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丙型肝炎病毒非结构蛋白NS4B肝细胞结合蛋白基因的筛选与克隆
目的筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与丙型肝炎病毒(HCV)非结构蛋白4B(NS4B)相互作用蛋白的基因,明确其具体作用机制.方法应用酵母双杂交系统3,将多聚酶链反应(PCR)法扩增的HCV NS4B基因连接入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基和X-α-半乳糖(X-α-gal)上进行双重筛选阳性菌落,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌,接种在氨苄西林-LB平板上,选择生长菌落,提取质粒酶切鉴定,测序并在GenBank中进行生物信息学分析.结果成功克隆出HCV NS4B基因并在酵母细胞中表达,与肝文库配合后选出既能在4缺(SD/-Trp-Leu-Ade-His)培养基又能在铺有X-α-gal的4缺培养基上生长,并变成蓝色的真阳性菌落5个,序列分析显示,筛选到的肝细胞蛋白编码基因参与细胞代谢、生物氧化、生长调节等多种生物学过程.结论成功克隆出HCV NS4B蛋白与肝细胞相互作用蛋白,为进一步研究NS4B蛋白的功能,阐明HCV致病的分子生物学机制提供了新线索.
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人胰腺细胞cDNA 文库中丙型肝炎病毒NS4B 结合蛋白基因的筛选
目的 从人胰腺细胞cDNA 文库中,采用酵母双杂交方法 筛选HCV NS4B 包膜蛋白的相互作用蛋白.方法 人胰腺细胞cDNA 文库先进行扩增,随后纯化及鉴定,然后将鉴定好的人胰腺细胞cDNA 文库质粒转化入酵母菌株Y187.构建pGBKT7-NS4B 作为诱饵质粒,随之转化酵母菌株AH109,用色氨酸缺陷型培养基(SD/-Trp)筛选阳性菌落.配合两种重组酵母菌株AH109 与Y187,用四缺培养基及X-α-gal 筛选蓝色酵母菌落,提取相应质粒,电转化感受态菌DH5α后再提取质粒,测序仪测序,结果 使用PUBMED 进行序列比对.结果 成功构建pGBKT7-HCV NS4B 重组质粒,并从人胰腺cDNA 文库中筛选出7 种与HCV NS4B 蛋白相结合的蛋白基因,包括CDK5RAP3、辅脂肪酶、胰石蛋白、凝乳蛋白、弹性蛋白酶2A、糜蛋白酶和胆盐刺激酯酶.结论 HCV NS4B 蛋白可能通过与所筛选出前述蛋白中参与代谢过程的相关蛋白结合,影响糖、脂类代谢过程.
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反相斑点杂交快速检测结核分枝杆菌rpoB基因突变
目的建立以聚合酶链反应(PCR)为基础的寡核甘酸探针反相斑点杂交方法快速检测对利福平耐药的结核菌相关的rpoB基因突变,并评价其临床应用价值.方法应用PCR-反相斑点杂交方法对利福平耐药的62株结核菌和对其敏感的40株结核菌进行检测,所得结果与传统药敏试验结果以及102株结核菌的直接测序结果进行比较.结果 62株对利福平耐药的菌株中,54株碱基突变被准确鉴定,灵敏度为87.1% (54/62),阳性预测值为100%;40株对利福平敏感的菌株均被准确鉴定,特异性为100%,阴性预测值为83.3% (40/48);准确度为92.2% (94/102).与测序法结果符合率为99%.结论以PCR为基础的反相斑点杂交方法其敏感度和特异性均高,无假阳性结果,因此适用于大批量结核菌对利福平耐药性的初筛.
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反向杂交法检测23种人乳头瘤病毒型别的研究
目的 建立一种同时检测人乳头瘤病毒(HPV)5种低危型和18种高危型的反向杂交方法.方法 将23种HPV型别(低危型:HPV6、11、42、43和44型,高危型:HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、83和MM4型)特异性探针固定于尼龙膜条上,生物素标记的通用引物介导PCR(GP-PCR)扩增HPV DNA,扩增产物与膜条经反向杂交检测HPV型别,并与HC-Ⅱ法及扩增和测序法平行检测136例临床标本,对检测结果进行对比.结果 3种方法HPV阳性检出率分别为41.9%、42.6%和40.4%;反向杂交法与后二者检测结果之间均具有良好一致性(Kappa值分别为0.8644和0.9089);以扩增和测序法为金标准,反向杂交法检测敏感度、特异度和准确性分别为96.36%、95.06%、95.59%.结论 本法能一次性检测23种HPV具体型别,敏感度、特异度高,操作简便,结果易于判读,适合临床应用.
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多重PCR/反向线点杂交检测B族溶血性链球菌耐药相关基因的研究
目的 建立和评价多重PCR-反向线点杂交方法(multiplex PCR/reverse line blot hybridization,mPCR/RLB)检测B族溶血性链球菌(GBS)9个耐药及耐药相关基因[erm(A/TR)、erm(B)、mef(A/E)、tet(M)、tet(O)、aphA-3、aad-6、int-Tn和mreA]的方法.方法 针对GBS的9个耐药及耐药相关基因分别设计9对引物及寡核苷酸探针.多重PCR同时扩增9个目的基因,获得生物素标记的PCR产物后,反向线点杂交同时检测上述9个基因.为明确mPCR/RLB方法的特异性和敏感性,对其中318株菌株的9个基因分别进行单个基因PCR扩增,比较两种检测方法结果.结果 用mPCR/RLB方法成功检测512株GBS分离株的9个耐药相关基因,除8株int-Tn和21株mef单个基因PCR阳性的菌株,RLB结果表现为单探针杂交外,其余菌株所有耐药基因RLB检测结果和单个基因PCR完全一致.结论 我们建立的多重PCR/RLB方法具有良好的敏感性和特异性,为GBS耐药基因的流行病学调查和监控提供了一个良好的检测工具.
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中国人群中少见β地中海贫血家系的分子遗传学特征分析
目的 探讨在中国人群中发现的1个少见β地中海贫血家系的分子遗传学特征.方法 采用标准的血液学分析技术检测先证者及家系成员红细胞参数,包括RBC、Hb、MCV、MCH、MCHC和RDW,进行表型诊断.利用SPIFE快速自动电泳分析系统检测其血红蛋白组分Hb A、Hb A2和Hb F.采用RDB技术检测β地中海贫血基因突变,并进一步进行克隆测序及家系分析,明确突变位点.结果 先证者及其父亲红细胞参数呈典型的小细胞低色素改变,MCV和MCH均降低,MCV分别为79.1 fl及63.1 fl,MCH为19.9 pg及20.9 pg;而先证者母亲的MCV及MCH均正常.先证者及其父亲Hb A2增加,分别为5.66%及5.60%,提示其为轻型β地中海贫血基因携带者.进一步的基因分析表明,先证者在一个β珠蛋白基因同时发生CD41/42(-TTCT)和转录区+40～+43缺失突变,诊断为β41/42、CAP/βA基因型的轻型地中海贫血患儿,其父母基因型分别为β41/42、CAP/βA 和βA/βA.结论 先证者在一个β珠蛋白基因同时发生CD41/42(-TTCT)和转录区+40～+43缺失突变,β41/42、CAP/βA基因型的发现丰富了中国人群β珠蛋白基因突变研究数据,有助于β地中海贫血的起源和演变的研究.
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蛋白质酵母双杂交系统的建立及其在大肠癌肝转移研究中的意义
目的建立酵母双杂交系统,筛选与FasL相互作用的蛋白,探讨FasL与大肠癌肝转移的关系. 方法以FasL基因构建诱饵蛋白质粒,筛选人胎肝cDNA文库,鉴定与FasL相互作用的蛋白,通过生物信息学分析FasL及其相互作用蛋白在大肠癌肝转移中的作用.结果筛选出10个与FasL特异性相互作用的蛋白,包括金属硫蛋白1K、1G、2A,组织蛋白酶B,脂肪酸合成酶,干扰素α诱导蛋白27,磷脂清除酶,丝氨酸/苏氨酸样激酶,锚着黏附蛋白以及纤维微丝蛋白-5等. 结论成功建立了筛选FasL相互作用蛋白的酵母双杂交系统,并初步证明FasL与组织蛋白酶、金属硫蛋白、锚着黏附蛋白等之间的相互作用与大肠癌肝转移密切相关.
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着床窗口期子宫内膜差异表达基因的研究
目的 筛选在着床窗口期子宫内膜差异表达的基因,以了解子宫内膜容受性形成的分子基础.方法 采用抑制性消减杂交技术(SSH),建立人子宫内膜着床窗口期基因表达的消减文库,并通过测序和同源性比较确定差异表达的基因;用RT-PCR技术验证其中的核糖体蛋白(RP)L7基因、RPL7假基因(RPL7p)、RPL19基因、酪氨酸3-单氧化酶/色氨酸5-单氧化酶激活蛋白zeta多肽(YWHAZ)基因在增生期晚期和分泌期中期子宫内膜中的表达.结果 对消减文库中50个差异表达的克隆进行测序与同源性比较,筛选出35个在增生期晚期和分泌期中期有差异表达的基因.其中23个为已知功能的人类基因,12个为未知功能基因.RPL7、RPL7p、RPL19和YWHAZ基因在分泌期中期的表达水平有不同程度的升高,分别为0.75±0.21、1.72±0.30、1.23±0.31、1.28±0.08,分别与增生期晚期(分别为0.45±0.12、1.04±0.10、0.74±0.21、1.09±0.12)比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 应用SSH可有效地筛选出着床窗口期子宫内膜差异表达基因,为今后进一步研究子宫内膜容受性形成的分子机理提供新的线索.
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乙型肝炎病毒感染胎盘组织差异表达基因的筛选与确定
目的 了解乙型肝炎病毒(HBV)感染胎盘组织基因表达的改变,确定与HBV感染胎盘相关的基因,以探讨HBV宫内感染的分子机制.方法 选择2002年1月至2003年12月,在西安交通大学第一医院未临产以剖宫产分娩的30例HBsAg、HBV DNA双阳性(实验组)和30例HBsAg、HBV DNA双阴性(对照组)妇女的胎盘组织,采用抑制消减杂交技术(SSH)建立HBV感染胎盘组织cDNA消减文库,经反向斑点杂交技术证实差异表达基因.RT-PCR验证部分基因在HBV感染胎盘组织中的表达.结果 两组差异表达基因35个,对其中含有插入片段的阳性克隆进行测序分析,获得33个已知基因序列,两个未知基因;并初步判定磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)基因在HBV感染的胎盘组织中表达明显增强.结论 HBV感染胎盘时,基因表达可发生明显变化;PI3K基因表达变化,对了解HBV宫内感染的分子机制有重要意义.
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卵巢上皮性癌相关抗原的筛选和血清学检测
目的 构建卵巢上皮性癌(卵巢癌)腹水肿瘤细胞的cDNA文库,从中筛选能用于卵巢癌早期诊断和免疫治疗靶点的卵巢癌相关抗原.方法用3例卵巢浆液性囊腺癌、1例卵巢黏液性囊腺癌、1例卵巢子宫内膜样癌患者的腹水肿瘤细胞构建cDNA文库,采用改良的重组克隆表达抗原的血清学鉴定(SEREX)技术与抑制性消减杂交(SSH)方法相结合的策略从文库中筛选卵巢癌相关抗原基因,并对其进行酶切鉴定、核苷酸测序分析.采用重组肿瘤抗原的微型血清学检测(SMARTA)法检测筛选出的卵巢癌相关抗原与96例卵巢癌患者和96例正常妇女的血清中相应自身抗体的阳性反应情况.结果 经两轮血清学筛选和核苷酸测序分析,终得到55个候选的卵巢癌相关抗原基因片段,代表45个基因,分为6类:(1)与已知的卵巢癌相关基因同源的基因,如BARD1基因等;(2)与其他肿瘤相关基因同源的基因,如TM4SF1基因等;(3)在一些特殊组织中表达的基因,如ILF3、FXR1基因等;(4)与一些特殊功能蛋白基因同源的基因,如TIZ、C1D基因等;(5)与胚胎来源的基因同源的基因,如PKHD1基因等;(6)其余为在基因库GenBank中无同源序列可比对的未知基因,如OV-189基因等.TM4SF1、C1D、BARD1、FXR1、OV-189基因的噬菌体重组融合抗原与卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率分别为28%、21%、23%、23%、31%,与正常妇女血清反应的阳性率分别为9%、6%、5%、8%、13%,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.01);TIZ、FXR1、OV-189基因的重组抗原与卵巢癌患者血清中相应IgM型自身抗体反应的阳性率分别为26%、28%、18%,与正常妇女血清反应的阳性率分别为8%、11%、7%,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).FXR1、OV-189基因的重组抗原与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率(分别为34%、46%)高于Ⅲ～Ⅳ期者(分别为16%、23%),两者分别比较,差异均有统计学意义(P值分别为0.045、0.021);OV-189基因的重组抗原与高分化卵巢癌患者血清中相应IgG型自身抗体反应的阳性率(为67%)高于中～低分化者(为26%),两者比较,差异均有统计学意义(P=0.001).TIZ、FXR1基因的重组抗原与Ⅰ～Ⅱ期卵巢癌患者血清中相应IgM型自身抗体反应的阳性率(分别为40%、46%)高于Ⅲ～Ⅳ期者(分别为18%、18%),两者分别比较,差异均有统计学意义(P值分别为0.018、0.004).当联合分析TM4SF1、C1D、TIZ、FXR1基因的重组抗原的相应IgG型自身抗体及TIZ、FXR1基因的重组抗原的相应IgM型自身抗体(即自身抗体谱)时,诊断卵巢癌的敏感度为66%,准确度为73%;将该自身抗体谱与CA125联合时,敏感度、准确度均有明显提高,分别为83%、80%.结论 SEREX技术与SSH方法相结合筛选肿瘤抗原基因是一种行之有效的、能筛选出具有较高特异性肿瘤抗原基因的研究策略;TM4SF1、C1D、TIZ、BARD1、FXR1、OV-189基因的重组抗原在血清中的相应自身抗体可作为卵巢癌诊断的标志物,多个抗原的联合检测可提高诊断效率.
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骨髓间充质干细胞移植改善心肌病大鼠心功能相关基因的初步筛选
目的 筛选骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells MSCs)移植改善心肌病大鼠心功能的相关基因,初步分析相关基因在MSCs改善心功能中的作用.方法 用贴壁筛选法分离、扩增大鼠MSCs,并移植入经阿霉素腹腔注射构建的大鼠心肌病模型中.然后利用抑制性消减杂交技术(supression subtractive hybridization,SSH)筛选移植MSCs后大鼠心肌组织差异表达的相关基因,并进行分析.结果 成功建立了心肌病大鼠模型,并进行了MSCs心肌移植,筛选出移植MSCs后心肌细胞表达上调的基因12条、表达下调的基因4条.经基因的序列检索分析显示,MSCs移植入大鼠心肌后与线粒体合成有关的基因和与心肌的收缩蛋白合成有关的基因表达上调;表达下调的基因分别为肌小节的线粒体肌氨酸激酶基因;核糖体的磷蛋白P2基因;α-晶状体蛋白基因;NADH-辅酶Q氧化还原酶Fe-S蛋白7基因.结论 MSCs移植后可能通过刺激与能量合成相关和心肌收缩相关基因的表达,一方面促进心肌能量合成,另一方面MSCs可能分化为新的心肌细胞,增加心肌收缩力,从而改善心肌组织功能.
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酵母双杂交诱饵蛋白Rb融合质粒构建及鉴定
目的为筛选和克隆与口腔鳞癌增殖相关的新基因,构建酵母双杂交系统用诱饵蛋白融合质粒.方法从pGBT9-pRb中酶切、电泳鉴定、回收Rb基因,将其连接至酵母双杂交系统诱饵蛋白质粒载体pGBKT7中,构建重组质粒pGBKT7-pRb,并经鉴定、测序、体外翻译、转录等方法验证后,将重组质粒转化酵母Y187,测定其在Y187中的自激活现象及毒性.然后,提取转化后的酵母总蛋白,经Western blot 检测该重组质粒在Y187内的表达情况,以鉴定其作为诱饵蛋白的可行性.结果 Rb基因经酶切、电泳后,大小正确,割胶回收,与质粒pGBKT7 24 h连接,转化大肠杆菌DH5α,挑选重组质粒,测序结果与Genbank中Rb序列比对完全正确.重组质粒pGBKT7-pRb双酶切鉴定、体外翻译、转录试验,Western blot等方法均证实重组质粒中的Rb基因能够正确合成Rb蛋白.转化酵母后排除重组质粒的自激活作用.结论构建重组质粒pGBKT7-pRb,能够在Y187内正确表达,可作为酵母双杂交系统用诱饵蛋白.
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人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体的构建及其自激活作用鉴定
目的 构建人肠三叶因子酵母双杂交诱饵载体并验证其自激活作用.方法 以pET32a-hITF质粒为模板,PCR扩增hITF成熟肽cDNA片段,Sal I和EcpRV双酶切后连接到pENTR3c载体,通过λ噬菌体臂同源重组反应(LR重组反应)将hITF片段连接到酵母双杂交诱饵载体pDEST32,获得诱饵质粒pDEST32-hITF,测序后与酵母双杂交空质粒pDEST22共转化到酵母菌株Mav203,经营养缺陷培养基筛选后,观察在含不同浓度3-氨基三唑(3AT)的营养缺陷培养基中pDEST32-HITF的自激活作用.结果 成功克隆hITF基因片段,构建酵母双杂交诱饵质粒pDEST32-hITF,其与酵母双杂交空载体pDEST22共转化到酵母菌株Mav203后,可在3AT浓度为0、10、25mmol/L的营养缺陷培养基上生长,而在3AT浓度为50、75、100mmol/L的营养缺陷培养基上不能生长.结论 成功构建酵母双杂交诱饵载体,经验证50mmol/L及以上浓度的3AT营养缺陷培养基可以抑制其自激活作用.
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乙型肝炎病毒e抗原与金属硫蛋白相互作用的研究
乙型肝炎病毒e抗原(HBeAg)被认为与乙型肝炎病毒(HBV)引起免疫耐受,免疫系统功能障碍有关.为探讨HBeAg在乙型肝炎发病机制中的作用,寻找防治HBV感染的有效方法,应用酵母双杂交系统-3构建HBeAg诱饵质粒,转化酵母细胞AH109后,与含肝cDNA文库质粒的酵母Y187进行配合、双杂交,在营养缺陷培养基(SD/-Trp-Leu-His-Ade)上及X-α-半乳糖苷酶(X-a-gal)蓝白斑双重筛选与肝细胞蛋白结合的蛋白,结果获得真阳性菌落39个,提取酵母质粒转化大肠杆菌,测序后进行生物信息学分析,发现其中含金属硫蛋白(MT)基因的菌落有3个.进一步用网织红细胞裂解物体外翻译、蛋白间免疫共沉淀实验证实,金属硫蛋白与HBeAg间有确切的结合作用.推测金属硫蛋白在HBV的致病过程中起着重要作用.
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人端粒相关蛋白T-STAR的克隆及其与端粒酶催化亚单位hTERT的相互作用研究
目的 克隆人端粒相关蛋白T-STAR并研究其与端粒酶催化亚单位hTERT在哺乳细胞内的相互作用.方法 构建表达载体pGBKT7-hTERT,以pGBKT7-hTERT为诱饵,采用酵母双杂交技术进行cDNA文库筛选;构建pVP16-T-STAR和pMhTERT重组载体,脂质体法将其与报告质粒共转染入胃腺癌细胞株SGC-7901,以pM-53+pVP16-T、pM3-VP16为阳性对照,以pM53+pVP16-CP为阴性对照;以pM-hTERT+pVP16、pM+pVP16-T-STAR、pM+pVP16为交叉阴性对照.ELISA法检测报告基因CAT的表达.结果 成功构建真核表达载体pGBKT7-hTERT,将获得的阳性克隆测序,并进行同源性比较证实为是已收录的人cDNA序列T-STAR.pGBKT7-hTERT和pVP16-T-STAR共转染之后,报告基因CAT的表达(A值为0.258)显著高于阴性对照(A值为0.002～0.015).结论 T-STAR与hTERT在胃癌细胞内发生了相互作用,T-STAR可能是人端粒相关蛋白新成员,通过hTERT 参与端粒酶活性的调控.
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肝细胞内与HBeAg结合的新蛋白编码基因E-36的筛选与克隆
目的探讨HBeAg在乙型肝炎病毒(HBV)致病过程中所起的作用.方法利用酵母双杂交系统3筛选并克隆人肝细胞cDNA文库中与HBeAg有相互作用的蛋白的基因.将HBeAg编码基因克隆入酵母表达载体pGBKT7中构建诱饵质粒,转化酵母细胞AH109并在其内表达,然后与转化了人肝cDNA文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,双重筛选阳性菌落,提取质粒并测序.结果通过行生物信息学分析,发现其中有1个未知基因,命名为E-36.结论根据GenBank中的序列信息设计引物,从HepG2细胞中扩增出E-36新基因的完整序列并克隆到另一酵母表达载体pGADT7中,并用体外免疫共沉淀方法再次验证了HBeAg与E-36新蛋白之间有结合作用,为HBeAg的功能研究提供了新线索.
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HBV(ayw)转基因小鼠HBV复制中间体的检测
目的 建立稳定、高灵敏度化学发光Southern blotting检测系统,检测HBV(ayw)转基因小鼠肝脏及其他组织的HBV复制水平.方法 采用地高辛标记HBV探针,利用pTHBV1047质粒检测杂交系统的灵敏度及重复性；提取第27代HBV(ayw)转基因小鼠肝、肾、脾和肌肉组织总DNA,经HindⅢ酶切后电泳、转膜,利用高灵敏度化学发光杂交Southern blotting检测各组织中HBV复制中间体的水平.结果 地高辛标记的化学发光检测系统灵敏度达0.1pg,且杂交系统稳定可靠.HBV(ayw)转基因小鼠基因组DNA中检测到整合的外源HBV DNA,但低于HepG2.2.15细胞的HBV复制水平.肝、肾、脾和肌肉组织中都有HBV复制中间体存在,以肝组织中含量高.结论第27代HBV(ayw)转基因小鼠染色体含有稳定的HBV基因整合,为复制型HBV转基因小鼠.
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应用酵母双杂交技术筛选与乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2结合的肝细胞蛋白编码基因
目的 构建乙型肝炎病毒e抗原结合蛋白2(HBEBP2)的真核表达载体并筛选人肝细胞中与HBEBP2相互作用的基因.方法 通过PCR扩增获得HBEBP2基因,构建真核表达载体pGBKT7-HBEBP2,转化酵母菌AH109并在其中进行表达.随后与预转化了人肝细胞文库质粒pACT2的酵母细胞Y187进行配合,在营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)和铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade)上进行双重筛选获得阳性克隆.提取文库质粒pACT2-DNA并与pGBKT7-HBEBP2共同转化AH109酵母菌株,于铺有X-α-gal的营养缺陷型培养基(SD/-Tm/-Leu/-His/-Ade)上进行筛选以排除假阳性克隆.挑取真阳性克隆送测序,并进行生物信息学分析.结果 筛选出6种与HBEBP2相互作用的蛋白,其中包括人类线粒体蛋白、人类α-2-糖蛋白1、人类磷酸甘露糖-p-长醇利用缺陷1和人类丝氨酸蛋白酶抑制剂等4个已知功能蛋白及2个未知功能序列.结论 筛出人肝细胞中一组与HBEBP2相互作用的蛋白,为进一步探讨HBEBP2在HBV致病过程中的作用奠定了基础.
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丙型肝炎病毒核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用
目的 探讨丙型肝炎病毒(HCV)核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在哺乳动物细胞中的相互作用.方法 分别扩增HCV核心蛋白core及其结合蛋白HCBP6的cDNA片段,克隆人pGEM-T载体.测序正确后应用双杂交技术把目的片段分别插入哺乳动物细胞双杂交系统的表达质粒pBIND和pACT中构建重组载体.将构建的pBIND-core和pACT-HCBP6重组载体和报告质粒pG5luc共转染HepG2细胞,并设背景对照组(pBIND+pACT)、阳性对照组(pBIND-Myod+pACT-Id)、2个阴性对照组(pBIND-core+pACT、pBIND+pACT-HCBP6)和空白对照组.采用Dual-荧光检测系统和Turner Biosystems Veritas微孔板化学发光检测仪检测荧虫素酶活性.结果 成功构建重组载体pBIND-core和pACT-HCBP6,共转染HepG2细胞之后,其荧虫素酶活性与海肾素酶活性的比值与各对照组相比有统计学差异(P≤0.05).结论 HCV核心蛋白core与其结合蛋白HCBP6在肝癌细胞系中确有一定的相互作用,为进一步阐明HCV核心蛋白在细胞凋亡及细胞恶变中的作用机制提供了新的思路.
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丝/苏氨酸蛋白激酶Plk1和转录阻遏子NAC1存在相互作用
目的:研究与丝/苏氨酸蛋白激酶Plk1(polo-like kinase 1)相互作用的分子.方法:通过酵母双杂交技术初步确定可能与Plk1存在相互作用的靶分子,进一步通过蛋白分子的细胞亚定位、体内免疫共沉淀和GST-pulldown分析Plk1与候选蛋白之间的相互作用.结果:细胞亚定位表明,Plk1与转录阻遏子NAC1(transcriptional repressor nucleus accumbens-1, transcriptional repressor NAC1)在空间上存在相互作用的可能,酵母双杂交、体内免疫共沉淀、GST-pulldown分析均表明Plk1和NAC1存在相互作用.结论:Plk1和NAC1存在相互作用,二者的相互作用可能在细胞的发育分化、肿瘤及神经系统疾病的发生发展中起着重要作用.
