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磷脂酰肌醇3激酶特异性抑制剂LY294002对结核杆菌低分子多肽抗原激活γδT细胞的影响
目的 观察磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)特异性抑制剂LY294002对CD3单克隆抗体(CD3mAb)活化的T细胞及结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)激活γδT细胞的影响,探讨PI3K在CD3 mAb活化的T细胞及Mtb-Ag启动的γδT细胞TCR途径信号转导中作用.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用CD3 mAb、佛波醇酯+离子霉素(PMA+IM)、Mtb-Ag刺激PBMC,采用流式细胞术检测CD3+T细胞和γδT细胞0、6、12、24、48 h和72 h的CD69分子的表达情况.PBMC经LY294002(0、0.4、2、10 μmol/L)处理后再刺激培养,用EIA试剂盒检测CD3 mAb和PMA+IM刺激组CD3+T细胞白细胞介素(IL)-2的含量;经CD3 PE和CD69 FITC、γδ PE和CD69 FITC双染后,检测LY294002对CD3 mAb活化T细胞和Mtb-Ag活化的γδT细胞增殖的影响,并计数培养扩增10 d的细胞数量.结果 用CD3mAb刺激24 h CD3+T细胞和γδT细胞CD69的表达均达高峰(均在56％左右),用PMA+IM刺激6h,均达高峰(均在99％左右),用Mtb-Ag刺激24 h,亦均达高峰,但CD3+T细胞和γδT细胞CD69的表达分别为(16.0±0.0)％和(75.2±0.7)％,3组同时间点CD3+T细胞CD69的表达之间差异均有统计学意义(均P＜0.05),而γδT细胞CD69的表达在PMA+IM刺激组高于CD3 mAb刺激组和Mtb-Ag刺激组(均P＜0.05),后两组差异则没有统计学意义(均P＞0.05).用LY294002终浓度分别为0、0.4、2、10 μmol/L处理的样本,CD3 mAb刺激组CD3+T细胞CD69的表达分别为(52.0±0.5)％、(46.3±0.4)％、(33.2±0.4)％和(19.1±0.0)％;Mtb-Ag刺激组γδT细胞CD69的表达分别为(66.2±0.6)％、(58.4±0.5)％、(38.1±0.3)％和(19.3±0.1)％.0、0.4、2、10 μmol/L LY294002处理CD3+T细胞后,CD3 mAb刺激组IL-2的含量分别为(561.1±86.2)、(477.0±75.5)、(280.3±53.9)、(36.0±8.7) ng/L,PMA+IM刺激组为(1 922.2±371.3)、(1 928.3±381.7)、(1 938.1±262.1)、(1 915.4±201.6)ng/L.CD3+T细胞的总数由培养前的1.5×106分别增殖到(35.6±8.4)×106、(31.1±7.3)×106、(18.7±5.0)×106和(7.0±2.0)×106;γδT细胞的总数由培养前的1.5×106分别增殖到(7.0±1.1)×106、(4.7±1.0)×106、(1.3±0.8)×106和(0.2±0.1)×106.结论 Mtb-Ag可特异性的激活γST细胞,其活化信号转导需通过TCR通路,LY294002对CD3 mAb活化的T细胞及Mtb-Ag启动的γδT细胞具有明显的抑制作用.
关键词： 受体 抗原 T细胞 γ-δ 结核杆菌低分子多肽抗原 1-磷脂酰肌醇3-激酶 酶抑制剂 -
γδT细胞的扩增及其信号转导分子ζ链相关蛋白-70的免疫印迹检测
目的 检测人外周血γδT细胞的信号转导分子ζ链相关蛋白-70 (ZAP-70)的表达.方法 应用淋巴细胞分离液常规分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)刺激PBMC增殖培养,10d后收集细胞,用免疫磁珠阳性分选法分离获取高纯度的γδT细胞；采用免疫印迹方法检测γδT细胞内的ZAP-70分子.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为4.9％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为69.2％,免疫磁珠阳性分选后达99.3％.免疫印迹显示检测到γδT细胞内相对分子质量为70 000的ZAP-70分子的表达.结论 ZAP-70分子在活化增殖的人外周血γδT细胞内高表达.
关键词： γδT细胞 ZAP-70蛋白酪氨酸激酶 结核杆菌低分子多肽抗原 印迹法 蛋白质 -
流式细胞术检测γδΤ细胞内白细胞介素-2的临床应用价值
目的：建立一种人外周血γδΤ细胞细胞内白细胞介素?2（ IL?2）的检测方法。方法分离获取健康人外周血单个核细胞（ PBMC），用结核杆菌低分子多肽抗原（ Mtb?Ag）刺激PBMC，获取较高比例的γδΤ细胞。用佛波醇酯＋离子霉素（ PMA＋IM）刺激PBMC和γδΤ细胞，用蛋白转运抑制剂（ Brefeldin A，BFA）阻断细胞内因子的分泌，用皂角素破膜，流式细胞术检测CD3＋T细胞内CD69阳性率，以确定佳的破膜时间，用流式细胞术检测γδΤ细胞内的IL?2的表达。不同组间CD3＋T细胞内CD69阳性率及细胞内IL?2的阳性率比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用小显著性（ LSD）法检验．。结果刺激时间不同，CD3＋T细胞胞内CD69的阳性率表达不同，皂角素破膜时间为15 min时，CD3＋T细胞胞内 CD69的阳性率高，达（87．82±2．28）％，与处理5 min[CD69的阳性率（66．86±1．99）％]和25 min[CD69的阳性率（81．73±2．51）％]比较，差异有统计学意义（ F ＝112．81， P＜0．05）；不同处理组γδΤ细胞内IL?2表达不同，γδΤ细胞受PMA和IM刺激并有BFA存在时表达高，达（50．65±6．25）％，与γδΤ细胞组（0．55±0．07）％、γδΤ细胞＋PMA＋IM组（0．91±0．12）％和PBMC＋PMA＋IM＋BFA组（0．21±0．03）％比较，差异有统计学意义（ F ＝321．07， P＜0．05）。结论流式细胞术是一种检测γδΤ细胞内IL?2的较好方法，为γδΤ细胞内其他分子的检测分析奠定了方法学基础。
关键词： γδΤ细胞 白细胞介素2 佛波醇酯类 离子霉素 结核杆菌低分子多肽抗原 -
Mtb-Ag活化γδT细胞的扩增及对γδT细胞CD69分子表达的影响
目的 用结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)激活和扩增γδT细胞,观察γδT细胞表面CD69分子表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用Mtb-Ag刺激PBMC,所得细胞用磁珠阳性分选,通过荧光单抗TCR γδPE染色及流式细胞仪检测γδT细胞所占比例.用γδPE/CD69FITC细胞双染检测初次刺激和再次刺激γδT细胞CD69分子的表达情况.结果 新鲜分离的PBMC中γδT细胞的比例仅为(4.9±1.85)％,Mtb-Ag刺激培养10d后升为(69.2±6.57)％,免疫磁珠阳性分选后达(99.3±8.92)％.Mtb-Ag初次刺激γδT细胞,CD69分子的表达24 h达高峰,为75.2％;Mtb-Ag再次刺激γδT细胞,CD69分子的表达6h达高峰,为72％.结论 Mtb-Ag能特异地刺激PBMC中的γδT细胞增殖,Mtb-Ag初次和再次刺激均可特异性活化γδT细胞.
关键词： γδT细胞 结核杆菌低分子多肽抗原 CD69分子 -
神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原诱导的γδT细胞活化及凋亡作用
目的:研究神经酰胺对结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb)诱导的γδT细胞活化及凋亡作用.方法:用结核杆菌低分子多肽抗原刺激正常人PBMC,并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδT细胞.通过MTT试验观察神经酰胺、鞘磷脂酶以及神经酰胺合成酶抑制剂Fumonisin B1对γδT细胞的活化作用;FACS检测其对γδT细胞的凋亡作用.结果:Mtb刺激获得的γδT细胞可达73%,磁珠分选后可高达98%;高浓度神经酰胺及鞘磷脂酶能抑制γδT细胞的增殖,而出现凋亡,Fumonisin B1则对γδT细胞的增殖及凋亡无明显影响.结论:鞘磷脂水解产生的神经酰胺对γδT细胞有致凋亡作用.
关键词： γδT细胞 结核杆菌低分子多肽抗原 神经酰胺 磁珠阳性分选 -
结核杆菌低分子多肽抗原再次刺激其活化的T细胞对诱导γδT细胞CD69分子再次表达的影响
目的 观察结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)再刺激Mtb-Ag活化的T细胞(Mtb-AT细胞)诱导γδT细胞CD69分子的再表达的情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用Mtb-Ag刺激PBMC,采用直接免疫荧光染色法通过CD3PE/CD69FITC、γδPE/CD69FITC细胞双染检测γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的表达情况.PBMC经Mtb-Ag刺激活化扩增培养至10 d后再次加入Mtb-Ag,经培养0、6、12、24、48和72 h后收集细胞,再次检测CD69分子的表达情况.结果 培养0、6、12、24、48和72 h后,Mtb-Ag初次刺激γδT细胞后CD69分子的表达分别为0.91％、15.1％、35.2％、75.2％、59.4％和50％.再次刺激培养0、6、12、24、48和72 h后,γδT细胞CD69分子的表达分别为1.7％、72.3％、73.5％、50.3％、45.6％、41.7％.结论Mtb-Ag初次刺激γδT细胞表达CD69分子约在24 h达高峰,随后快速下降;Mtb-Ag再次刺激Mtb-AT细胞诱导γδT细胞CD69分子的再表达,6h时CD69分子达高峰,可维持到12 h.这为寻求γδT细胞迅速活化、CD69分子的迅速表达奠定了方法学基础.
关键词： γδT细胞 结核杆菌低分子多肽抗原 CD69分子 再刺激 -
三种方式活化T细胞CD69分子表达观察
目的 观察CD3单克隆抗体(CD3mAb)、佛波醇酯+离子霉素(PMA+IM)、结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)活化CD3+T细胞CD69分子的表达情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用CD3mAb(A组)、PMA+ IM(B组)、Mtb-Ag(C组)刺激PBMC,采用流式细胞术检测CD3+T细胞和γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的动态表达情况.结果 CD3+T细胞CD69分子的动态表达情况:CD3 mAb刺激组24 h达高峰,为56.2％;PMA +IM刺激组6h达高峰,为99.5％;Mtb-Ag刺激组24h达高峰,为16％.各组比较F=322.528,P＜0.001;两两比较,均P＜0.001.γδT细胞CD69分子的动态表达情况:CD3mAb刺激组24h达高峰,为55.1％;PMA+ IM刺激组6h达高峰,为99.3％;Mtb-Ag刺激组24h达高峰,为75.2％.各组比较F=21.170,P＜0.001;两两比较:CD3mAb与PMA+ IM组比较,PMA+ IM组与Mtb-Ag组比较,均P＜0.001;Mtb-Ag与CD3mAb比较P=0.646.结论 PMA+ IM的刺激,CD3+T细胞和γδT细胞活化达高峰的用时比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要短,CD69的表达率也比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要高,应作为三种方法中CD3+T细胞活化的首选方法.
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结核杆菌低分子多肽抗原诱导活化的γδ+T细胞的细胞毒活性研究
目的探讨选择性扩增人γδ+T细胞的方法及其细胞毒活性.方法用耐热性结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb)刺激正常人PBMC,并用磁珠阳性分选法获得高纯度的γδ+T细胞,通过MTT试验观察γδ+T细胞对人红白细胞白血病细胞株K562的细胞毒活性.结果 Mtb刺激及磁珠分选后的γδ+T细胞可达73%和98%,效靶细胞比例为10:1时其对K562细胞的杀伤率分别为59%和78.5%.结论 Mtb刺激及磁珠分选所获得的高纯度γδ+T细胞可介导对K562细胞的高效细胞毒活性.
关键词： γδ+T细胞 结核杆菌低分子多肽抗原 磁珠阳性分选法 细胞毒活性
