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佛波酯等3种促癌物诱导BALB/c 3T3细胞骨桥素基因表达升高
目的探讨促癌物佛波酯(12-O-tetradecanolylphorbol-13-acetate,TPA),岗田酸(Okadaic acid,OA)和氯化镉(Cadmium Chloride,CdCl2)在促进BALB/3T3细胞转化过程中对骨桥素基因(Osteopontin,OPN)转录表达的影响.
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蛋白激酶B在佛波酯诱导人胃癌细胞系凋亡中的作用
目的 讨佛波酯(TPA)诱导胃癌细胞系凋亡过程中蛋白激酶B(PKB)的作用.方法 通过BrdU处理,流式细胞术检测以及DAPI染色,荧光显微镜观察分析TPA对胃癌BGC-823细胞的影响;免疫印迹法检测TPA对PKB蛋白表达水平、磷酸化的影响;核浆分离获得核浆蛋白,用于免疫印迹法检测TPA对胃癌细胞内PKB和其Ser 473位点磷酸化的核浆表达影响,以及激光扫描共焦显微镜观察TPA是否改变胃癌细胞内PKB的分布. 结果TPA诱导BGC-823细胞凋亡;TPA下调BGC-823细胞内PKB蛋白表达,并且与TPA作用时间和TPA浓度呈正相关,与PP2A降解作用无关;TPA抑制PKB的Ser 473位点磷酸化,而对其Thr 308位点磷酸化没有明显影响;TPA下调细胞核内PKB的表达以及Ser 473位点的磷酸化;TPA并不改变PKB在胃癌细胞内的分布. 结论 PKB的抑制作用可能参与TPA诱导胃癌细胞凋亡过程;由TPA诱导的胃癌细胞凋亡可能部分是由于细胞核内PKB蛋白表达和Ser 473位点磷酸化下降所致.
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佛波酯处理人胃癌MGC80-3细胞过程中磷酯酶C-γ2的意义
目的 探讨佛波酯(TPA)处理人胃癌MGC80-3细胞过程中磷酯酶C-γ2(PLC-γ2)的意义.方法 通过DAPI染色,荧光显微镜观察分析TPA对胃癌MGC80-3细胞的影响;借助核浆分离手段获得胃癌细胞核浆蛋白,并通过免疫印迹(Western blotting)检测TPA对PLC-γ2蛋白表达水平影响;通过免疫荧光技术处理,激光扫描共焦显微镜观察胃癌细胞内PLC-γ2蛋白的定位和转运;用PLC-γ2的抑制剂(U73122)预处理细胞,免疫印迹和激光扫描共焦显微镜分别检测其对TPA作用胃癌细胞内PLC-γ2的影响;以及荧光显微镜下观察分析U73122是否影响TPA对胃癌细胞的作用.结果 TPA诱导胃癌MGC80-3细胞凋亡;同时TPA提高PLC-γ2蛋白表达水平,并诱导其发生核浆转运;其抑制剂(U73122)可以降低TPA对PLC-γ2蛋白表达水平的作用,但并不能影响TPA诱导胃癌细胞凋亡;而TPA诱导的PLC-γ2核浆转运却没有被PLC-γ2抑制剂(U73122)阻止.结论 尽管TPA提高了胃癌MGC80-3细胞中PLC-γ2表达水平,但PLC-γ2表达水平和TPA诱导的胃癌MGC80-3凋亡没有直接关系,而其核浆转运可能与TPA诱导的胃癌细胞凋亡相关.
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佛波酯对人胃癌细胞Ha-ras基因启动子及启动子结合蛋白的影响
目的探讨佛波酯(PMA)对人胃癌细胞BGC-823 Ha-ras基因启动子活性及启动子结合蛋白活性的影响.方法通过RT-PCR和运用自行构建的真核表达载体prasEYFP转染细胞进行荧光细胞检测,并应用凝胶电泳移动检测、Southwestern blotting等方法检测PMA(100 μg/L)处理BGC-823细胞72和96 h后,对Ha-ras基因表达水平、Ha-ras基因启动子活性以及对Ha-ras启动子结合蛋白的影响. 结果经PMA(100 μg/L)处理72和96 h,与未处理细胞相比,BGC-823细胞中Ha-ras基因表达显著降低,Ha-ras基因启动子活性分别被抑制65.2%和71.8%;同时两个Ha-ras启动子结合蛋白活性也显著降低,经检测,其分子量分别约为18 kD,35 kD. 结论PMA长期处理通过降低人胃癌细胞中Ha-ras启动子结合蛋白活性使Ha-ras启动子活性被抑制,从而在转录水平上调节Ha-ras基因表达.
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建立麻疯树提取物中佛波酯的高效液相色谱测定方法
目的：：建立高效液相色谱测定麻疯树提取物中佛波酯含量的方法。方法：直接用二氯甲烷溶液稀释后,过滤、进样,流动相：乙腈/水(梯度洗脱),柱温25℃,流速1.0 ml/ min,检测波长280 nm,标准曲线范围15.6~250.0μg/ mL,相关系数 R=0.9999,检测时间40 min以内提取麻疯树提取液样品。结果：佛波酯标准曲线范围15.6~250.0μg/ mL,相关系数 R=0.9999,加样平均回收率91.2%-94.6%,精密度RSD 1.3%,检出限5.0μg/ mL。结论：该分析方法准确、样品处理方法简单、快速,适合大批量麻疯树提取物中佛波酯含量测定。
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香烟烟雾增加支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞的增殖表达
吸烟是影响支气管哮喘(简称哮喘)发生、发展的重要危险因素,它可以增加哮喘发生频率和症状的严重程度[1];香烟烟雾(CS)可使多种细胞蛋白激酶C(PKC)活化[2],但机制尚未明确.我们的实验通过CS及PKC激动剂:12-肉豆蔻酰-13-乙酸佛波酯(PMA)、抑制剂:马来酰亚胺甲磺酸盐(Ro-31-8220)干预哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMCs),用四甲基偶氮唑盐(MTT)和氚标-胸腺嘧啶脱氧核苷(3H-TdR)掺入法观察ASMCs增殖,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和蛋白印迹法检测ASMCs PKC-α的表达.探讨CS及PKC在哮喘大鼠ASMCs增殖中的作用,为明确CS影响哮喘的病理生理机制提供一些实验资料.
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PMA诱导Hela细胞ROS升高机制研究
目的 活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)升高是癌症转移的主要原因之一,ROS已成为一种新的抗癌靶点,但其形成机制尚未完全阐明.本研究以佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)诱导Hela细胞ROS升高为模型,探讨Hela细胞ROS升高的相关机制.方法 500 ng/mL的PMA诱导Hela细胞0.5 h,荧光酶标仪检测Hela细胞经过PMA诱导后的ROS产量,蛋白质印迹法检测Hela细胞经过PMA诱导后的HIF-1α 、Rac2和NOX2蛋白的表达量.结果 500 ng/mL PMA诱导Hela细胞0.5、1、2和4 h,与空白对照组比较,P值分别为<0.001、0.055、0.125和0.135,表明0.5 h为PMA诱导Hela细胞ROS升高的佳诱导条件.500 ng/mL PMA诱导Hela细胞0.5 h后,诱导组中HIF-1α 、Rac2和NOX2蛋白条带灰度平均值分别为15833.33±63.13、20448.33±78.65和21840.33±123.91,均高于空白组的9853.33±124.13、9782.00±93.62和10638.33±106.57,均P<0.001,表明PMA诱导了HIF-1α 、Rac2和NOX2蛋白的高表达.荧光酶标仪检测Hela细胞ROS结果显示,echinomycin组 、NSC23766组和DPI组与PMA组比较,P值分别为<0.001、0.003和<0.001,表明HIF-1α 、Rac2和NOX2抑制剂均抑制了Hela细胞中PMA诱导的ROS升高.蛋白质印迹法检测结果显示,空白组HIF-1α 、Rac2和NOX2灰度平均值分别为13571.00±287.68、10495.67±253.72和17403.33±162.87,PMA组分别为22946.33±67.10、30578.67±251.11和30582.00±88.39,NSC23766组分别为22629.67±445.26、3919.00±41.68和22618.67±161.51,echinomycin组分别为16691.33±9.504、15424.00±315.05和14899.00±71.55,DPI组分别为22970.00±714.88、30120.33±555.05和5787.00±12.29.echinomycin组与PMA组比较,均P<0.001,表明echinomycin抑制了PMA诱导的HIF-1α 、Rac2和NOX2蛋白的高表达;NSC23766组与PMA组比较,P值分别为0.354、<0.001和<0.001,表明NSC23766抑制了PMA诱导的Rac2和NOX2蛋白的高表达,但没有抑制HIF-1α 蛋白的高表达;DPI组与PMA组比较,P值分别为0.944、0.117和<0.001,表明DPI抑制了PMA诱导的NOX2蛋白的高表达,但没有抑制HIF-1α 和Rac2蛋白的高表达.结论 PMA能引起Hela细胞ROS升高,该现象依赖HIF-1α/Rac2/NOX2途径.这可能为阐明与ROS升高相关的癌症转移分子机制 、干预癌症转移的靶向治疗分子研究提供思路.
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PMA诱导K562细胞向单核细胞分化机制探讨
目的:探讨佛波酯(phorbol-12-myristate-13-ace-tate,PMA)诱导K562细胞向单核/巨噬细胞分化的作用机制.方法:采用CCK8法检测0、6.25、12.5、25、50、100和200 nmol/L PMA对K562细胞增殖的影响,应用Wright-Gimesa染色观察细胞形态学变化,采用流式细胞术检测细胞表面分化抗原CD11b和CD14的表达变化,采用RT-PCR分析TGF-β1及其下游基因SMAD3和SMAD4在基因水平的表达趋势,并采用蛋白质印迹法检测TGF-β1在蛋白水平的表达变化.结果:K562细胞经6.25 nmol/L PMA处理后72 h增殖抑制率为(22.03±2.7)％,12.5 nmol/L为(31.04±4.3)％,25 nmol/L为(35.03±3.5)％,50 nmol/L为(47.01±4.1)％,100 nmol/L为(55.06±5.2)％,200 nmol/L为(76.72±5.4)％,差异有统计学意义,F=2.24,P＜0.05.PMA能抑制K562细胞的增殖并能促进其分化,作用效果随剂量的加大逐渐增强;细胞形态学上趋向于成熟分化;细胞表面分子CD11b和CD14的表达量升高.在mRNA水平,TGF-β/SMAD信号通路因子TGF-β1的表达量随时间的延长逐渐升高其下游因子SMAD3和SMAD4的表达也呈上升趋势;在蛋白水平,TGF-β1的表达亦呈上升趋势.结论:PMA可通过促进TGF-β/SMAD信号的传导诱导白血病细胞株K562细胞向单核/巨噬细胞分化.
关键词： 佛波酯 K562 分化 TGF-β/Smad 细胞增殖 -
炎性刺激剂对小鼠腹腔巨噬细胞NF-κB的诱导
目的:建立炎性刺激剂诱导细胞核因子κB(Nuclear factor κB, NF-κB)的模型,研究传统非甾体抗炎药阿斯匹林(aspirin)作用机理. 方法:用脂多糖(LPS)和佛波酯(PMA)刺激小鼠腹腔巨噬细胞,用电泳迁移率改变检测法(electrophoretic mobility shift assay,EMSA)检测.结果:LPS 1 μg.mL-1及3 μg.mL-1,PMA 2 ng.mL-1均能诱导细胞核内NF-κB的含量.阿斯匹林10-5 mol.L-1可以显著抑制LPS(1 μg.mL-1)和PMA(PMA 2 ng.mL-1)对细胞核内NF-κB的活化.结论:所建立的以LPS和PMA为刺激剂,诱导细胞核内NF-κB的模型,可用于非甾体抗炎药的抗炎机理的研究.
关键词： 细胞核因子κB 电泳迁移率改变检测法 脂多糖 佛波酯 -
5种炎性刺激剂对小鼠腹腔巨噬细胞生成肿瘤坏死因子的影响
肿瘤坏死因子α(TNFα)主要由单核巨噬细胞分泌,近年研究表明,它在炎症中起重要作用,如诱发皮肤炎症反应,引起过每性变态反应等.
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小胶质细胞老化导致多巴胺能神经元炎性介质释放的研究
目的 探讨老化小胶质细胞(MI)对损失神经元细胞线粒体功能及炎症介质释放的影响.方法 原代培养大鼠脑MI和传代培养PC12,以佛波酯(PMA)刺激MI发生老化,PC12经鱼藤酮损伤后与老化MI共育,实验分为A组:PC12细胞,未给予任何处理药物;B组:PC12与老化MI共育;C组:鱼藤酮损伤PC12与老化MI共育.流式细胞仪检测各组PC12线粒体膜电位及活性氧(ROS)水平.结果 PMA刺激MI蓝染阳性细胞数明显增加.C组FL1的平均荧光强度值/FL2的平均荧光强度值(FL1/FL2)高,B组、C组FL1/FL2均高于A组,差异具有统计学意义(P<0.05).说明C组细胞线粒体膜电位低,B组、C组细胞线粒体膜电位均低于A组.C组细胞DCF荧光强度高,B组、C组与A组比较差异具有统计学意义(P<0.05).说明C组细胞ROS水平高,B组、C组细胞ROS水平高于A组.结论 老化MI显著减低了正常PC12和受损PC12的线粒体膜电位并且提高了ROS分泌水平,对PC12细胞具有神经毒性作用.
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流式细胞术分析PMA诱导THP-1分化为巨噬细胞的表型特征
目的 用流式细胞术明确单独使用PMA诱导THP-1细胞分化而来的巨噬细胞的分化情况.方法首先用PMA刺激THP-1细胞分化为巨噬细胞,再分别使用LPS、IFN-γ和IL-6将细胞诱导为M1型巨噬细胞,用IL-4、IL-13和IL-6将细胞诱导为M2型巨噬细胞.显微镜下观察三种细胞的形态学改变,并用流式细胞术检测各细胞主要CD分子表达的差异.结果当THP-1分化为巨噬细胞后变为贴壁生长,细胞形态呈较规则的圆形或椭圆形;M1和M2细胞形态不规则,细胞突起较明显,细胞颗粒度较大.巨噬细胞表面与抗原提呈功能相关的CD分子的表达均较低,大部分呈阴性;而M1和M2细胞表面这些CD分子的表达均较高.结论单独使用PMA刺激THP-1细胞所分化而来的巨噬细胞抗原提呈能力较弱,基本处于静息状态.
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不同方法诱导THP?1细胞分化效果比较
目的 优化不同方法刺激THP?1细胞定向分化为M1、M2巨噬细胞及DC细胞,为M1、M2和DC三种体外细胞模型研究奠定基础.方法 首先用PMA和GM?CSF/M?CSF两种方法刺激诱导THP?1细胞分化,再分别添加不同细胞因子诱导其分化为M1、M2和DC细胞,观察细胞形态的变化,并用流式细胞术检测细胞表面分子的表达情况.结果 两种方法刺激细胞CD分子表达的整体趋势基本一致.THP?1?M1细胞表面CD80和CD86表达量显著增加;THP?1?M2细胞高表达CD163和CD209;THP?1?DC细胞CD14表达量显著降低,高表达CD80、CD86和CD11c.PMA刺激后,M1、M2和DC细胞均贴壁生长;GM?CSF/M?CSF刺激后,只有DC细胞部分贴壁生长,M1和M2细胞仍呈悬浮生长.结论 两种方法均能成功地诱导THP?1细胞向不同细胞亚型分化,但是诱导出来的细胞在形态上存在一定差异,可根据实验需求选择刺激方法.
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老化小胶质细胞影响多巴胺能神经元存活率的研究
目的 探讨老化小胶质细胞(MI)对损伤神经元细胞生存的影响.方法 原代培养大鼠脑MI和传代培养PC12,制备损伤PC12,MI老化相关 β-半乳糖苷酶(β-gal)染色鉴定,将过度活化后的MI及转移筛网移入生长有受损的PC12细胞内的培养板内,实验分为三组:①空白对照组:培养的PC12细胞,未给予任何处理药物;②PC12+老化MI组:PC12与老化MI共育;③鱼藤酮PC12+老化MI组:鱼藤酮损伤PC12后与老化MI共育.流式细胞仪检测PC12细胞凋亡率.结果 β-gal染色结果显示,PMA刺激MI组蓝染阳性细胞数明显增加.空白对照组为分化期PC12细胞,胞体呈梭形或者三角形贴壁生长;PC12+老化MI组和鱼藤酮PC12+老化MI组细胞形态变得不规则,突起结构逐渐消失或者变短,细胞体积逐渐变小,变圆.PC12+老化MI组和鱼藤酮PC12+老化MI组的细胞凋亡率均显著高于空白对照组,差异具有统计学意义(P<0.05),且鱼藤酮PC12+老化MI组的细胞凋亡率高.结论 老化MI可对PC12细胞具有神经毒性作用.
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蛋白激酶C表达上调与KBV200细胞多药耐药的关系
目的:探讨蛋白激酶C(PKC)的表达上调与肿瘤多药耐药的关系.方法:32P掺入法测定多药耐药KBv200细胞株的PKC活性;Western blotemg法检测PKC亚型表达和亚细胞分布;MTT法检测细胞耐药性;实验组应用200nmol/L佛波酯(PMA)预孵育KBV200细胞.结果:PMA可提高KBV200细胞的PKC总活性和膜组分PKC活性,降低浆组分PKC活性(P＜0.01);使膜组分PKCα表达增加,浆组分PKCα表达降低,膜组分PKCβ无明显变化,浆组分PKCβ的表达稍增强;PMA可升高长春新碱(VCR)、阿霉素(ADR)对KBV200细胞的IC50值(P＜0.01).结论:PMA使KBV200细胞耐药性增加,可能与PKC表达上调有关.
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Ang-(1-7)对AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞MMP-9表达的影响
目的 探讨血管紧张素(1-7)[Ang-(1-7)]对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)人单核/巨噬细胞(THP-1) 基质金属蛋白酶-9(MMP-9)表达的影响及其机制.方法 佛波酯(PMA)诱导THP-1单核细胞分化为巨噬细胞后分为8组:对照组、Ang-(1-7)组、AngⅡ组、Ang-(1-7)+AngⅡ组、A-799+Ang-(1-7)+AngⅡ组,其中Ang-(1-7) +AngⅡ组根据Ang-(1-7)的浓度又分为10-8mol/L Ang-(1-7)+AngⅡ组、10-7 mol/L Ang-(1-7)+AngⅡ组、10-6 mol/L Ang-(1-7)+AngⅡ组、10-5 mol/L Ang-(1-7)+ AngⅡ组.用半定量RT-PCR检测细胞MMP-9 mRNA表达的情况.结果 AngⅡ干预后较对照组MMP-9mRNA显著增加(P<0.05);而Ang-(1-7)呈浓度依赖性减弱AngⅡ诱导的MMP-9 mRNA表达(P<0.05);加入A-799后抑制作用明显减低(P<0.05).结论 Ang-(1-7)浓度依赖性地抑制AngⅡ诱导THP-1巨噬细胞MMP-9 mRNA表达,可能通过其特异性受体Mas来发挥作用.
关键词： 血管紧张素(1-7) 血管紧张素Ⅱ 人单核/巨噬细胞 佛波酯 -
佛波酯诱导人肾系膜细胞清道夫受体的表达
脂质在肾小球内沉积是促进肾病进展的重要因素,清道夫受体(SR)介导氧化型低密度脂蛋白在平滑肌细胞中沉积,是促使动脉硬化的重要途径.
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rhC5a诱导PBMC产生IL-8与PKC的关系
目的:研究PKC在rhC5a诱导外周血单个核细胞(PBMC)产生IL-8中的作用.方法:将PBMC分别与rhC5a、 PMA、孵育24h,取上清用ELISA法测定IL-8.将PBMC分别与rhC5a、PMA孵育,按一定时间间隔收集细胞测定PKC活性.用Cheleythrine、 Calphostin C、 Dequalinium预处理PBMC,然后再以rhC5a诱导测定其PKC活性.结果:PBMC经rhC5a诱导后IL-8产生水平增加,同时PKC活性呈双峰型增高;PBMC经PMA诱导后不仅PKC活性增高,而且IL-8产生水平也增加;Cheleythrine、 Calphostin C、 Dequalinium能抑制rhC5a介导的PBMC PKC活性和IL-8产生水平增高.结论:PKC参与rhC5a诱导PBMC产生IL-8细胞内信号转导过程.
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PMA+Ion和PHA用于流式细胞术检测Th1/Th2细胞的结果比较
流式细胞术检测Th1/Th2细胞是近几年发展的基于细胞内细胞因子染色的新技术,可在单细胞水平区分Th1/Th2[1].采用细胞活化刺激剂诱导细胞活化,进一步刺激细胞分泌细胞因子,从而达到放大但仍能反应原有细胞因子分泌格局的目的.常用的活化刺激剂为植物血凝素(Phytohemagglutinin,PHA)和佛波酯(Phorbol myristate acetate,PMA)加离子霉素(ionomycin,Ion).本实验采用四色标记流式细胞术比较了上述两种刺激剂对全血检测细胞表面分子及胞内细胞因子的影响,以期为该方法的进一步优化及检测结果的分析提供可靠的依据.
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佛波酯对人单核白血病细胞THP-1中颗粒溶素表达的激活作用
目的 探讨佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetatefor,PMA)对人单核白血病细胞THP-1中颗粒溶素(granulysin,GLS)表达的激活作用.方法 分别用不同浓度的PMA(130、160、180 nmol/L)诱导THP-1细胞24 h,RT-PCR法检测细胞中GLS基因mRNA的转录,筛选PMA佳诱导浓度;用PMA佳诱导浓度分别诱导THP-1细胞12、24和48 h,RT-PCR法检测GLS基因mRNA的转录,筛选佳诱导时间;用PMA佳诱导浓度分别诱导THP-1细胞12、24、48和72 h,Westem blot法检测GLS蛋白的表达,免疫细胞化学法检测48 h时GLS蛋白的表达.结果 以160nmol/L的PMA诱导THP-1细胞24h,细胞中GLS基因mRNA的转录水平高;诱导48 h后可检测到GLS蛋白大量表达.结论 PMA可激活THP-1细胞中GLS的表达,本实验为后续进一步研究GLS表达的调控机制奠定了基础.
