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颗粒溶素的克隆表达及活性分析
目的 克隆人颗粒溶素基因并进行原核表达.方法 体外分离并培养外周血单个核细胞,抽提总RNA,RT-PCR扩增人颗粒溶素的基因片段,并将其插入pMD18-T进行测序,鉴定正确后分别将目的基因亚克隆至pET32a(+),构建原核表达质粒pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,将重组质粒转入大肠杆菌Rosetta(DE3),IPTG诱导表达融合蛋白,SDS-PAGE和Western-blot鉴定融合蛋白的正确性.MTT检测颗粒溶素融合蛋白的生物活性.结果 成功构建了原核表达载体pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,经诱导在原核表达系统中高效表达了相应分子质量约31和37 ku的融合蛋白,重组颗粒溶素融合蛋白能特异地与抗颗粒溶素抗体结合,GNLY9K融合蛋白可以明显抑制A549细胞增殖,而GNLY15K融合蛋白对细胞增殖影响极低.结论 利用原核表达体系成功地表达了不同分子质量的颗粒溶素融合蛋白,为颗粒溶素的后续研究奠定了基础.
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原发性胆汁性肝硬化患者三种免疫效应分子的表达及临床意义
目的 研究颗粒溶素(granulysin,GNLY)、颗粒酶B(granzyme B,GrB)及穿孔素(perforin,PF)三种免疫效应分子在原发性胆汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis,PBC)外周血中的表达并探讨其与PBC的关系.方法 以正常健康人和肝炎后肝硬化患者为对照,用实时荧光定量RTPCR方法检测PBC患者PBMC中GNLY、GrB及PF mRNA的含量.用ELISA方法检测PBC患者血清中GNLY表达情况并分析其与肝功能的相关性.结果 PBC组GNLY、GrB mRNA平均拷贝数显著高于健康对照组(P＜0.01)和疾病对照肝炎后肝硬化组(P＜0.001),而PF mRNA与对照组相比差异无统计学意义.PBC患者血清中的GNLY蛋白表达显著高于健康对照组(P＜0.01)和乙型肝炎后肝硬化组(P＜0.01).血清中GNLY浓度与血清GGT、ALP的浓度呈正相关(P＜0.01).结论 PBC患者GNLY、GrB mRNA和含量显著高于对照组,同时ELISA方法检测出PBC患者血清中GNLY蛋白含量显著高于对照组,GNLY、GrB表达与PBC的发病存在一定的关联性,为临床PBC病情的监控提供可靠依据.
关键词： 原发性胆汁性肝硬化 颗粒溶素 颗粒酶B 穿孔素 逆转录-聚合酶链反应 -
颗粒溶素酶联免疫吸附测定法的建立及临床初步应用
颗粒溶素(granulysin, GNLY)是脂结合蛋白-皂素样蛋白(saposin-like protein , SAPLIP)家族成员之一,具有广谱细胞毒活性,在抗感染和抗肿瘤免疫中发挥重要作用[1-3].因此,对GNLY血清表达水平准确定量具有重要意义.本中心建立GNLY血清水平酶联免疫吸附测定(ELISA)法,并检测30名正常人及30例传染性单核细胞增多症(IM)患者血清GNLY水平,以进行不同疾病期比较分析,并探讨GNLY在感染性疾病诊断和临床实时监测中的应用价值.
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PBC患者granulysin基因和蛋白的表达及临床意义
目的:探讨颗粒溶素(granulysin,GNLY)在原发性胆汁性肝硬化和患者(PBC)中的表达及其意义.方法:采用TaqMan探针技术,以18S rRNA为内参照,测定60例PBC患者外周血中GNLYmRNA的含量,同时应用酶联免疫吸附法(ELISA),检测PBC患者血清中GNLY蛋白的水平,并以健康体检组(n=100)和乙型肝炎肝硬化组(n=60)为对照.结果:PBC组GNLY mRNA的平均拷贝数显著高于健康对照组[(2.7±2.5)×108 vs (3.0±1.9)×107,P＜0.01]和乙型肝炎后肝硬化组[(2.7±2.5)×108 vs (4.7±3.6)×105,P＜0.001).PBC患者血清中的GNLY蛋白表达显著高于健康对照组(15.48±3.24 μg/L vs 4.76±2.32 μg/L,P＜0.01)和乙型肝炎后肝硬化组(1 5.48±3.24 μg/L vs 2.57±1.84 μg/L,P＜0.01).结论:GNLY的表达与PBC的发生、发展存在一定的相关性,可用于PBC临床诊断.
关键词： 原发性胆汁性肝硬化 颗粒溶素 逆转录-聚合酶链反应 酶联免疫吸附测定法 -
颗粒溶素和白细胞介素12重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病的治疗作用
目的 探讨携带编码人天然颗粒溶素和小鼠白细胞介素12(IL-12)基因质粒(pZM03)的重组耻垢分枝杆菌对结核分枝杆菌感染的疗效与机制.方法 结核分枝杆菌H37Rv感染Balb/c小鼠4周后,分别用生理盐水、耻垢分枝杆菌、pZM03、重组耻垢分枝杆菌治疗6次,于第1次治疗后3个月处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞γ干扰素的分泌水平、血清IL-12和IgG2a分泌水平和肺、脾组织中颗粒溶素表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果 重组耻垢分枝治疗组的肺和脾组织对数荷菌量分别为(4.57±0.28)和(3.47±0.25)CFU/g,比生理盐水组的(5.77±0.12)和(4.66±0.18)CFU/g、载体组的(5.62±0.14)和(4.65±0.26)CFU/g及质粒组的(5.04±0.22)和(4.25±0.48)显著降低;重组耻垢分枝杆菌组和pZM03组经结核菌素纯蛋白衍生物刺激后,γ干扰素分泌水平显著高于耻垢分枝杆菌组和生理盐水对照组;重组耻垢分枝杆菌组血清IL-12水平和IgG2a水平显著高于耻垢分枝杆菌组和生理盐水对照组.用免疫组织化学方法检测到小鼠肺及脾组织中颗粒溶素的表达.生理盐水和耻垢分枝杆菌组的肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛,增生改变不明显;重组耻垢分枝杆菌组的病变范围局限,并有类上皮细胞和泡沫细胞.治疗组和对照组的脾脏病理改变不明显.结论 携带颗粒溶素和IL-12的重组耻垢分枝杆菌对小鼠结核病有一定的免疫治疗作用,与增强宿主Th1型免疫应答和颗粒溶素的抗菌活性有关.
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肺结核病患者外周血单个核细胞颗粒溶素基因的表达及临床意义
目的 建立检测人颗粒溶素(GNLY)mRNA含量的实时荧光定量RT-PCR的方法,并测定肺结核病患者外周血单个核细胞(PBMC)中GNLY的基因表达水平,探讨GNLY基因在肺结核病患者PBMC中的表达及其临床意义.方法 应用已构建的质粒pGEM-T/GNLY作为定量模板行实时荧光定量RT-PCR测定收集自122例肺结核患者的标本,其中来自痰结核分枝杆菌阳性者62例(菌阳组),痰结核分枝杆菌阴性者60例(菌阴组)及40例健康对照者(对照组)外周血中GNLY mRNA的含量,并分析菌阳组抗结核治疗前后GNLY基因表达水平的变化.结果 肺结核患者PBMC GNLY基因表达水平显著低于对照组(P < 0.01);治疗前菌阳组PBMC GNLY基因表达水平显著低于菌阴组(P < 0.05);治疗后菌阳组PBMC GNLY基因表达水平较治疗前显著升高(P <0.05).结论 本研究成功建立了检测人GNLY基因表达含量的荧光定量RT-PCR方法,GNLY基因表达水平可作为肺结核治疗的疗效观察及预后判断的一个新的实验室指标.
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隐球菌性脑膜炎患者颗粒溶素的表达及临床意义
目的：探讨隐球菌性脑膜炎患者颗粒溶素(GNLY)的表达和临床意义。方法选择28例隐球菌性脑膜炎患者作为脑膜炎组，另选同期进行健康检查的28例健康人作为健康人组，分离其外周血单个核细胞，并采用免疫印迹法检测其蛋白含量，再使用荧光定量法检测mRNA的含量，分析隐球菌性脑膜炎患者蛋白质含量与其他免疫指标的关系。结果和健康人组相比脑膜炎组GNLY蛋白、mRNA含量明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)；脑膜炎组患者的GNLY蛋白质的表达情况和血清中的干扰素(IFN)-γ、免疫球蛋白(Ig)G水平呈正相关，与白细胞介素(IL)-10水平呈负相关。结论颗粒溶素直接影响隐球菌性脑膜炎患者的病情发展，通过测定其水平可为患者的治疗提供理论依据。
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慢性阻塞性肺疾病患者淋巴细胞颗粒溶素的表达及其与血清γ干扰素、白介素2相关性研究
目的 探讨慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)患者不同病期颗粒溶素表达特点以及和γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)、白介素2(interleukin-2,IL-2)之间的关系.方法 采用免疫细胞化学技术检测108例COPD患者及46名健康对照组外周血淋巴细胞的表达水平,采用双抗体夹心ABC-ELISA法同步测定血清IFN-γ、IL-2浓度.结果 颗粒溶素在COPD患者和健康对照组外周血淋巴细胞中的阳性表达率比较差异有统计学意义(P<0.01).颗粒溶素在健康对照组、临床缓解期、急性发作期的外周血淋巴细胞中表达比较差异有统计学意义(P<0.01).COPD患者急性发作期血清IFN-γ、IL-2浓度较临床缓解期和健康对照组显著增高(P<0.01).COPD患者急性发作期和临床缓解期颗粒溶素表达与血清IFN-γ、IL-2浓度变化均呈正相关,并随着病情变化存在明显消长关系.结论 颗粒溶素参与了COPD炎症过程,起着清除病原体的积极作用.IFN-γ、IL-2与颗粒溶素在消除病原体方面可能起着相互协同的作用,可能影响颗粒溶素的释放.
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低剂量颗粒溶素对单核细胞和T细胞具有趋化作用
目的 探讨低剂量颗粒溶素(GNLY)对免疫细胞的趋化作用.方法 抽取健康人全血,分离出外周血单个核细胞(PBMC),经免疫磁珠法纯化出单核细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD4+/CD45RA+T细胞、CD4+/CD45RO+T细胞、CD8+/CD45RA+T细胞和CD8+/CD45RO+T细胞,再用96孔微孔趋化板进行趋化反应.结果 颗粒溶素可趋化一些T细胞系、单核细胞系,趋化指数≥2(P＜0.05),而对B细胞系的趋化指数为＜2.用百日咳毒素预处理过的T细胞系、单核细胞系不再对颗粒溶素有反应,提示颗粒溶素介导的趋化作用涉及G蛋白偶连受体.结论 颗粒溶素不仅是一种细胞毒性分子,而且具有化学趋化作用.颗粒溶素在10～100 μmol发挥细胞毒活性而在相对较低的浓度下发挥趋化作用且此效应涉及G蛋白偶连受体.
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隐球菌性脑膜炎患者颗粒溶素的表达及其临床意义
目的 研究颗粒溶素(granulysin,GNLY)免疫效应分子在隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis)外周血单个核细胞中的表达及其临床意义.方法 首先用密度梯度离心法分离得到25例隐球菌性脑膜炎患者和30例健康人外周血单个核细胞(PBMC),其次用免疫印迹的方法检测其中的GNLY蛋白含量,用实时荧光定量(RFQ)-PCR方法测定其中GNLY的mRNA含量.并分析隐球菌性脑膜炎患者GNLY蛋白含量与一些免疫指标的相关性.结果 与健康对照组比较,隐球菌性脑膜炎患者PBMC中GNLY蛋白含量(相对定量为正常对照组的0.56倍)和mRNA(相对定量为正常对照组的0.6倍)均明显降低(P<0.01).隐球菌性脑膜炎患者中GNLY蛋白表达水平与血清IgG水平成正相关(r=0.477,P<0.05).结论 GNLY可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程,这为探讨隐球菌性脑膜炎的病情监控和有效治疗提供了新的线索.
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重组BCG联合抗痨药物对小鼠结核病治疗作用的实验研究
目的:探讨携带编码人天然颗粒溶素(Granulysin,GLS)和小鼠IL-12基因的重组BCG与抗痨药物对结核分枝杆菌感染的协同治疗效果.方法:将结核分枝杆菌H37Rv感染的BALB/c小鼠40只随机分成4组.感染4周后分别用生理盐水、重组卡介苗(BCG)、INH+PZA和重组BCG联合INH+PZA治疗,于第一次治疗后3个月,处死小鼠,检测器官荷菌量、脾淋巴细胞IFN-γ和TNF-α的分泌水平、血清IL-12和IFN-γ、肺、脾组织中GLS表达,同时观察小鼠肺、脾组织病理改变情况.结果:重组BCG联合INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量(log CFU/g)比重组BCG和INH+PZA治疗组显著降低;重组BCG和INH+PZA治疗组肺、脾组织荷菌量比生理盐水组显著降低.重组BCG组经PPD刺激后IFN-γ和TNF-α分泌水平明显高于其它组.重组BCG联合INH+PZA治疗组和重组BCG组血清IL-12和IFN-γ水平明显高于生理盐水组.重组BCG组用免疫组化检测到小鼠肺及脾组织中GLS的表达.重组BCG和INH+PZA组病变轻且局限,生理盐水组肺组织病理改变以渗出为主,病变广泛.重组BCG联合INH+PZA治疗组肺组织病变轻.结论:GLS/IL-12重组BCG对小鼠结核病有一定免疫治疗作用;重组BCG联合临床常用的抗痨药可增强抗结核病的疗效.
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颗粒溶素重组表达载体的构建和原核表达
目的:构建人颗粒溶素(Granulysin,GNLY)基因的表达载体并在大肠杆菌中表达.方法:抽提体外培养的单个核细胞总RNA,通过RT-PCR的方法获得含有222 bp的颗粒溶素cDNA , 克隆到pMD18-T 载体,测序正确后再亚克隆到质粒pET28a(+) 中,构建重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,在大肠杆菌中诱导表达并经Ni亲和层析纯化.用SDS-PAGE和Western blot对表达产物进行鉴定.采用MTT法检测GNLY融合蛋白的生物学活性.结果:酶切结果证实,成功地构建了GNLY原核表达载体,并在大肠杆菌中获得稳定的表达,表达产物的相对分子质量(Mr)同预期值相一致.结论:成功构建了重组表达质粒pET28a(+)-GNLY,并在大肠杆菌BL21(DE3)plysS中表达,获得了具有良好的抗原性和特异性的GNLY融合蛋白,为下一步研究人GNLY的功能奠定了基础.
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热灭活白念珠菌刺激PBMC对颗粒溶素和TNF-α表达的影响
目的:研究热灭活白念珠菌刺激健康个体外周血单个核细胞对颗粒溶素和TNF-α表达的影响.方法:在热灭活白念珠菌刺激的情况下,采用ELISA和RT-PCR检测颗粒溶素的表达;采用SrCl2以及siRNA下调PBMC内颗粒溶素的表达,或者加入外源性颗粒溶素,观察TNF-α在mRNA和蛋白水平表达的变化.结果:热灭活白念珠菌刺激可以诱导PBMC合成颗粒溶素和TNF-α,采用SrCl2或siRNA下调颗粒溶素的表达均会引起TNF-α在mRNA和蛋白水平表达的下调,而加入外源性的颗粒溶素可以促进TNF-α的表达.结论:热灭活白念珠菌刺激PBMC可以引起颗粒溶素和TNF-α的表达,且颗粒溶素可能是促进TNF-α表达的因素.
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荧光定量RT-PCR测定人颗粒溶素基因表达水平
目的:通过建立荧光定量RT-PCR的方法,检测颗粒溶素(Granulysin,GNLY)mRNA在人外周血单个核细胞(PBMCs)中基因表达的水平.方法:基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆载体pMD18-T-GNLY,建立荧光定量RT-PCR方法,并检测了40名正常健康献血者外周血中GNLY的表达水平.结果:内参18 S rRNA的动态检测范围为103～108拷贝/μg RNA;而40名正常健康人外周血的PBMCs中均有GNLY mRNA的表达,范围为3.12×106～4.32×107拷贝/μg RNA,均值为[(2.0±1.3)×107]拷贝/μg RNA.结论:建立了人GNLY基因表达水平的荧光定量PCR检测方法,结果准确可靠,为今后进一步研究GNLY mRNA表达水平与感染性疾病免疫机制的相关性研究打下了基础.
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hsa-microRNA-218对颗粒溶素表达影响的探讨
目的：探讨hsa-microRNA-218（hsa-mir-218）对颗粒溶素（Granulysin，GLS）表达的影响。方法：抽提佛波酯（ Phorbol 12-myristate 13-acetatefor ， PMA）激活的THP-1细胞的总RNA，逆转录后PCR扩增GLS基因，将其克隆至pDsRed-Ex-press-C1，构建GLS表达质粒pDsRed-GLS。将pDsRed-GLS与pGenesil-mir-218（pGenesil-mir-control）共转染293T细胞，36 h后激光共聚焦显微镜观察两种质粒在细胞中的表达情况，48 h后提取细胞总RNA和蛋白，RT-PCR和Western blot检测hsa-mir-218对GLS表达的影响。结果：酶切和测序结果证实重组质粒pDsRed-GLS构建成功，且能与microRNA干扰质粒在293T细胞中共表达。与转染pGenesil-mir-control组细胞相比，Western blot 结果显示转染pGenesil-mir-218组细胞GLS蛋白表达下降约50％，而GLS mRNA表达无明显变化。结论：hsa-mir-218在转录后水平干扰了GLS的表达，为进一步探讨mir-218干扰GLS表达的机制打下基础。
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COPD患者外周血T淋巴细胞颗粒溶素的表达及意义
慢性阻塞性肺疾病(COPD)是严重危害人民健康的慢性呼吸系统疾病,感染是引起其反复急性发作的主要原因,亦是导致死亡的主要原因之一.由于耐药性的增加,给临床抗感染治疗带来了极大的困难.颗粒溶素(Granulysin)作为有利于病原体的清除的细胞免疫效应分子[1],在感染性疾病中可能发挥积极作用,我们检测了54例不同病期COPD患者外周血T淋巴细胞中Granulysin的表达,以探索Granulysin在COPD不同病期的临床价值及意义.
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隐球菌性脑炎患者颗粒酶B、颗粒溶素、穿孔素的表达及临床意义
目的 研究颗粒酶B(granzyme B,GrB)、颗粒溶素(granulysin,GNLY)及穿孔素(perforin,又称pore-forming protein,PFP)三种免疫效应分子在隐球菌性脑膜炎(cryptococcal meningitis)外周血单个核细胞中的表达及其临床意义.方法 首先用密度梯度离心法分离得到25例隐球菌性脑膜炎患者和30例健康人外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC),其次用免疫印迹(western blot)的方法检测其中的GrB、GNLY、及PFP的蛋白含量,用实时荧光定量(RFQ)-PCR方法测定其中GrB、GNLY、及PFP的mRNA含量.并分析隐球菌性脑膜炎患者蛋白含量与一些免疫指标的相关性.结果 与健康对照组比较,隐球菌性脑膜炎患者PBMC中GNLY、PFP蛋白含量和mRNA均明显降低,而GrB无明显变化.隐球菌性脑膜炎患者中GNLY蛋白表达水平与血清IgG、IFN-γ水平成正相关(r=0.477,P<0.05;r=0.534,P<0.05),与IL-10水平成负相关(r=-0.505,P<0.05).结论 GNLY、PFP可能参与隐球菌性脑膜炎的疾病进程,这为探讨隐球菌性脑膜炎的病情监控和有效治疗提供了新的线索.
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颗粒溶素对NK细胞和树突状细胞具有化学趋化作用研究
颗粒溶素(granulysin,GNLY)是存在于人类细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lympoeytes,CTLs)和自然杀伤细胞(NK Cells)胞浆颗粒中的细胞毒性蛋白[1].
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人颗粒溶素活性肽与小鼠白细胞介素-12共表达质粒的构建与真核表达
目的 构建能分泌表达相对分子质量为9 000的人颗粒溶素活性肽与小鼠白细胞介素-12(mIL-12)的真核共表达质粒,并检测其蛋白表达.方法 以含有颗粒溶素cDNA序列的质粒为模板,通过PCR扩增获得相对分子质量为9 000的颗粒溶素活性肽基因片段后,定向插入真核表达载体pBudCE4.1中,获得重组表达质粒pBudCE4.1-S9K,经双酶切及插入片段序列测定对质粒进行鉴定.同时,将小鼠IL-12亚克隆入pBudCE4.1另一多克隆位点,构建真核共表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12.采用RT-PCR、免疫细胞化学与Dot-ELISA法,检测颗粒溶素活性肽在RAW264.7细胞的瞬时表达与分泌.ELISA检测mIL-12的表达.结果 酶切、PCR及测序鉴定证实,颗粒溶素活性肽基因插入片段正确;RT-PCR和免疫细胞化学检测表明其可以在细胞中瞬时表达;Dot-ELISA检测表明颗粒溶素可分泌到细胞外.ELISA检测细胞培养上清有mIL-12表达.结论 已成功构建真核表达质粒pBudCE4.1-S9K/mIL-12,并能体外表达,为下一步利用颗粒溶素与mIL-12基因治疗肿瘤奠定了基础.
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颗粒溶素活性肽与增强型绿色荧光蛋白融合基因真核表达质粒的构建及其在小鼠黑色素瘤细胞中的表达
目的 构建人颗粒溶素(GLS)活性肽(9ku-GLS)与增强型绿色荧光蛋白(EGFP)融合基因的真核表达载体,并检测其在小鼠黑色素瘤细胞B16中的表达.方法 经PCR扩增9ku-GLS基因,插入质粒pBudCE4.1中,经酶切及测序鉴定正确后,亚克隆至质粒pEGFP-C1中,将融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K转染B16细胞,采用荧光显微镜及RT-PCR法检测融合蛋白的表达.结果 融合基因真核表达质粒pEGFP-C1/S9K经双酶切鉴定证明构建正确,转染B16细胞24 h后,荧光显微镜下可观察到绿色荧光,且经RT-PCR可扩增出267 bp的目的 基因片段.结论 已成功构建9ku-GLS与EGFP融合基因的真核表达质粒,且在B16细胞中表达了融合蛋白.
