为高发区,其预后较差.据报道约20%的进展期胃癌有HER2过表达或扩增[1-3].一项国际多中心随机对照Ⅲ期临床研究(ToGA试验)的结果显示,化疗联合针对HER2的曲妥珠单抗治疗可显著延长进展期胃癌患者的生存期[4-5],基于这一结果,2010年欧洲药品管理局及美国食品和药品管理局(FDA)先后批准化疗联合使用曲妥珠单抗治疗HER2阳性胃及胃和食管交界处癌(以下统称胃癌)患者.
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ARID1A基因突变体的构建及其在肝癌细胞中的过表达鉴定
目的 构建人类染色体重塑复合物SWI/SNF(Switch/Sucrose NonFermentable)中重要组份ARID1A(A-T rich interaction domain)的突变过表达载体,并检测野生型ARID1A基因及突变型ARID1A基因在肝癌细胞株HepG2中的表达情况.方法 采用overlap PCR技术构建在野生型质粒pcDNA6-ARID1A基础上构建结构域缺失突变体pcDNA6-ARID1A/△ARID以及pcDNA6-ARID1A/△DUF3518;利用脂质体转染技术将野生型质粒以及构建的突变型质粒转染到肝癌细胞HepG2中进行过表达;通过Real-time PCR以及Western blot技术对野生型及突变型ARID1A在肝癌细胞中的表达情况进行鉴定.结果 经双酶切后SDS-PAGE分析以及测序验证,成功构建了真核表达载体pcDNA6-ARID1A的突变型质粒pcDNA6-ARID1A/△ARID以及pcDNA6-ARID1A/△ DUF3518;通过Real-time PCR以及Western blot的方法验证,ARID1A及ARID1 A/△ARID在肝癌细胞株HepG2中成功过表达,而ARID1A/△ DUF3518蛋白可能降解.结论 成功构建ARID1A功能域缺失型突变体,并在肝癌细胞株HepG2中稳定过表达ARID1A及ARID1A/△ARID;ARID1A/△ DUF3518蛋白的缺失暗示DUF3518结构域可能起着稳定蛋白结构的功能.
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磷脂酰乙醇胺结合蛋白过表达CHO细胞的建立及对细胞周期的影响
目的 建立过表达磷脂酰乙醇胺结合蛋白(PEBP)的CHO细胞,并研究PEBP过表达对CHO细胞周期的影响.方法 将PEBP克隆于潮霉素B抗性的表达质粒,转染CHO细胞,潮霉素B压力下筛选细胞单克隆,流式细胞法检测细胞周期.结果 建立了与内源性表达量相当的,可稳定过表达外源性PEBP的CHO细胞,与对照细胞克隆比较,过表达PEBP的CHO细胞周期无显著变化.结论 PEBP过表达没有导致CHO细胞周期的改变.
关键词： 磷脂酰乙醇胺结合蛋白 过表达 CHO细胞 细胞周期 -
食管鳞癌组织中表皮生长因子受体表达及基因扩增的临床意义
目的 明确食管鳞癌(ESCC)组织中表皮生长因子受体(EGFR)蛋白表达及基因扩增状况,分析前述指标与ESCC患者临床病理特征、预后的关系.方法 通过组织芯片技术、免疫组化和荧光原位杂交技术(FISH)法,检测手术切除的46例ESCC患者肿瘤组织及20例正常食管黏膜中EGFR蛋白表达情况及基因扩增状态,分析其在肿瘤发生、发展过程中的作用及预后意义,并分析EGFR过表达与基因扩增状态的相关性.结果 ①EGFR于ESCC组织中过表达率为52.2%(24/46),正常上皮组织中无过表达(0/20),差异有显著统计学意义(P<0.001);EGFR过表达与肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况及整体TNM分期相关(P<0.05);EGFR过表达者,累积生存率小于阴性者(P<0.001).EGFR过表达为ESCC独立的预后影响因子.②EGFR基因扩增于ESCC组织中阳性率为26.1%(12/46),正常上皮组织中无阳性者(0/20),差异有显著统计学意义(P<0.001);EGFR基因扩增与肿瘤浸润深度、淋巴结转移情况及整体TNM分期相关(P<0.05);EGFR基因扩增阳性者,累积生存率小于阴性者(P<0.001);EGFR基因扩增为ESCC独立的预后影响因子.③EGFR过表达与基因扩增共阳性者12例(26.1%),两者之间呈正相关(P<0.001,r=0.272).基因扩增阳性标本均存在EGFR过表达.结论 EGFR表达、基因扩增在食管鳞癌组织及正常食管上皮中表达差异具有显著性,且EGFR表达、基因扩增在食管鳞癌的发生、发展中起重要作用,并提示不良预后;EGFR蛋白过表达与基因扩增在食管鳞癌组织中具有相关性.
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过表达Bcl-2雪旺细胞抗凋亡能力的实验研究
目的:探讨凋亡相关基因Bcl-2过表达对抗过氧化氢诱导的雪旺细胞凋亡的影响.方法:构建含有人Bcl-2cDNA的逆转录病毒真核表达载体PLXSN,脂质体法将重组质粒转染PA317细胞,G418筛选阳性克隆,鉴定后浓缩收集病毒液,感染人雪旺细胞株系Schwann's cells,采用Western法检测Bcl-2蛋白表达情况.5mM H2O2作用并诱导细胞凋亡后,流式细胞仪检测细胞凋亡发生变化.结果:成功构建出含目的基因Bcl-2的逆转录病毒表达载体pLBcl-2SN.5mM H2O2成功的诱导雪旺细胞凋亡.Bcl-2逆转录病毒感染雪旺细胞后,Bcl-2蛋白水平呈过高表达,并能显著对抗H2O2诱导的雪旺细胞凋亡.结论:Bcl-2蛋白过表达能够抑制氧化剂诱导的雪旺细胞凋亡.
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有机阴离子转运多肽OATP1A2介导芬太尼的转运
目的:建立稳定表达有机阴离子转运多肽1A2(organic anion-transporting polypeptide 1A2,OATP1A2)的HEK293细胞株,体外研究OATP1A2是否转运芬太尼(Fentanyl).方法:用脂质体转染法将pIRES2-ZsGreen1-OATP1A2质粒转染至HEK293细胞中,G418(600 mg/ml)筛选单克隆阳性细胞,采用Western blot、RT-PCR证实HEK293-OATP1A2构建成功;用不同浓度的探针药物非索非那定(Fexofenadine,FEX)验证HEK293-OATP1A2的转运功能;运用不同浓度的芬太尼孵育细胞,另取两组用相同浓度的芬太尼孵育的细胞,分别加或不加抑制剂柚皮素(Naringenin,100μg/mL)进行HEK293-OATP1A2转运实验.结果:FEX浓度为1、10、100 nM时HEK293-OATP1A2实验组与HEK293-VC对照组,FEX的吸收值均有显著的统计学差异(P<0.05),且FEX浓度为100 nM时,实验组对FEX的吸收值是对照组的2.8倍;加入抑制剂柚皮素组FEX吸收值较不加抑制剂时减少了66.8±0.6%.芬太尼转运结果显示,芬太尼浓度为1、10、100、1000 nM时实验组与对照组比较,芬太尼的吸收值均有显著的统计学差异(P<0.05),且芬太尼浓度为1000 nM时,实验组对芬太尼的吸收值是对照组的2.2倍;加入抑制剂组芬太尼的吸收值较未加抑制剂组减少了86.5±0.5%(P<0.05).结论:成功建立了稳定表达OATP1A2的HEK293细胞株,体外研究发现OATP1A2能介导芬太尼的转运.
关键词： 有机阴离子转运体多肽1A2 芬太尼 底物 转运功能 过表达
