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流式细胞术检测γδΤ细胞内白细胞介素-2的临床应用价值
目的：建立一种人外周血γδΤ细胞细胞内白细胞介素?2（ IL?2）的检测方法。方法分离获取健康人外周血单个核细胞（ PBMC），用结核杆菌低分子多肽抗原（ Mtb?Ag）刺激PBMC，获取较高比例的γδΤ细胞。用佛波醇酯＋离子霉素（ PMA＋IM）刺激PBMC和γδΤ细胞，用蛋白转运抑制剂（ Brefeldin A，BFA）阻断细胞内因子的分泌，用皂角素破膜，流式细胞术检测CD3＋T细胞内CD69阳性率，以确定佳的破膜时间，用流式细胞术检测γδΤ细胞内的IL?2的表达。不同组间CD3＋T细胞内CD69阳性率及细胞内IL?2的阳性率比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用小显著性（ LSD）法检验．。结果刺激时间不同，CD3＋T细胞胞内CD69的阳性率表达不同，皂角素破膜时间为15 min时，CD3＋T细胞胞内 CD69的阳性率高，达（87．82±2．28）％，与处理5 min[CD69的阳性率（66．86±1．99）％]和25 min[CD69的阳性率（81．73±2．51）％]比较，差异有统计学意义（ F ＝112．81， P＜0．05）；不同处理组γδΤ细胞内IL?2表达不同，γδΤ细胞受PMA和IM刺激并有BFA存在时表达高，达（50．65±6．25）％，与γδΤ细胞组（0．55±0．07）％、γδΤ细胞＋PMA＋IM组（0．91±0．12）％和PBMC＋PMA＋IM＋BFA组（0．21±0．03）％比较，差异有统计学意义（ F ＝321．07， P＜0．05）。结论流式细胞术是一种检测γδΤ细胞内IL?2的较好方法，为γδΤ细胞内其他分子的检测分析奠定了方法学基础。
关键词： γδΤ细胞 白细胞介素2 佛波醇酯类 离子霉素 结核杆菌低分子多肽抗原 -
两种人工激活剂对卵胞浆内单精子注射后未受精卵母细胞激活效果的比较
目的 观察两种不同的人工激活剂对行卵胞浆内单精子注射(ICSI)后未受精卵母细胞的激活作用及效果.方法 收集ICSI后24 h未受精的人类成熟卵母细胞,分别采用乙醇和离子霉素进行激活处理.16～18 h后观察第二极体排出及原核形成情况.激活后正常受精的胚胎继续培养3～5d.统计两组的激活率、原核形成情况、卵裂率及后期胚胎发育情况.结果 乙醇处理组的激活率为65.6%(21/32),离子霉素处理组的激活率为83.7%(36/43),离子霉素处理组的激活率显著高于乙醇处理组(P<0.05);乙醇激活处理后共有10个卵母细胞表现为2PN+2PB,占被激活卵母细胞的47.6%(10/21),离子霉素激活处理后有24个卵母细胞表现为2PN+2PB,占被激活卵母细胞的66.7%(24/36),两组差异无统计学意义(P>0.05);乙醇激活组卵母细胞有4个发育到2～4细胞,2个发育到5～8细胞,1个发育到8细胞以上阶段,获1枚桑葚胚;离子霉素激活组卵母细胞有9个发育到2～4细胞,5个发育到5～8细胞,3个发育到8细胞以上阶段,终获得2枚囊胚和1枚桑葚胚.结论 两种激活剂均能激活ICSI后24 h未受精的人类成熟卵母细胞恢复受精,并继续发育成胚胎;离子霉素比乙醇更适宜对ICSI后未受精卵母细胞的激活.
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PMA+Ion和PHA用于流式细胞术检测Th1/Th2细胞的结果比较
流式细胞术检测Th1/Th2细胞是近几年发展的基于细胞内细胞因子染色的新技术,可在单细胞水平区分Th1/Th2[1].采用细胞活化刺激剂诱导细胞活化,进一步刺激细胞分泌细胞因子,从而达到放大但仍能反应原有细胞因子分泌格局的目的.常用的活化刺激剂为植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)和佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)加离子霉素(ionomycin,Ion).本实验采用四色标记流式细胞术比较了上述两种刺激剂对全血检测细胞表面分子及胞内细胞因子的影响,以期为该方法的进一步优化及检测结果的分析提供可靠的依据.
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三种方式活化T细胞CD69分子表达观察
目的 观察CD3单克隆抗体(CD3mAb)、佛波醇酯+离子霉素(PMA+IM)、结核杆菌低分子多肽抗原(Mtb-Ag)活化CD3+T细胞CD69分子的表达情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用CD3mAb(A组)、PMA+ IM(B组)、Mtb-Ag(C组)刺激PBMC,采用流式细胞术检测CD3+T细胞和γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的动态表达情况.结果 CD3+T细胞CD69分子的动态表达情况:CD3 mAb刺激组24 h达高峰,为56.2％;PMA +IM刺激组6h达高峰,为99.5％;Mtb-Ag刺激组24h达高峰,为16％.各组比较F=322.528,P＜0.001;两两比较,均P＜0.001.γδT细胞CD69分子的动态表达情况:CD3mAb刺激组24h达高峰,为55.1％;PMA+ IM刺激组6h达高峰,为99.3％;Mtb-Ag刺激组24h达高峰,为75.2％.各组比较F=21.170,P＜0.001;两两比较:CD3mAb与PMA+ IM组比较,PMA+ IM组与Mtb-Ag组比较,均P＜0.001;Mtb-Ag与CD3mAb比较P=0.646.结论 PMA+ IM的刺激,CD3+T细胞和γδT细胞活化达高峰的用时比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要短,CD69的表达率也比CD3mAb、Mtb-Ag的刺激要高,应作为三种方法中CD3+T细胞活化的首选方法.
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CD69分子在人外周血佛波醇酯+离子霉素活化的γδT细胞表面表达的实验研究
目的 观察CD69分子在人外周血佛波醇酯(PMA)+离子霉素(IM)活化的γδT细胞表面的表达情况.方法 分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMC),用PMA+ IM刺激,采用流式细胞术检测CD3+细胞和γδT细胞0、6、12、24、48和72 h CD69分子的动态表达情况.结果 PMA+ IM刺激PBMC 0、6、12、24、48和72 h,CD3+细胞CD69分子的表达分别为1.0％、99.5％、99.1％、98.0％、93.3％、92.1％;γδT细胞CD69分子的表达分别为0.91％、99.3％、98.6％、93.6％、88.7％、87.0％.结论 PMA+ IM的刺激后CD3+细胞和γδT细胞迅速活化,CD69的表达几乎为100％,6h达高峰,随后缓慢下降,两种细胞活化表达CD69基本一致.
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离子霉素对Jurkat T细胞增殖的抑制作用
目的:探讨离子霉素对Jurkat T细胞增殖的抑制作用.方法:以JurkatT细胞为模型,与5种细胞增殖抑制剂比较,观察离子霉素对JurkatT细胞集落形成的影响,分析不同浓度离子霉素对Jurkat T细胞增殖的影响;分析离子霉素对Jurkat T细胞周期的影响;分析离子霉素对Jurkat T细胞凋亡的作用.本实验结果用统计软件包SPSS10.0进行处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间比较采用One-Way ANOVA,两组间比较用非配对Student'st检验.结果:随着离子霉素浓度从0.1 mg/L逐渐增至4.0mg/L,Jurkat T细胞的增殖逐渐减弱,以4.0 mg/L离子霉素的抑制作用为明显,呈剂量依赖关系,且该浓度下,离子霉素对JurkatT细胞增殖的抑制作用较PD98059、AG490、GF109203X和Genistein明显.离子霉素可使JurkatT细胞周期停滞于G0/G1期,阻止其进入S期并可促进Jurkat T细胞的凋亡.结论:离子霉素对Jurkat T细胞增殖有明显的抑制作用,可使Jurkat T细胞周期停滞于G0/G1期,阻止其进入S期,且对Jurkat T细胞凋亡有显著促进作用.
关键词： 离子霉素 Jurkat T细胞 增殖 周期 凋亡 -
PHA与PMA对外周血单个核细胞产生IL-4、IFN-γ水平的研究
目的:比较PHA(植物血凝素)与PMA(佛波醇乙酯)对PBMCs(外周血单个核细胞)的刺激效果.方法:选择健康人群, 取外周静脉血,分离得到PBMCs,分别加入PHA+ionomycin(离子霉素)及PMA+ionomycin进行刺激并孵育2h、4h、6h、12h、24h、48h,采用双抗体夹心ABC-ELISA法 ,分别测定不同时相培养上清中IL-4和IFN-γ水平.结果:刺激2h后, PHA组与PMA组IFN-γ和IL-4水平无差别;刺激4h后,PMA组IFN-γ和IL-4水平均高于PHA 组(P＜0.01);刺激6h后,PHA组IFN-γ水平低于PMA组(P＜0.05),IL-4水平高于PMA组(P＜0.05);刺激12h后,PH A组IFN-γ与PMA组接近,两组IL-4水平亦无差别;刺激24h和48h后,PHA组IFN-γ和IL-4水平均高于PMA组(P＜0.05).结论:PHA和PMA对PBMCs不同时间的刺激效果不同.
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佛波脂和离子霉素对大鼠CD3/CD4/CD8分子表达的影响
目的 观察不同浓度的佛波酯(Phorbol myfismte acetate,PMA)和离子霉素(ionomycin,Ion)作为淋巴细胞激活剂对大鼠淋巴细胞表面分子表达的影响.方法 用不同浓度的PMA和Ion刺激大鼠淋巴细胞后,使用流式细胞仪检测其CD3/CD4/CD8表达的变化.结果 单独使用高工作液浓度的Ion(15、20μg/ml)对大鼠淋巴细胞表面CD4有显著下调作用,而中低浓度(2、5、10μg/m1)则影响不明显.单独使用低、中、高三种浓度(25、50、75ng/ml)PMA刺激,发现CD3/CD4/CD8无明显改变,分别以(2、5、10μg/ml)二种浓度的Ion联合高浓度PMA刺激后发现CD3/CD4/CD8也无明显改变.结论 在低于10μg/m1的Ion和低于75ng/ml的PMA浓度条件共同刺激下不会引起表面标记物,特别是CD4分子表达的改变,故有助于进行淋巴细胞刺激相关试验时选择合适的淋巴细胞刺激物浓度.
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离子霉素对SW480和SWO-38细胞中E-cadherin裂解的影响
目的:观察可促进钙离子内流的工具药离子霉素(ionomycin),对不同肿瘤细胞株SW480及SWO-38其C末端片段2(E-cad/CTF2)的表达裂解的影响.方法:应用MTT法确定ionomycin作用于SW480及SW0-38细胞的佳浓度；Western blotting检测ionomycin作用不同时间后E-cadherin全长及其C末端片段2(E-cad/CTF2)的表达水平；共聚焦显微镜动态检测SWO-38细胞胞内Ca2+浓度变化.结果:Ionomycin对SW480及SWO-38细胞均有细胞毒性作用,半数抑制浓度均为12 μmol/L,ionomycin可促进SW480细胞中Ca2+浓度增加,E-cadherin裂解,E-Cad/CTF2片段水平升高,ionomycin没有引起SWO-38细胞中的大量钙内流,对E-cadherin裂解没有明显作用.结论:Ionomycin可促进钙离子内流,引起SW480肿瘤细胞E-cadherin裂解,但对SWO-38细胞E-cadherin裂解无明显影响.
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分泌干扰素-γ的效应T细胞在预警肾移植术后急性排斥反应中的意义
目的 探讨肾移植术后早期外周血中分泌干扰素(IFN)-γ的效应T细胞数量变化在预警急性排斥反应(AR)中的意义.方法 本前瞻性对照非连续性研究对象选取2011年1月1日至2012年12月31日在西安交通大学医学院第一附属医院肾移植科收治的200例同种异体肾移植患者.根据移植后临床表现、实验室检查及肾穿刺病理学检查结果分为两组:AR组(24例)和移植肾功能正常(stable allograft function,STA)组(176例).其中AR组根据病理严重程度再分为Ⅰ级(9例)、ⅡA级(7例)、ⅡB级(4例)、Ⅲ级(4例)4种等级.另外随机选择行活体亲属肾移植供者为健康对照(healthy control,HC)组(10例).3组分别于术前1 d,术后1、3、5、7、14、21、28、60、90 d留取外周血;另外AR组于临床拟诊AR当日开始留取外周血,即0、1、3、5、7、14、21、28 d.通过体外刺激因子佛波酯(phorbol myfismte acetate,PMA)和离子霉素(ionomycin,Ion)刺激外周血淋巴细胞释放IFN-γ,采用酶联免疫斑点试验(enzyme linked-immunospot assay,ELISPOT)方法,动态监测外周血分泌IFN-γ的效应T细胞数量(IFN-γ ELISPOT值).比较3组研究对象外周血中IFN-γ ELISPOT值的动态变化;采用受试者工作特征(ROC)曲线分析IFN-γ ELISPOT值对AR的诊断效果;比较AR组患者冲击治疗前后IFN-γ ELISPOT值的动态变化;比较AR组中不同病理分级患者的IFN-γ ELISPOT值的动态变化,以分析IFN-γ ELISPOT值与AR病理分级的关系.结果 术后1、2、4 d,AR组和STA组的IFN-γ ELISPOT值明显高于HC组(均为P<0.05),肾移植术后1、2、4、7、14、21 d,AR组的IFN-γ ELISPOT值均明显高于STA组(均为P<0.05).IFN-γ ELISPOT值诊断AR的ROC曲线下面积(area under the curve,AUC)为0.92,佳临界值为23 spots/ 5×105 PBLs,其评价AR的灵敏度为0.920,特异度为0.875.在诊断前3 d、前1 d及穿刺当日,4组患者之间IFN-γ ELISPOT值的差异有统计学意义(均为P<0.05).在AR发生前7 d内,IFN-γ ELISPOT值上升速度越快,上升峰值越高,提示AR病理损害越严重(P<0.05).结论 肾移植术后早期动态监测IFN-γ ELISPOT值对早期诊断AR有重要意义.
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流式细胞术检测大鼠Th1/Th2细胞的刺激方案研究
目的 探讨流式细胞术检测大鼠Th1/Th2细胞时使用刺激剂的佳方案.方法用不同浓度佛波酯(PMA)联合不同浓度离子霉素(Ion)作为激活剂,刺激大鼠外周血T淋巴细胞,采用流式细胞仪三色法方案,观察和分析在不同浓度组合的激活剂刺激下检测T淋巴细胞内干扰素-γ(INF-γ)、白介素-4(IL-4)的分泌效果.结果PMA浓度为25 ng/mL时,联合浓度分别为0、2、5、10、15、20 μg/mL的Ion刺激大鼠淋巴细胞,胞内IFN-γ/IL-4的表达阳性率分别为(1.19±0.26)%/(2.46±0.32)%、(1.23±0.21)%/(2.56±0.86)%、(3.08±0.56)%/(12.01±2.01)%、(4.01±0.48)%/(9.80±1.80)%、(3.98±1.78)%/(11.85±4.83)%、(3.76±1.08)%/(10.78±2.35)%.结论选用工作浓度为5～10 μg/mL的Ion联合工作浓度为25 ng/mL的PMA刺激培养大鼠淋巴细胞即可起到较好的激活作用,而且不会带来如CD4细胞下调、流式细胞术设门难度增加等干扰因素.在该浓度下,CD3/CD8和CD4两种设门方案均可用于大鼠Th1/Th2细胞检测.
