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电针对脑心综合征大鼠心肌组织1-磷脂酰肌醇3-激酶、缺氧诱导因子-1α及血管表皮生长因子表达的影响
目的:观察电针对脑心综合征(CCS)大鼠组织1-磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3 K)、缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)及血管表皮生长因子(VEGF)表达的影响,探讨电针对CCS大鼠心肌组织损伤保护的作用机制.方法:从70只SD大鼠中随机选择10只作为假手术组,其余60只用于CCS模型复制,采用胶原酶加肝素联合注射于尾状核复制CCS大鼠模型.选取造模成功的大鼠30只,分为模型组、电针组和非经非穴组,每组10只.采用胶原酶加肝素联合注射于大鼠尾状核的方法造模.造模第1天开始电针,电针组选取“水沟”“风府”“内关”和“心俞”穴,非经非穴组选取臀部非经非穴点4处,每次20 min,每天1次,连续3次.采用免疫组化法分别检测心肌组织PI 3 K、HIF-1α及血管表皮生长因子VEGF表达.结果:与假手术组比较,模型组心肌组织PI 3 K、HIF-1α及VEGF大量表达(P＜0.01)；与模型组比较,非经非穴组心肌组织PI 3 K、HIF-1α及VEGF的变化差异无统计学意义(P＞0.05),而电针组心肌组织PI 3 K、HIF-1α及VEGF大量增加(P＜0.05).结论:电针干预CCS可能通过激活PI 3 K后上调HIF-1α的表达,从而激活VEGF,起到保护CCS受损心肌的作用.
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磷脂酰肌醇3激酶特异性抑制剂LY294002对结核杆菌低分子多肽抗原激活γδT细胞的影响
目的 观察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002对CD3单克隆抗体(CD3mAb)活化的T细胞及结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)激活γδT细胞的影响,探讨PI3K在CD3 mAb活化的T细胞及Mtb-Ag启动的γδT细胞TCR途径信号转导中作用.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用CD3 mAb、佛波醇酯+离子霉素(PMA+IM)、Mtb-Ag刺激PBMC,采用流式细胞术检测CD3+T细胞和γδT细胞0、6、12、24、48 h和72 h的CD69分子的表达情况.PBMC经LY294002(0、0.4、2、10 μmol/L)处理后再刺激培养,用EIA试剂盒检测CD3 mAb和PMA+IM刺激组CD3+T细胞白细胞介素(IL)-2的含量;经CD3 PE和CD69 FITC、γδ PE和CD69 FITC双染后,检测LY294002对CD3 mAb活化T细胞和Mtb-Ag活化的γδT细胞增殖的影响,并计数培养扩增10 d的细胞数量.结果 用CD3mAb刺激24 h CD3+T细胞和γδT细胞CD69的表达均达高峰(均在56％左右),用PMA+IM刺激6h,均达高峰(均在99％左右),用Mtb-Ag刺激24 h,亦均达高峰,但CD3+T细胞和γδT细胞CD69的表达分别为(16.0±0.0)％和(75.2±0.7)％,3组同时间点CD3+T细胞CD69的表达之间差异均有统计学意义(均P＜0.05),而γδT细胞CD69的表达在PMA+IM刺激组高于CD3 mAb刺激组和Mtb-Ag刺激组(均P＜0.05),后两组差异则没有统计学意义(均P＞0.05).用LY294002终浓度分别为0、0.4、2、10 μmol/L处理的样本,CD3 mAb刺激组CD3+T细胞CD69的表达分别为(52.0±0.5)％、(46.3±0.4)％、(33.2±0.4)％和(19.1±0.0)％;Mtb-Ag刺激组γδT细胞CD69的表达分别为(66.2±0.6)％、(58.4±0.5)％、(38.1±0.3)％和(19.3±0.1)％.0、0.4、2、10 μmol/L LY294002处理CD3+T细胞后,CD3 mAb刺激组IL-2的含量分别为(561.1±86.2)、(477.0±75.5)、(280.3±53.9)、(36.0±8.7) ng/L,PMA+IM刺激组为(1 922.2±371.3)、(1 928.3±381.7)、(1 938.1±262.1)、(1 915.4±201.6)ng/L.CD3+T细胞的总数由培养前的1.5×106分别增殖到(35.6±8.4)×106、(31.1±7.3)×106、(18.7±5.0)×106和(7.0±2.0)×106;γδT细胞的总数由培养前的1.5×106分别增殖到(7.0±1.1)×106、(4.7±1.0)×106、(1.3±0.8)×106和(0.2±0.1)×106.结论 Mtb-Ag可特异性的激活γST细胞,其活化信号转导需通过TCR通路,LY294002对CD3 mAb活化的T细胞及Mtb-Ag启动的γδT细胞具有明显的抑制作用.
关键词： 受体 抗原 T细胞 γ-δ 结核杆菌低分子多肽抗原 1-磷脂酰肌醇3-激酶 酶抑制剂 -
AKT/mTOR通路在弥漫性大B细胞淋巴瘤中的活化及其与临床病理相关性的研究
目的 研究AKT/mTOR通路在弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)中的活化及其与bcl-6基因表达等指标的相关性,并探讨其在不同类型DLBCL中的作用.方法 用免疫组织化学方法 检测100例DLBCL及10例淋巴结反应性增生新鲜组织中pAKT、pmTOR的表达;运用TaqMan即时荧光逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)技术检测上述DLBCL中bcl-6 mRNA含量;同时用免疫组织化学方法 观察其中75例相应石蜡组织中bcl-6、CD10和MUM1的表达并据此进行分型.结果 (1)pAKT和pmTOR在DLBCL中的阳性率分别为76.0%(76/100)和75.0%(75/100),二者的表达强度、阳性细胞分布一致.(2)bcl-6蛋白与mRNA表达水平显著相关.pAKT和pmTOR高表达组的bel-6蛋白阳性率与mRNA水平均低于pAKT和pmTOR低表达或不表达者(均P<0.01).(3)非生发中心B细胞样(non-GCB)型DLBCL中pAKT和pmTOR的阳性率分别为82.5%(47/57)和84.2%(48/57),高于GCB型中的阳性比8/18和8/18(均P<0.01).(4)pAKT和pmTOR在男性患者中的表达略高于女性患者,pAKT和pmTOR阳性患者中乳酸脱氢酶(LDH)异常者略高于阴性患者中的比例,但差异均没有统计学意义(P>0.05).pAKT和pmTOR的表达与年龄、临床分期、卡氏体力状况评分(KPS)、B症状之间没有相关性(P>0.05).结论 AKT/mTOR信号转导通路活化在DLBCL发生中起重要作用,特别与bel-6低表达或不表达以及non-GCB亚型密切相关,并有望成为部分DLBCL治疗的新靶点.
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子宫内膜癌中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶通路活化及临床意义
目的 探讨磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶( PI3 K/AKT)信号通路的重要组分PTEN、PIK3CA和p-AKT在子宫内膜癌组织中的改变及其预后意义.方法 免疫组织化学EnVision二步法检测PTEN、p-AKT、雌激素受体(ER)和孕激素受体在71例子宫内膜癌组织中的表达,聚合酶链反应测序法分析其中34例PIK3CA基因外显子9和20的突变情况.结果 (1)71例子宫内膜癌组织中,子宫内膜样癌( EEC) 65例,非子宫内膜样癌(NEEC)6例.PTEN失表达率为63.4％( 45/71),在EEC中的比例(66.2％,43/65)高于NEEC( 2/6；P=0.18).PTEN失表达患者(45例)预后优于PTEN正常表达者(26例；P=0.07).进一步分组分析显示在ER阴性病例中,PTEN失表达者(12例)的预后优于PTEN正常表达者(7例),差异有统计学意义(P=0.04).(2)本组34例中PIK3CA突变率为41.2％ (14/34),突变热点为外显子9的T544.PIK3CA突变在EEC中的发生比例(44.8％,13/29)高于NEEC( 1/5；P ＞0.05).外显子9突变全部见于Ⅰ期EEC病例中,且在高、中分化的EEC中发生率高于低分化肿瘤(P＞0.05).外显子20突变在早期病例组(14.3％,4/28)的发生率显著低于晚期病例组(4/6；P=0.0l).(3)p-AKT的阳性率为59.2％ (42/71),在EEC中的阳性率(60.0％,39/65)高于NEEC(3/6；P=0.68)；但高、中分化组EEC的阳性比例(75.0％,21/28；53.6％,15/28)高于低分化组(3/9),差异有统计学意义(P=0.02).p-AKT阳性与ER阳性相关(r=0.339,P=0.00).结论 PI3K/AKT信号通路的关键分子,如PTEN失表达、p-AKT阳性提示预后好.PIK3CA基因外显子9和20的突变对子宫内膜癌的预后影响可能不同.子宫内膜癌中PTEN和p-AKT的功能可能受到ER状态的影响.
关键词： 子宫内膜肿瘤 1-磷脂酰肌醇3-激酶 蛋白激酶类 突变 预后 -
P2Y嘌呤受体活化的PI-3K信号通路在前列腺癌细胞生长和侵袭中的作用
目的 研究P2Y嘌呤受体激动剂对前列腺癌细胞PI-3K信号通路的激活及对肿瘤细胞生长和侵袭的影响.方法 以高转移的人前列腺癌细胞系1E8为研究对象,以Western blot法,用特异性识别磷酸化Akt的抗体检测PI-3K信号通路的活化情况;以细胞计数、流式细胞术、Matrigel侵袭实验等方法检测P2Y受体激活的PI-3K/Akt信号通路在前列腺癌细胞生长和侵袭中的作用.结果 P2Y嘌呤受体激动剂以时间和剂量依赖的方式激活了1E8细胞中的PI-3K/Akt信号通路.其持续刺激导致的生长抑制作用主要通过将细胞阻滞在S期实现(刺激组S期细胞分数比对照组提高22.3%).应用特异性抑制剂LY294002阻断PI-3K通路明显影响1E8细胞的生长,但不能逆转P2Y受体介导的生长抑制作用.P2Y受体瞬时激活对前列腺癌细胞体外侵袭的促进作用主要通过增强细胞的运动能力(刺激组划痕修复率比对照组提高21.2%),而非提高基质金属蛋白酶(MMP)-2和MMP-9的酶解活性实现,且此促侵袭作用可被LY294002明显抑制.结论 P2Y嘌呤受体可以激活人前列腺癌细胞的PI-3K信号通路,并通过这条通路促进肿瘤细胞的运动能力进而促进侵袭;该通路是前列腺癌细胞生长的重要调节通路,但不参与P2Y嘌呤受体对前列腺癌细胞生长抑制的调节.
关键词： 前列腺肿瘤 1-磷脂酰肌醇3-激酶 受体 嘌呤能 -
wortmannin对高糖视网膜Müller细胞条件培养基诱导的内皮细胞增殖和迁移的影响
目的探讨wortmannin抗眼内新生血管形成的可能.方法采用免疫荧光、流式细胞分析和Boyden小室迁移实验观察高糖视网膜Müller细胞条件培养基(HGMCM)诱导的内皮细胞增殖和迁移的影响.结果 50nmol/L wortmannin可明显抑制HGMCM诱导的内皮细胞的增殖和迁移,使内皮细胞S期细胞百分率明显下降[(37.82±0.57)%至(21.91±0.23)%,P<0.01],G0/G1期细胞百分率显著升高[(54.57±1.19)%至(65.59±0.41)%,P<0.01],G2/M期细胞增多(P<0.05).结论 wortmannin对HGMCM诱导的内皮细胞的增殖和迁移均有抑制作用,提示wortmannin具有抗视网膜新生血管形成的作用.
关键词： 糖尿病视网膜病 细胞 培养的 1-磷脂酰肌醇3-激酶 -
胶质母细胞瘤RTK/PI3K信号通路研究进展
胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）是成人常见且恶性程度高的原发性颅内肿瘤，它弥漫地浸润性侵袭瘤周组织，而且对放化疗治疗不敏感，从而增加了治疗的难度。近年来分子靶向治疗成为研究热点，多项研究表明酪氨酸激酶受体（ receptor tyrosine kinase ， RTK ）/磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K）信号通路是参与GBM发生发展的核心途径之一。因此，本文将综述近年来关于RTK/PI3K信号通路靶向治疗胶质母细胞瘤的研究进展。
关键词： 胶质母细胞瘤 受体蛋白质酪氨酸激酶类 1-磷脂酰肌醇3-激酶 信号通路 -
参附注射液对大鼠心肌缺血再灌注损伤PTEN和PI3K表达的影响
目的 探讨参附注射液(SFI)对大鼠心肌缺血再灌注时第10染色体同源丢失性磷酸酶-张力蛋白酶基因(PTEN)及磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)表达的影响.方法 健康雄性SD大鼠30只,随机分为三组:假手术组(Sham组)、缺血再灌注组(I/R组)和SFI治疗组.Sham组丝线穿过冠状动脉前降支但不结扎;I/R、SFI组通过结扎冠状动脉左前降支30 min,再灌注120 min的方式制备心肌缺血再灌注损伤模型.缺血前30 min,SFI组经腹腔注射参附注射液10 ml/kg,Sham组和I/R组均腹腔注射等量生理盐水.于再灌注120 min时处死大鼠,取左心室心肌组织,计算心肌梗死面积.以缺口末端标记(TUNEL)法检测心肌细胞凋亡情况,计算细胞凋亡指数.免疫组织化学法测定心肌组织PTEN和PI3K表达水平,并计算其比值(PTEN/PI3K).观察心肌组织病理学损伤程度.细胞凋亡指数与PTEN/PI3K行直线相关分析.结果 与Sham组比较,I/R组和SFI组心肌梗死面积增加.细胞凋亡指数升高,PTEN和PI3K表达均上调(P<0.05),SFI组PTEN/PI3K降低(P<0.05);与I/R组比较,SFI组心肌梗死面积减小,细胞凋亡指数降低,PTEN表达下调,PI3K表达上调,PTEN/PI3K降低(P<0.05);SFI组心肌损伤程度较I/R组减轻.I/R组及SFI组细胞凋亡指数与PTEN/PI3K均呈正相关(分别为r=0.788、P=0.007和r=0.829、P=0.003).结论 SFI能够抑制心肌细胞凋亡,减轻大鼠心肌缺血再灌注损伤,其作用机制与下调心肌组织PTEN表达,上调PI3K表达有关.
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雷帕霉素对胶质瘤干细胞的特异性凋亡作用
目的 探索磷脂酰肌醇3 激酶(PI3K)抑制剂雷帕霉素对胶质瘤干细胞的特异性凋亡作用.方法 应用磁式分选系统将胶质瘤细胞分为CD133 +和CD133-细胞.应用MTT 法检测雷帕霉素对两种胶质瘤细胞的生长抑制作用.Annex-in V-FITC 和碘化丙锭(PI)双染检测细胞凋亡.流式细胞仪检测细胞周期.Western blot 检测PI3K 蛋白表达.结果 雷帕霉素以浓度依赖方式抑制胶质瘤细胞的生长,且对CD133 +细胞的生长抑制作用显著强于CD133-细胞.比起CD133-细胞,雷帕霉素对CD133 +细胞具有更强的凋亡作用.结论 雷帕霉素对胶质瘤干细胞具有特异性的抗肿瘤效应,可能与胶质瘤干细胞具有较强的PI3K 活性有关.
关键词： 西罗莫司 神经胶质瘤 1-磷脂酰肌醇3-激酶 细胞凋亡 -
靶向特定细胞PI3K基因shRNA表达载体的构建及鉴定
目的构建靶向血管平滑肌细胞和内皮细胞磷脂酰肌醇3激酶（ phosphatidylinositol 3-kinase， PI3K）基因的短发卡干扰RNA（short hair-pin RNA，shRNA）表达载体，研究其对上述细胞PI3K基因的靶向沉默作用，探索抑制移植血管狭窄的基因防治手段。方法根据Genbank中大鼠PI3K p110β亚单位编码基因Pik3cb序列设计并合成两条shRNA寡核苷酸片段，退火形成双链并克隆导入载体pGenesil-10，经荧光定量PCR方法筛选一条较合适的shRNA转录模板；合成血管平滑肌细胞特异性SMHC增强子/SM22α启动子序列和血管内皮细胞特异性KDR增强子/启动子序列，将该增强子/启动子片段亚克隆至pGenesil-10-Pik3cb-shRNA上，构建并鉴定重组质粒载体SMHCe/SM22αp-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称SM22αe/p shRNA）和KDRe/p-pGenesil-10-Pik3cb-shRNA（简称KDR e/p shRNA）；将重组质粒载体转染血管平滑肌细胞，分别于转染24 h、48 h、72 h后，采用实时荧光定量PCR检测Pik3cb基因mRNA的相对表达量。结果荧光定量PCR检测转染Pik3cb-shRNA-1组与转染Pik3cb-shRNA-2组比较，前者细胞Pik3cb mRNA相对表达量降低更为明显，且两组均较对照组mRNA表达明显减少（ P＜0.05）；酶切鉴定重组质粒载体SM22αe/p shRNA和KDR e/p shRNA构建成功；质粒转染细胞后，Pik3cb基因mRNA相对表达量SM22αe/p质粒组较阴性对照组均有所降低，且转染24 h后，SM22αe/p质粒组与空白对照、CMV质粒组比较Pik3cb基因mRNA相对表达量明显降低，差异均有统计学意义（ P＜0.05）。结论选择Pik3cb-shRNA-1作为转录模板，能够成功构建SM22αe/p shRNA和KDR e/p shRNA质粒载体，且特异性启动子SM22α介导的靶向大鼠Pik3cb基因的shRNA质粒载体可有效沉默靶基因在血管平滑肌细胞中的表达。
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2型糖尿病大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白-4和磷脂酰肌醇-3-激酶与内脂素的关系
目的研究内脂素对糖尿病大鼠骨骼肌葡萄糖转运蛋白-4（ GLUT4）和磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）表达的影响并探讨其机制。方法健康雄性Wistar大鼠随机分为普通饲料组（N组）、高脂饲料组（H组）、普通饲料糖尿病模型组（N＋S组）及高脂饲料糖尿病模型组（H＋S组）。糖尿病模型组大鼠腹腔注射链脲佐菌素造模。造模成功8周后，两组糖尿病大鼠再分别随机分出一组为V＋N＋S组和V＋H＋S组，腹腔注射内脂素重组蛋白。采用实时定量RT-PCR技术检测骨骼肌GLUT4 mRNA表达， Western blot 技术检测GLUT4和PI3K蛋白表达。结果 N＋S组与N组、H＋S组与H组大鼠骨骼肌GLUT4 mRNA，GLUT4和PI3K蛋白表达水平比较明显减低（ P＜0.05）。 V＋N＋S组与N＋S组、V＋H＋S组与H＋S组比较均有所升高（P＜0.05）。结论内脂素可能通过增加PI3K的蛋白表达影响GLUT4的基因表达，导致其蛋白表达增加，从而降低血糖。
关键词： 糖尿病 2型 烟酰胺磷酸核糖基转移酶 葡萄糖转运体4型 1-磷脂酰肌醇3-激酶 -
α-亚麻酸抑制高糖诱导内皮细胞凋亡的作用及机制研究
目的：在体外培养的人脐静脉内皮细胞（ HUVEC）上，观察α-亚麻酸对高糖致凋亡效应的影响，探讨其发挥细胞内保护作用的信号转导机制。方法体外培养HUVEC，分为4组：（1）对照组（低糖处理组，NG组）；（2）高糖处理组（HG组）；（3）高糖＋α-亚麻酸处理组（HG＋ALA组）；（4）高糖＋α-亚麻酸＋3-磷脂酰肌醇激酶（PI3K）阻断剂LY294002处理组（HG＋ALA＋LY组）。各组在培养终点应用TUNEL法检测细胞凋亡指数（ AI）；ELISA法检测培养液中NO及· O2的水平；采用Western Blot 方法检测内皮细胞Akt的磷酸化程度。结果（1）HG组、HG＋ALA组及HG＋ALA＋LY组AI较NG组明显升高；HG＋ALA组AI较HG组明显降低；HG＋ALA＋LY组AI较HG＋ALA组明显升高（P均＜0.01）；（2）HG组、HG＋ALA组及HG＋ALA＋LY组培养液NO水平较NG组明显降低，HG＋ALA组培养液NO水平较HG组明显升高，HG＋ALA＋LY组培养液NO水平较HG＋ALA组明显降低（ P＜0.01）；而各组培养液中· O2的水平则呈相反变化；（3）HG＋ALA组细胞磷酸化的Akt蛋白（pAkt）表达较HG组明显升高（P＜0.05）；HG＋ALA＋LY组细胞pAkt蛋白表达较HG＋ALA组明显降低。结论α-亚麻酸能够抑制高糖诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡，该效应可能通过促进细胞内蛋白激酶B（ Akt）磷酸化激活来实现，并通过调整内皮细胞的NO/· O2生成平衡，抑制细胞凋亡、发挥细胞保护作用。
关键词： α亚麻酸 高血糖症 细胞凋亡 一氧化氮 1-磷脂酰肌醇3-激酶 -
瘦素通过PI3K/Akt通路对大鼠气道平滑肌细胞凋亡的影响
目的 观察瘦素对大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)蛋白激酶-B(Akt)、磷酸化蛋白激酶-B(Pho-Akt)、B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、Bcl-2相关x蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酰蛋白酶-3(caspase-3)的表达及细胞凋亡的影响,探讨瘦素影响ASMC凋亡的可能机制.方法 体外培养大鼠ASMC,按随机数字表法分为空白对照组、瘦素50 μg/L组(Lep50组)、瘦素100 μg/L组(Lep100组)、瘦素200 μg/L组(Lep200组)及瘦素200μg/L±LY294002组[1-磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)抑制剂组].各组均孵育24h后用Annexin-V/PI双标记流式细胞仪分析法检测细胞凋亡率,Western blot测定Akt、Pho-Akt、Bcl-2、Bax和caspase-3的蛋白表达情况.结果 Lep50组、Lep100组、Lep200组的细胞凋亡率分别为(3.97±0.39)％、(1.88 ±0.72)％和(0.77±0.1 1)％,均低于空白对照组的(7.38±0.49)％(F =89.57,P＜0.05),且各组细胞凋亡率与瘦素浓度呈负相关(r=-0.711,P＜0.05)；PI3K抑制剂组凋亡率为(3.29±0.36)％,高于Lep200组(F =89.57,P＜0.01).Western blot结果显示随着瘦素浓度的升高Bcl-2表达增加,且与浓度呈正相关(r=0.939,P＜0.05),Bax和caspase-3表达下降,与瘦素浓度成负相关(r值分别为-0.908和-0.961,均P＜0.05),Bcl-2/Bax比值增加(F=20.56,P ＜0.05),Pho-Akt表达上调,且与瘦素浓度呈正相关(r=0.958,P ＜0.05)；PI3K抑制剂组较Lep200组Pho-Akt、Bcl-2表达下降(F值分别为32.93和19.48,均P＜0.05),Bax和caspase-3表达升高(F值分别为10.10和29.86,均P＜0.05),Bcl-2/Bax比值下降(F =20.56,P＜0.05).结论 瘦素可以抑制ASMC的凋亡,其机制可能与激活P13K/Akt通路有关.
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体外研究胰岛素及磷脂酰肌醇3-激酶途径对一氧化氮生成的影响
目的 探讨胰岛素及磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-K)途径对NO生成的影响.方法 检测胰岛素、葡萄糖以及PI3-K活性不可逆的抑制剂(Wortmannin)对培养的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)PI3-K表达以及NO、超氧阴离子(O2-)产生和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)活性的影响.实验分为对照组、10 mU/L胰岛素组、100 mU/L胰岛素组、甘露醇组、5 mmol/L葡萄糖+10 mU/L胰岛素组(5 mmol/L G1组)、25 mmol/L葡萄糖+100 mU/L胰岛素组(25 mmol/L G2组)、50 nmol/L Wortmannin组(50 nmol/L W组)、50 nmol/L Wortmannin+10 mU/L胰岛素组(50 nmol/L W1组)和50 nmol/L Wortmannin+100 mU/L胰岛素组(50 nmol/L W2组).结果 与对照组比较,不同浓度胰岛素组eNOS活性及NO水平显著升高(P<0.01);25 mmol/L G2组、50 nmol/L W组、50 nmol/LW1组和50 nmol/L W2组eNOS活性及NO水平均显著降低,O2-生成明显增加(P<0.01);与时照组比较,不同浓度胰岛组、50 nmol/L W组、50 nmol/L W1组和50 nmol/L W2组PI3-K蛋白表达显著升高(P<0.05,P<0.01).结论 PI3-K信号途径对于促进NO产生、维持血管内皮细胞的正常功能具有重要作用,在高糖、高胰岛素状态下该条途径受损并由此引发内皮功能障碍.
关键词： 胰岛素 1-磷脂酰肌醇3-激酶 一氧化氮 内皮细胞 一氧化氮合酶 -
磷脂酰肌醇3激酶信号通路在缺血后适应中对大鼠心肌保护机制的研究
目的 研究缺血后适应(IPost)对大鼠心肌保护作用及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K/Akt)信号通路机制.方法 将32只雄性Wistar大鼠随机分为缺血再灌注组(A组),IPost组(B组),IPost+Wortmannin组(C组)和缺血再灌注+SB216763组(D组),每组8只.测定各组左心室收缩压(LVSP)和再灌注30 min冠状动脉流出液中乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量.并测定心肌梗死面积,对心肌进行免疫组织化学染色,观察Akt磷酸化和GSK-3β磷酸化的表达.结果 与B组比较,A组LVSP明显降低,乳酸脱氢酶和肌酸激酶含量明显升高(P＜0.05);同时IPost干预减小了心肌梗死面积(47.3% vs 29.5%),B组Akt磷酸化和GSK-3β磷酸化表达增加.结论 IPost对体外大鼠缺血再灌注损伤有明确的保护作用.Wortmannin可削弱IPost的保护作用,SB216763具有模拟IPost的心肌保护作用,Akt和GSK-3β的磷酸化水平在IPost的心肌保护作用信号通道传导机制中具有重要地位.
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生长停滞特异性基因6对大鼠心肌细胞缺血再灌注的保护机制
目的 初步探讨生长停滞特异性基因6(Gas6)在缺血预适应(IPC)中,对大鼠心肌细胞缺氧/复氧(I/R)损伤的保护作用及机制.方法 选择大鼠胚胎源性H9C2心肌细胞株培养48 h后,随机分为5组:NC组、I/R组、IPC组、Gas6组、Gas6+ LY组为Gas6+磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)阻断剂LY294002培养,各组按分组条件培养后,测乳酸脱氢酶(LDH)活性；流式细胞术测细胞凋亡率；实时荧光定量PCR法测NC组、I/R组和IPC组Gas6 mRNA表达；Western blot法测磷酸化蛋白激酶B(p-Akt),磷酸化叉头蛋白O亚家族(p-Foxo3a)蛋白水平.结果 与NC组比较,I/R组LDH活性和细胞凋亡率明显升高；与I/R组比较,IPC组Gas6 mRNA表达增加,IPC组和Gas6组LDH活性及细胞凋亡率明显减少,p-Akt、p-Foxo3a蛋白明显增加,与Gas6组比较,Gas6+LY组LDH活性和细胞凋亡率明显升高,p-Akt和p-Foxo3a蛋白表达明显下降(P＜0.05).结论 Gas6通过PI3K/Akt/Foxo3a通路在IPC中起心肌细胞保护作用.
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缺血性脑卒中信号转导通路研究进展
短暂或持久的局灶性脑缺血可引起一系列病理生理变化而导致脑损伤,且随时间和缺血程度增加而加重.由此引发的缺血性脑卒中,其发病机制复杂,能量代谢障碍、兴奋性氨基酸毒性作用、炎性反应、半暗带去极化及细胞凋亡等共同参与了其病理生理变化过程.
关键词： 卒中 丝裂原激活蛋白激酶类 1-磷脂酰肌醇3-激酶 信号传导 Toll样受体偏头痛 前庭疾病 眩晕 -
胰岛素抵抗大鼠视黄醇结合蛋白4骨骼肌磷脂酰肌醇3激酶的表达及吡格列酮的干预作用
目的 观察胰岛素抵抗(IR)大鼠体内视黄醇结合蛋白4(RBP4)、骨骼肌磷脂酰肌醇3激酶( P13K)和晚期氧化蛋白产物(AOPP)的水平，以及给予吡格列酮干预后其活性的变化，探讨RBP4与IR的关系及其可能的机制。 方法 将SPF级雄性Wistar大鼠35只随机分为2组，正常对照组（对照组）11只，饲以普通饲料；模型组24只，饲以高糖高脂饲料。模型组造模成功后再随机分为2个亚组,IR组和IR+吡格列酮干预组（干预组）,每组12只；IR组和干预组继续饲以高糖高脂饲料，干预组大鼠同时给予吡格列酮20mg·kg 1·d-1灌胃，持续8周。第16周末处死大鼠取血检测三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白(HDL-C)、低密度脂蛋白(LDL-C)及空腹血糖(FBG)、空腹胰岛素(FINS)，计算胰岛素抵抗指数(HOME-IR)；酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清RBP4水平,RT-PCR测定附睾脂肪组织RBP4表达；免疫组织化学染色检测骨骼肌PI3K水平；紫外分光光度计法测定AOPP水平；并取大鼠腹腔内肠系膜、附睾、腹膜反折处的脂肪组织称质量，计算腹部脂肪含量与体质量的比值。 结果 (1)IR组大鼠体质量16周后明显增加,TG、LDL-C、FINS以及脂体比较对照组均明显升高，而HDL-C则明显降低；吡格列酮干预后，干预组体质量、TG、LDL-C、FINS以及脂体比较IR组有明显下降,HDL-C明显升高；(2)IR组大鼠血清及附睾脂肪组织RBP4水平和血清AOPP水平明显高于对照组，干预组水平明显降低；(3)IR组大鼠骨骼肌组织PI3K表达水平明显低于对照组，吡格列酮干预其表达水平升高；(4)相关分析表明大鼠血清RBP4与FINS、脂体比、LDL-C呈正相关；与HDL-C、骨骼肌组织PI3K水平呈负相关。 结论 (1)IR大鼠RBP4、AOPP水平升高，RBP4是致IR的脂肪细胞因子，并可引起机体脂代谢紊乱及氧化应激增强；(2)RBP4降低大鼠胰岛素敏感性可能与其削弱胰岛素信号转导作用有关；(3)吡格列酮可降低IR大鼠RBP4及血清AOPP水平，增加骨骼肌PI3K表达，从而提高机体对胰岛素的敏感性。
关键词： 胰岛素抗药性 视黄醇结合蛋白质类 血浆 1-磷脂酰肌醇3-激酶 噻唑烷二酮类 -
胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠主动脉内皮依赖性舒张功能及相关活性物质的变化
目的 观察胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能和内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(PKB)的变化,探讨胰岛素抵抗和高血糖状态下内皮功能障碍的发生机制.方法 4～6周龄雄性SD大鼠高糖高脂喂养6周,建立胰岛素抵抗模型(IR组),再从中取20只予小剂量链脲佐菌素(STZ)腹腔注射建立2型糖尿病大鼠模型(DM组),喂养8周后用正常血糖高胰岛素钳夹技术的葡萄糖输注率评价胰岛素抵抗,用大鼠离体主动脉环对乙酰胆碱的血管舒张反应来评价大鼠的内皮依赖性血管舒张功能,Gress重氮化反应法检测主动脉NO含量,免疫组化法检测主动脉eNOS阳性表达,RT-PCR方法检测主动脉PI3K、PKB、eNOSmRNA表达,透射电镜检测大鼠主动脉超微结构变化,并检测空腹血糖、空腹胰岛素、甘油三酯和胆固醇水平,计算胰岛素敏感指数.结果 (1)IR和DM组大鼠体重、空腹胰岛素、甘油三酯和胆固醇均较正常对照组显著高(P＜0.01),胰岛素敏感指数、葡萄糖输注率显著低(P＜0.01).(2)IR和DM组大鼠胸主动脉内皮依赖性血管舒张功能显著低于NC组(P＜0.05),DM组又低于IR组,大鼠主动脉对乙酰胆碱诱导的大舒张反应与空腹血糖、甘油三酯、胆固醇和空腹胰岛素呈显著负相关,与胰岛素敏感指数显著正相关(P均＜0.01).(3)IR、DM组大鼠离体主动脉NO浓度及PI3K、PKB、eNOS mRNA相对光密度较正常对照组显著低(P＜0.01),而DM组上述指标又低于IR组(P＜0.05).免疫组化显示IR、DM组主动脉eNOS阳性表达较正常对照组显著低(P＜0.01).(4)IR和DM组大鼠胸主动脉透射电镜检查均可见内皮细胞和内皮下超微结构的病理改变.结论 胰岛素抵抗和2型糖尿病大鼠存在内皮依赖性血管舒张功能下降和主动脉超微结构的病理改变,同时主动脉NO浓度、eNOS免疫组化阳性表达、PI3K、PKB、eNOSmRNA表达也下降,提示PI-3K、PKB、eNOS表达下降致NO产生减少可能是胰岛素抵抗和高血糖内皮功能障碍的机制之一.
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靶向Pik3cb RNA干扰对大鼠血管平滑肌细胞增殖的影响
目的 探讨靶向磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)p110 β亚单位的短发卡RNA质粒(pU6-Pik3cb-shRNA)对大鼠胸主动脉平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响.方法 构建质粒表达载体pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2,经脂质体介导转染大鼠VSMC,分7组:A组:VSMC细胞;B组:转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1;C组:转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-2;D组:转染质粒pU6-Pik3cb-shRNA-1和pU6-Pik3cb-shRNA-2各半量;E组:转染阴性对照无序质粒HK;F组:转染阴性对照空质粒;G组:阳性对照渥曼青霉素,应用荧光定量PCR检测VSMC中Pik3cb mRNA的表达,Western blot检测VSMC中PI3K下游蛋白Akt和mTOR表达的变化;CCK-8法检测pU6-Pik3cb-shRNA对大鼠VSMC增殖的影响;免疫荧光法检测各组细胞中PCNA的表达.结果 48 h时B组、C组、D组中Pik3cb mRNA表达分别降低了75.5%、53.6%和65.8%,与对照组相比较,差异有统计学意义(P＜0.05).B组、C组、D组中PI3K下游分子磷酸化Akt和mTOR表达均下调,CCK-8结果显示pU6-Pik3cb-shRNA抑制VSMC的生长,免疫荧光结果显示B组、C组、D组中PCNA的表达明显下调.结论 pU6-Pik3cb-shRNA能够有效下调Pik3cb mRNA和PI3K下游效应分子磷酸化Akt和mTOR的表达,抑制VSMC增殖.
