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RACK1过表达和低表达HUVEC细胞系的建立和鉴定
目的：建立有活性的蛋白激酶C受体1（RACK1）过表达和低表达人脐静脉内皮细胞系（HUVEC），为进一步从分子水平研究RACK1在心律失常中的作用机制提供有效手段。方法扩增RACK1基因的全长cDNA序列，并插入pIRES2-EGFP获得过表达载体pIRES2-EGFP-RACK1；同时，设计合成3对短发夹结构的互补DNA序列和一对阴性对照序列，亚克隆至pGenesil-1得到相应的干扰载体；脂质体转染法将重组体及相应的空质粒分别转染至HUVEC细胞，经 G418筛选抗性细胞克隆， qRT-PCR 及 Western blot 鉴定 RACK1 mRNA 和蛋白的表达。结果RACK1真核表达载体和RNA干扰载体构建成功。重组体经脂质体法转染HUVEC 48 h后，经G418筛选3周得到细胞抗性克隆，qRT-PCR及Western blot结果证实了过表达载体和干扰载体能有效的增强和沉默HUVEC细胞中RACK1的表达。结论成功建立了RACK1过表达和低表达HUVEC细胞系。
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刚地弓形虫RACK1蛋白与PKC蛋白结合作用的研究
目的 研究刚地弓形虫RACK1蛋白与PKC蛋白之间的结合特性. 方法 采用PCR方法扩增弓形虫RACK1基因,双酶切后与pGEX 4T-1连接,构建原核表达载体pGEX-4T-1-RACK1,转化入BL21大肠埃希菌中,用0.8mmol/L IPTG诱导表达,表达产物用SDS-PAGE检测并进行Ni-IDA亲和层析纯化,采用Western blot分析RACK1蛋白与PKC蛋白的结合作用. 结果 PCR扩增出966 bp的RACK1基因开放读码框,成功构建pGEX4T-1-RACK1原核表达载体,转化BL21后用IPTG诱导4h～6h,SDS-PAGE检测到约36 ku的表达产物,Western blot检测RACK1蛋白能与PKC蛋白结合. 结论 成功构建了pGEX-4T-1原核表达载体,表达产物RACK1蛋白能与PKC蛋白结合.
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Mpl相互作用蛋白RACK1的筛选与鉴定
目的:筛选新的血小板生成素(TPO)受体胞内区相互作用蛋白并确定相互作用.方法:以TPO受体胞内区为诱饵蛋白,进行酵母双杂交文库的筛选,RT-PCR扩增筛选到的基因并克隆到相应载体上,Western印迹方法检测其在不同组织与细胞内的表达;进行哺乳动物细胞内双杂交、免疫共沉淀、激光共聚焦实验确证相互作用.结果:从酵母双杂交文库筛选到RACK1基因,检测到其在不同组织与细胞内表达都很丰富,哺乳动物细胞内双杂交、免疫共沉淀证明RACK1同TPO受体Mpl的胞内区存在相互作用,而细胞内共定位实验证明两者在哺乳动物细胞内存在共定位现象,即两蛋白的相互作用可能具有生理意义.结论:筛选到的RACK1蛋白同TPO受体Mpl的胞内区存在相互作用.
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Rack1敲低促进TGF-β诱导的A549细胞的上皮-间充质转化
目的 研究Rack1分子在TGF-β诱导A549细胞发生上皮-间充质转化(epithelial to mesenchymal transition,EMT)过程中的功能.方法 制备携带不同Rack1干涉序列的慢病毒颗粒,并感染A549细胞建立稳定细胞系.选取敲低效率较高的细胞系,利用MTS、细胞划痕、免疫印迹等技术检测Rack1敲低后细胞的增殖、TGF-β诱导的迁移及相关分子表达水平的改变.结果 获得了Rack1稳定敲低的细胞系,Rack1敲低后细胞增殖减慢,TGF-β诱导的迁移加快,钙黏蛋白E(E-cadherin)下调和胞外信号调节激酶(extracellular regulated protein kinases,ERK)磷酸化水平升高.结论 Rack1分子敲低促进EMT的发生.
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活化的蛋白激酶C受体1在肿瘤方面的研究进展
1994年,Mochly-Rosen等人成功的从大鼠脑组织的c-DNA文库中克隆出一种全新的、活化的PKC(protein kinase C)受体,其由GNB2L1基因编码,分子量为36kDa,他们将其命名为RACK1 (receptor for activated C kinase 1),即活化的蛋白激酶C受体1[1].
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RACK1、PI3K、Akt蛋白在非小细胞肺癌中的表达及意义
目的 研究RACK1、PI3K及Akt蛋白在人非小细胞肺癌中的表达及意义. 方法 应用免疫组织化学EnVision法检测127例非小细胞肺癌组织(包括癌旁组织45例及非小细胞肺癌组织82例)中RACK1、PI3K及Akt的表达情况. 结果 RACK1、PI3K及Akt在肺腺癌组织中的表达明显高于癌旁组织(P＜0.05);RACK1及Akt蛋白在肺腺癌中表达在不同淋巴结转移及TNM分期间差异有统计学意义(P＜0.05),在不同性别与肿瘤分化程度间差异无统计学意义(P＞0.05);PI3K蛋白表达在不同肿瘤分化程度、淋巴结转移及TNM分期间差异有统计学意义(P＜0.05),在不同性别间差异无统计学意义(P＞0.05).相关性分析结果表明,在肺腺癌中,RACK1表达与PI3K和Akt之间比较均呈正相关性(P＜0.05). 结论 RACK1、PI3K及Akt在非小细胞肺癌中高表达,尤其在肺腺癌的发生发展过程中发挥了一定的作用,其机制可能与RACK1、PI3K及Akt相互作用促进细胞的增殖有关.
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构建以RACK1为核心口腔鳞状细胞癌差异基因间相互作用的关系网路
背景：RACK1与口腔鳞状细胞癌的发生发展密切相关，但肿瘤的发生发展不是一个基因或蛋白决定的，是多基因、多分子呈网络结构，多步骤、多阶段共同作用的长期复杂过程，各肿瘤基因之间相互协同作用促使肿瘤细胞形成和发展。因此要揭示口腔鳞状细胞癌的作用机制将不能局限于单个蛋白或基因，而要着眼于与口腔鳞状细胞癌差异蛋白或基因相关的信号网络通路，研究整个信号通路中相关蛋白或基因的表达变化，进而分析研究这些分子之间的相互作用机制。
目的：筛选出的口腔鳞状细胞癌相关差异基因，使用STRING数据库通过生物信息学的方法构建它们之间的相互作用关系网络，为后续实验提供线索。
方法：根据作者所在课题组前期口腔鳞状细胞癌的经典蛋白组学实验结果和基因表达谱芯片实验的数据结果，选择表达一致且差异相对较大的基因作为实验的差异基因。将筛选的差异基因输入STRING数据库进行分析，找出差异基因对应蛋白之间的可能作用关系，构建相互作用网络结构图。
结果与结论：口腔鳞状细胞癌的19个差异基因对应蛋白相互间构成一个复杂的作用网络，各差异蛋白间通过多条相互作用通路进行调节，RACK1蛋白是整个网络的节点蛋白。GNB2L1的编码蛋白RACK1蛋白通过WD40重复蛋白亚基(编号COG2319)和β-G蛋白亚基(编号KOG0279)与其他差异蛋白的亚基间相互作用。其中WD40重复蛋白(编号 COG2319)与其中5个差异蛋白直接作用并构建了10条相互作用通路，β亚基 G 蛋白(编号KOG0279)与其中8个差异蛋白直接作用并构建了11条相互作用通路。说明通过STRING数据库分析构建了这19个差异基因相互作用的结构网络图发现RACK1蛋白的2个亚基共与8个相关差异蛋白直接作用，产生18条相互作用通路。在这个网络结构中RACK1蛋白是中心，提示其是口腔鳞状细胞癌的一个关键节点蛋白。 -
支架蛋白RACK1小干扰RNA抑制卵巢癌细胞CAOV3的增殖、迁移和侵袭
目的：观察支架蛋白RACK1小干扰RNA（siRNA）对卵巢癌 CAOV3细胞增殖、迁移和侵袭的影响和基质金属蛋白酶（MMP）-2和MMP-9的表达变化。方法体外培养CAOV3细胞，实验分scramble siRNA组和RACK1 siRNA组；Lipofectamine 2000转染CAOV3细胞，Western印迹检测RACK1的干涉效能；MTT法测定CAOV3细胞的增殖率；划痕实验和transwell迁移和侵袭实验研究RACK1对细胞体外增殖、迁移和侵袭运动能力的影响；Western印迹检测CAOV3细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达。结果与scramble siRNA组比较，RACK1 siRNA组RACK1的蛋白表达水平降低，明显抑制CAOV3细胞的增殖、迁移和侵袭，降低MMP-2和MMP-9蛋白表达。结论下调RACK1表达可抑制卵巢癌细胞CAOV3的增殖、迁移和侵袭，其机制可能与改变MMP-2和MMP-9蛋白表达相关。
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Rack1与β-catenin在胃癌组织中的表达与临床意义
目的 研究蛋白激酶1活化受体(protein kinase 1 activation receptors,Rack1)和β-连环蛋白(β-catenin)在胃癌组织中的表达情况,以及与胃癌临床病理特征的关系,探讨二者的相关性及临床意义.方法 采用免疫组织化学SP法检测Rack1与β-catenin在70例胃癌组织和30例距癌组织边缘10 cm以上的癌旁胃组织中的表达情况.结果 与癌旁胃组织相比,Rack1在胃癌组织中的表达明显降低(P＜0.01),β-catenin在胃癌组织中出现明显的膜表达缺失(P＜0.01).胃癌组织中Rack1蛋白的高表达率、β-catenin膜表达的缺失率均在不同TNM分期、肿瘤的分化程度以及有无淋巴结转移方面差异有统计学意义(P＜0.01),而Rack1和β-catenin在胃癌组织的表达水平与不同年龄、性别、肿瘤直径、肿瘤浸润深度方面的差异无统计学意义.胃癌组织中Rack1蛋白表达与β-cantenin膜表达缺失呈显著负相关(r =-0.691,P=0.000).结论 Rack1和β-catenin蛋白的异常表达可能共同参与胃癌的发生发展,并影响胃癌的淋巴转移.
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RACK1在胃癌癌变中的研究进展
RACK1蛋白的异常表达参与胃癌的发生发展,并影响胃癌的淋巴转移.胃癌组织中RACK1蛋白的高表达率与TNM分期、肿瘤分化程度以及淋巴结转移显著相关,RACK1的检测具有较高的临床应用价值.全文就近年来RACK1在胃癌癌变过程中作用的研究做一综述.
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RACK1及其缺失突变体与 CLIC1的共定位研究
目的：运用分子克隆技术构建活化蛋白激酶 C 受体1（RACK1）突变体的真核表达质粒，进行 RACK1突变体的表达、定位及其与胞内氯离子通道蛋白1（CLIC1）蛋白的共定位研究，为其进一步的功能研究奠定基础。方法以RACK1全长 cDNA 序列为模板，构建真核表达质粒 pcD-NA3．1-RACK1-N （1-138）-FLAG、pcDNA3．1-RACK1-C （130-317）-FLAG；Western blot 法检测突变体在哺乳动物细胞中的表达；用免疫荧光技术了解突变体蛋白在哺乳动物细胞中的共定位情况。结果成功构建了 RACK1突变体的真核表达质粒；Western blot 法检测到蛋白主要在胞质中表达，核内有部分表达；免疫荧光实验表明，RACK1及突变体蛋白主要定位在胞质与核膜，细胞核中也有少量表达，与 CLIC1蛋白存在共定位。结论成功构建了 RACK1缺失突变体，并在真核细胞中成功表达；RACK1及突变体与 CLIC1蛋白在哺乳动物细胞中均存在不同程度的共定位，蛋白之间可能存在相互作用，为 RACK1蛋白的功能研究奠定了基础。
关键词： RACK1 质粒构建 转染 免疫荧光 Western blot -
人RACK1蛋白在HEK-293 T和BL21细胞中的表达及COS7细胞的定位
目的构建可以表达有活性的蛋白激酶 C 受体(RACK1)的重组质粒，检测其在细胞内的表达与定位情况。方法设计上下游引物，以RACK1全长cDNA序列为模板， PCR扩增出 RACK1序列，分别构建到载体 pcDNA3.1和pGEX-5X-3。转染pcDNA3.1-FLAG-RACK1到人胚胎肾细胞(HEK-293T)和非洲绿猴肾成纤维细胞(COS7细胞)，转化pGEX-5X-3-RACK1到大肠杆菌 BL21感受态细胞中表达， Western blot法和考马斯亮蓝染色法检测RACK1表达情况，免疫荧光法研究其细胞内定位。结果成功构建了 pcD-NA3.1-FLAG-RACK1和GEX-5X-3-RACK1重组质粒。 West-ern blot证明了其在HEK-293T细胞中的表达，考马斯亮蓝染色显示其在BL21菌株也能大量表达，免疫荧光显示RACK1在COS7的细胞核与细胞质中均有分布。结论人RACK1在HEK-293T细胞和BL21菌株中均能有效表达，在COS7细胞的胞质、胞核均有分布，为进一步研究人RACK1基因的功能奠定了基础。
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弓形虫蛋白激酶C受体1蛋白的表达与抗原性分析
目的 构建弓形虫蛋白激酶C受体1基因的pET-30a(+)-RACK1重组质粒,表达、纯化RACK1蛋白.方法 PCR扩增RACK1基因的cDNA序列,用SacI、NcoI限制性内切酶对RACK1基因的PCR产物及pET-30a(+)质粒进行双酶切,连接,转化大肠杆菌BL21,构建重组质粒.IPTG诱导表达,亲和层析柱纯化表达产物,SDS-PAGE 和 Western blotting对表达产物进行分析鉴定.结果 PCR扩增出966 bp的RACK1完整基因序列,成功构建RACK1基因的pET-30a(+)-RACK1重组质粒,表达出约36 kDa的RACK1蛋白,蛋白具有抗原性.结论 成功构建弓形虫RACK1基因的pET-30a(+)-RACK1重组质粒,纯化出RACK1蛋白,为进一步进行RACK1蛋白在弓形虫入侵分子机制中的作用研究奠定基础.
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Rac1和Pak1在胰腺癌中的表达及其意义
Ras相关的C3肉毒素底物1(Ras-related C3 botulinum toxinsubstrate 1,Racl)是Rho家族(Ras homologue family,Rho)重要成员之一,p21蛋白活化激酶(p21-activated kinase 1,Pak1)是Rac1的效应物,是早被鉴定的RHO GTP酶下游效应分子.Rac1和Pak1在多种肿瘤中异常高表达,与肿瘤分化程度及淋巴转移呈正相关[1-3],本文对胰腺癌中Rac1及Pak1的表达情况进行了分析.
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RACK1在大肠癌癌变过程中的表达和意义
目的:研究RACK1蛋白在正常大肠黏膜组织、大肠癌癌前病变组织及大肠癌中的表达,初步探讨其在大肠癌发病中的作用.方法:收集92例大肠癌组织、20例大肠腺瘤组织、20例大肠炎性息肉组织和23例正常大肠黏膜组织.采用免疫组织化学方法检测RACK1在正常大肠黏膜组织、大肠癌癌前病变及大肠癌组织中的表达,统计分析RACK1表达水平与大肠癌临床病理特征之间的关系.结果:随着大肠癌癌变的演进,RACK1的表达水平进行性上调(P＜0.05).RACK1的表达水平与大肠癌患者年龄、性别、淋巴结转移及Duke分期无明显关系(P＞0.05),但与大肠癌的分化程度呈正相关(P＜0.05).结论:RACK1在大肠癌癌变过程中进行性上调,其表达上调可能与大肠癌的发病有关.
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RACK1高表达促进人结肠癌细胞的生长和增殖
目的：研究RACK1高表达对人结肠癌细胞增殖能力的影响。方法：采用脂质体转染术分别建立 RACK1表达下调的SW620细胞系、RACK1表达上调的SW480细胞系以及对照细胞系；采用CCK-8细胞增殖测定、软琼脂集落形成实验、EdU掺入实验以及流式细胞术检测RACK1表达改变对 SW620和SW480细胞增殖的影响；采用Western blot分析RACK1表达改变对G1/S期限制点调控蛋白Cyclin D1和p27蛋白表达的影响。结果：下调RACK1的表达抑制SW620细胞的生长、软琼脂集落形成能力，降低EdU标记的S期细胞数目，阻滞细胞周期于G1/S期；而上调RACK1的表达增强 SW480细胞的生长、软琼脂集落形成能力，增加EdU标记的S期细胞数目，促进细胞周期G1/S期进程。结论：RACK1高表达促进人结肠癌细胞的生长和增殖。
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RACK1为核心的口腔鳞状细胞癌差异基因的荧光定量RT-PCR表达验证及相互关系分析
目的：通过对实验组前期口腔鳞癌组织与癌旁正常对照组织基因芯片检测数据和前期蛋白组学实验筛选的52种差异蛋白进行综合分析，筛选出差异基因，通过荧光定量RT-PCR实验去验证这些差异基因在口腔鳞癌组织和癌旁正常对照组织中的表达。方法：（1）在前期实验组经典蛋白组学实验筛选出的52种差异蛋白中，我们综合口腔鳞癌的表达谱芯片检测结果，选择变化趋势相同且差异相对较大的基因。（2）收集广东省口腔医院等手术切除的口腔鳞癌及癌旁正常组织各32份，通过荧光定量RT-PCR进行较大样本的验证并分析这些差异基因的相互作用关系。结果：经过荧光定量RT-PCR验证后，GNB2L1、ARHGDIB、STMN1、LGALS7、EIF5A、TAGLN表达上调，差异具有统计学意义（P＜0．001）；S100A7、S100A8、S100A9、ANXA1、ANXA2、ANXA5、CSTB、CRYAB、SERPINB3表达下调，差异具有统计学意义（P＜0．001）。在STRING构建的作用网络中RACK1蛋白与其他差异基因发生关系多。结论：荧光定量RT-PCR验证差异基因的变化趋势与基因表达谱芯片数据结果具有很好的一致性。 RACK1蛋白是口腔鳞癌的一个关键节点蛋白。
关键词： 口腔鳞状细胞癌 差异蛋白 RACK1 荧光定量RT鄄PCR -
复方丹参片对Aβ25-35所致老年痴呆小鼠的行为学改善作用及对RACK1的影响
目的:研究复方丹参片对侧脑室注射Aβ25-35诱导所致痴呆小鼠模型的学习记忆功能障碍的改善作用及对RACK1表达的影响.方法:150只雄性昆明种小鼠经水迷宫实验筛选后,随机均分成假手术组、模型组、复方丹参片高、低剂量组和石杉碱甲组(n=10),侧脑室注射凝聚态Aβ5-35 10 μl建立老年痴呆模型,Morris水迷宫测定学习记忆能力,HE染色观察海马内神经元病理改变,ELISA法检测脑组织中IL-6,TNF-α及BDNF,RACK1的含量变化.结果:与假手术组相比,模型组小鼠水迷宫逃避潜伏期明显延长,且脑组织中IL-6,TNF-α表达显著增加,BDNF与RACK1的表达下降.而复方丹参片0.405 g/kg(低剂量)至0.810 g/kg(高剂量)均能在一定程度上缩短痴呆小鼠的逃避潜伏期,降低脑组织中炎症因子表达,提高BDNF与RACK1蛋白的含量.其中以高剂量治疗效果更为明显(P＜0.05).结论:复方丹参片可能通过调节Aβ25-35诱导所致的老年痴呆模型小鼠脑组织中炎症因子、BDNF与RACK1的表达,从而改善痴呆小鼠的学习记忆功能障碍.
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RACK1与小鼠空间学习记忆的相关性研究及自噬相关因子测定
目的:研究RAKC1与小鼠空间学习记忆的相关性,同时通过自噬相关因子的检测探索自噬在该相关性中所起作用.方法:通过侧脑室注射Aβ25-35(10μL,1 mg· mL-1)诱导小鼠学习记忆障碍,通过Morris水迷宫评价小鼠的空间学习记忆能力,采用HE染色法观察小鼠海马神经元损伤情况,同时以Realtime RT-PCR及Western blotting法分别测定小鼠海马组织中RACK1的mRNA及蛋白水平并将二者分别与小鼠空间学习记忆能力进行相关性分析.进一步采用Realtime RT-PCR法检测Beclin1的mRNA水平,采用Western blotting法检测BECLIN1及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的蛋白水平,并将两种蛋白水平分别与RACK1蛋白水平进行相关性分析.结果:侧脑室注射Aβ25-35明显导致小鼠空间学习记忆障碍(P=0.021)及海马神经元的广泛损伤(P=0.003),同时小鼠海马RACK1mRNA和蛋白水平也显著降低(P=0.00,P=0.05),且二者分别与小鼠的空间学习记忆能力正相关(P=0.05,P=0.011).进一步研究发现,Aβ25-35导致小鼠海马BECLIN1、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ蛋白水平增高(P=0.00,P=0.01)同时这两种蛋白水平分别与RACK1蛋白水平呈负相关(P=0.021,P=0.005).结论:小鼠RACK1蛋白水平与空间学习记忆过程正相关,可能通过负性调节自噬过程介导.
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慢性吗啡成瘾小鼠海马中RACK1对CREB表达水平的影响
目的:研究shRAKC1对慢性成瘾小鼠脑组织CREB mRNA、蛋白的表达变化.方法:通过条件性位置偏爱(CPP)实验分析shRAKC1对慢性吗啡成瘾小鼠的作用;通过RT-PCR检测RACK1和CREB的mRNA在成瘾小鼠海马中的表达水平,并采用免疫组化观察RACK1和CREB蛋白的表达情况.结果:慢性成瘾组与生盐水组相比,前者海马区RACK1和CREB mRNA表达升高(p＜0.05),且吗啡诱导的CPP效应增强(p＜0.05),而shRAKC1组与空质粒组相比,前者由吗啡诱导的CPP诱导效应减弱(p＜0.05),同时其海马区RACK1和CREB mRNA表达下降(p＜0.05).结论:干扰慢性吗啡成瘾小鼠RACK1表达,可以使CREB表达水平下调,并有抑制吗啡成瘾效应的作用.
