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应用FCM监测肾移植患者颗粒酶B、穿孔素表达的临床意义
目的探讨肾移植患者外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素的表达与急性排斥反应的关系.方法用流式细胞分析仪(FCM)动态监测慢性透析(n=26)、急性排斥反应(n=12)、肾功能延迟恢复(n=10)、肾功能稳定(n=18)组患者的外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素表达差异和急性排斥反应的关系.结果①肾移植术后患者外周血淋巴细胞颗粒酶B、穿孔素表达强度由强到弱依次为急性排斥组、肾功正常组和肾功延迟恢复组.且急性排斥组与其余三组差异有显著性(P＜0.05);②其升高时间比临床上出现急性排斥的症状早3天左右.随着急性排斥反应的逆转,其表达也逐渐降低至原有基础水平附近.结论监测肾移植患者外周血淋巴细胞(PBLC)颗粒酶B、穿孔素的表达是一种有价值的、无创性的急性排斥反应的标志物,不仅有助于急性排斥反应的早期诊断,并可用来评价抗排斥治疗是否有效的手段之一.
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益心康对体外感染CVB3病毒心肌细胞凋亡相关因子caspase-3 mRNA和颗粒酶B、穿孔素表达的影响
目的 研究中药益心康对感染柯萨奇B3病毒(Coxsackie virus B,CVB3)新生乳鼠体外心肌细胞凋亡相关基因caspase-3 mRNA和颗粒酶B、穿孔素(PFP)表达的影响,探讨中药益心康治疗病毒性心肌炎的作用机制.方法 原代培养SD大鼠乳鼠心肌细胞,建立体外感染CVB3的心肌细胞模型,将心肌细胞分为4组:正常对照组、病毒组、中药益心康组及利巴韦林组.用RT-PCR法检测凋亡相关因子caspase-3 mRNA的表达,ELISA法检测颗粒酶B、PFP的表达.结果 中药益心康组caspase-3 mRNA、PFP、颗粒酶B的相对表达量明显低于病毒组(P＜0.01)和利巴韦林组(P＜0.05).结论 中药益心康能降低大鼠心肌细胞caspase-3 mRNA、颗粒酶B、PFP表达,从而抑制CVB3感染大鼠心肌细胞凋亡.
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白色念珠菌肠道感染对脾虚小鼠小肠组织中Perforin和Granzyme的影响
目的:通过对脾虚感染白色念珠菌小鼠小肠超微结构及黏膜组织中Perforin、Granzyme表达水平的观察,探讨机体在脾虚状态下感染白色念珠菌的部分免疫机制.方法:健康SPF级昆明种小白鼠60只,按随机数字表法分为空白对照组(N1组15只)、空白感染白念组(N2组15只)、脾虚模型对照组(M1组15只)、脾虚感染白念组(M2组15只).分别令N2和M2组小鼠感染白色念珠菌,白念菌浓度为2×108 CFU/ml,剂量为0.2 ml/10 g体质量,于染菌后第21天进行相关指标检测.采用RT-PCR法检测各组小鼠小肠组织中穿孔素(Perforin)、颗粒酶(Granzyme) mRNA表达水平;采用western-blot法检测各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme表达水平.结果:各组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平检测结果显示,与N1组比较,N2组、M1组、M2组小鼠小肠组织中Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著升高;与N2组比较,M1组Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著降低,而M2组Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著升高;与M1组比较,M2组Perforin、Granzyme mRNA及蛋白表达水平显著升高.结论:小肠局部黏膜组织中Perforin和Granzyme高表达水平可能是造成小肠黏膜局部损伤的免疫机制之一.
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益心饮对病毒性心肌炎心肌组织穿孔素和颗粒酶B基因表达的影响
目的观察益心饮对实验性病毒性心肌炎心肌穿孔素和颗粒酶B基因表达的影响.方法用cVB3感染Ba1b/c小鼠造成病毒性心肌炎动物模型,分别用生理盐水、益心饮口服液灌胃治疗,观察7 d和14d的心肌组织病理变化,并以RT-PcR法检测心肌组织中穿孔素和颗粒酶BmRNA表达水平.结果益心饮能够明显降低心肌组织中穿孔素和颗粒酶B mRNA表达,并明显减轻心肌的病理形态学损伤.结论益心饮有明显的抗免疫损伤作用,可能是通过降低穿孔素和颗粒酶B mRNA的表达而发挥免疫抑制作用.
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苏木对同种异位心脏移植大鼠心肌穿孔素mRNA表达的影响
目的:观察苏木(Sappan Wood)对同种异位心脏移植大鼠心肌穿孔素(perforin, PFP)mRNA表达的影响.方法:以Wistar大鼠为供体,以SD大鼠为受体,建立腹腔异位心脏移植模型,以RT-PCR法检测苏木对穿孔素mRNA表达的影响.结果:苏木可明显降低穿孔素mRNA的表达,并能明显减轻病理形态学及心肌细胞超微结构的损伤.结论:苏木有明显的抗免疫排斥作用,可能是通过降低穿孔素mRNA的表达而发挥免疫抑制的作用.
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TWS119对人NK细胞增殖和杀伤甲状腺癌BCPAP细胞的影响
目的 探讨糖原合酶激酶-3β抑制剂TWS119对NK细胞增殖和杀伤功能的影响.方法 从健康人外周血中分离单个核细胞(PBMCs),加入到NK完全培养基培养,分别于第1d和第7d时,加入TWS119 (0 ～8.0μmol/L)诱导培养.培养10 d后,用CCK-8法测定NK细胞增殖和杀伤甲状腺癌BCPAP细胞的能力;采用流式细胞术检测各组NK细胞纯度、颗粒酶和穿孔素的表达.结果 培养10d后,第1天加入TWS119诱导组对NK细胞纯度和增殖呈现抑制作用;而第7天加入在一定浓度范围的TWS119诱导培养时能促进NK细胞的增殖和杀伤指标穿孔素的表达及对甲状腺癌BCPAP细胞的体外杀伤活性.结论 TWS119在一定浓度范围能促进γδT细胞增殖和增强对甲状腺癌BCPAP细胞的杀伤功能.
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IL-23单独或联合IL-2诱导人外周血单个核细胞对K562细胞杀伤效应的实验研究
本研究旨在探讨IL-23单独或联合IL-2诱导的人外周血单个核细胞(PBMNC)对白血病细胞的杀伤效应及作用机制.IL-23(50 ng/ml)单独或联合IL-2(100 U/ml)体外诱导正常人PBMNC 72 h,并与白血病细胞株K562共同培养.采用CCK-8法测定不同时间诱导后的PBMNC对K562细胞的杀伤效应；采用ELISA方法检测杀伤活性大时细胞培养液中IFN-γ的水平；应用RQ-PCR法检测诱导后PBMNC的穿孔素、颗粒酶B的表达水平.结果表明,IL-23单独或联合IL-2作用后的PBMNC均对K562细胞有杀伤活性,随着时间延长,杀伤率明显增加,各个时间点比较,有显著性差异(P＜0.05)；各细胞因子组培养液中分泌IFN-γ水平均显著高于空白对照组(P＜0.05),其中以IL-23联合IL-2组诱导PBMNC表达IFN-γ的水平高,与其它两组比较,差异显著(P＜0.05).各细胞因子组PBMNC的穿孔素、颗粒酶B mRNA的表达量均较对照组明显增加(P＜0.05),且IL-23联合IL-2组的穿孔素、颗粒酶B mRNA表达量显著高于其他组(P＜0.05).结论:IL-23能促进PBMNC对K562细胞的杀伤活性,与IL-2联合具有协同增强作用,并呈时间依赖性.IL-23作用于PBMNC后IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B的表达均明显增加,且与IL-2具有协同作用.推测IL-23可能通过诱导PBMNC表达IFN-γ、穿孔素、颗粒酶B发挥抗白血病细胞作用.
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获得性重型再生障碍性贫血患者穿孔素基因突变检测
本研究旨在探讨穿孔素(perforin)基因PRF1突变是否为获得性重型再生障碍性贫血(SAA)发病的遗传易感性基础.用聚合酶链反应(PCR)方法扩增31例SAA患者及15名正常对照者外周血单个核细胞基因组DNA PRF1外显子2(exon2)及外显子3(exon3);用双脱氧终止法测序,与GenBank报道序列核对寻找突变位点;发现突变序列克隆入M13噬菌体载体中,对所得2条染色体相应序列分别测序,以确定不同突变在染色体上的分布.结果表明:在SAA患者,发现了2处基因突变即822位C>T纯合子突变(无义突变)及907位G>A杂合子突变(Met303 Val);rs885822单核苷酸多态性(SNP)位点分布病例组与对照组比较有统计学差异(p<0.05).结论:穿孔素基因突变可能是部分SAA患者的遗传易感因素.
关键词： 再生障碍性贫血 获得性重型再生障碍性贫血 穿孔素 基因突变 -
颗粒酶B和穿孔素免疫组织化学检测诊断肝移植急性排斥反应的敏感性与特异性
目的探讨颗粒酶B和穿孔素两种免疫活化分子在肝移植急性排斥诊断中的作用,及其与Banff急性排斥反应组织学诊断标准之间的对应关系.方法在常规组织学诊断基础上,将41份肝穿刺标本用颗粒酶B与穿孔素单克隆抗体进行免疫组织化学EnVision二步法标记,IPP图像分析软件计算阳性细胞数/mm2作为免疫活化细胞指数(AI),以组织学诊断作为评判有无急性排斥反应的标准.结果在41份肝穿刺标本中,组织学诊断为急性排斥反应21份,缺乏急性排斥反应组织学改变20份.急性排斥反应组颗粒酶B与穿孔素AI值显著高于无排斥反应组(P<0.001),中重度排斥反应组AI值显著高于轻度及其非确定性排斥反应组(P<0.001).与组织学诊断比较,颗粒酶B的敏感性、特异性、阳性预测值、阴性预测值及诊断一致率分别达到90.0%、95.2%、94.7%、90.9%以及92.7%;穿孔素的各指标也分别达到80.0%以上.结论颗粒酶B与穿孔素是急性排斥反应免疫效应细胞活化标志,在临床肝移植急性排斥反应时表达明显升高,作为组织学诊断急性排斥反应的辅助指标具有相当高的敏感性及特异性,可用于肝移植后肝穿刺标本的鉴别诊断.
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细胞毒性颗粒蛋白和细胞毒性淋巴瘤
细胞毒性颗粒蛋白为细胞毒细胞--自然杀伤细胞(NK细胞), 细胞毒性αβ和γδ-T淋巴细胞(CTL)--合成分泌的一组蛋白质, 包括穿孔素(perforin)、颗粒酶(granzymes)及T细胞限制性细胞内抗原-1(T-cell-restricted intracellular antigen-1,TIA-1)等.它们的单克隆抗体的成功获取, 使人们得以通过免疫组织化学法对表达这些颗粒的细胞毒性细胞进行研究.同时,对细胞毒细胞起源的淋巴瘤的研究也日益受到关注.
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黄芩提取物对柯萨奇B3m病毒性心肌炎病毒复制及Fas配体表达的影响
病毒性心肌炎(MV)严重危害人类健康,现代研究证实,病毒的直接损伤与细胞介导的细胞毒作用(CMC)是MV心肌细胞损伤的主要原因[1].CMC致靶细胞损伤主要有两条途径--穿孔素和Fas/FasL途径.黄芩提取物具有明显的抗病毒和调节免疫的作用,但其对MV鼠心肌中柯萨奇病毒嗜心肌株CVB3m的复制及浸润细胞中Fas配体表达的影响,迄今尚未见文献报道,本研究对此作初步探讨.
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人外周血NK细胞在细胞因子刺激下扩增后穿孔素、颗粒酶B基因表达的变化
目的 探讨经过纯化及在多种细胞因子的作用下扩增后的NK细胞,其穿孔素(per-furin)、颗粒酶B(granzyme B)表达水平的改变与细胞杀伤率的关系.方法 应用竞争性定量RT-PCR方法 检测了8例供者纯化、扩增后NK细胞的穿孔素、颗粒酶B基因表达水平,同时检测其对K562细胞的杀伤率.结果 经纯化、扩增后的NK细胞,在多种细胞因子作用下穿孔素和颗粒酶B的基因表达水平明显提高,且.IL-2+IL-15组、IL-2+IL-12+IL-15组基因的表达量均显著高于其他组,NK细胞对K562的杀伤率结果 与基因表达水平一致.结论 应用细胞因子后可使NK细胞的穿孔素、颗粒酶B基因表达水平明显提高,同时提高了NK细胞的杀伤功能.
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慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内穿孔素的表达与病毒载量的关系
目的 研究慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内穿孔素(Perforin)、干扰素(IFN-γ)和白细胞介素10(IL-10)表达与病毒消除的关系.方法 对50例慢性乙型肝炎患者外周血进行短期培养后,利用流式细胞术测定CD8~+细胞内Perforin、IFN-γ和IL-10表达,并与30例正常对照进行比较;利用荧光定量PCR检测慢性乙型肝炎患者HBV DNA的载量,分析其与CD8~+细胞内Perforin、IFN-γ和IL-10表达的关系.结果 慢性乙型肝炎组CD8~+T细胞Perforin、IFN-γ和IL-10的表达分别为(5.30 ±2.62)%、(4.05±2.25)%和(0.77 ±0.50)%,明显低于正常对照组(t分别为4.50、4.56、4.20,P均<0.01);26例HBeAg阳性的慢性乙型肝炎患者CD8~+T细胞Pefforin和IFN-γ的表达分别为(4.54 ±1.93)%和(3.32 ±1.59)%,明显低于24例HBeAg阴性的慢性乙型肝炎患者(t分别为2.22、2.54,P均<0.05);慢性乙型肝炎患者CD8~+T细胞内Perforin和IFN-γ表达率与乙肝病毒DNA载量成负相关(r分别为-0.539、-0.340,P<0.01、P<0.05).结论 慢性乙型肝炎患者细胞毒T细胞内Perforin、IFN-γ和IL-10表达减少,可能与慢性乙型肝炎患者病毒长期存在,病程迁延不愈有关.
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外周血淋巴细胞穿孔素和颗粒酶在不同乙型肝炎患者中的表达率比较
乙型肝炎发病机制涉及到细胞毒T淋巴细胞(CTL)和自然杀伤细胞(NK),穿孔素和颗粒酶是CTL和NK的主要效应物质.本文旨在探讨外周血淋巴细胞穿孔素/颗粒酶的表达与不同乙型肝炎的关系.
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中国HIV感染者细胞毒性淋巴细胞内穿孔素的差异性表达
目的了解中国HIV感染者细胞毒性相关的NK细胞及CD8+T细胞内穿孔素表达水平,探讨HIV感染过程中穿孔素表达与机体免疫功能的关系.方法采集31例未经抗病毒治疗的HIV感染者和经过高效抗逆转录病毒疗法(HAART)治疗的17例HIV/AIDS患者以及15例健康对照的抗凝全血,应用流式细胞仪胞内染色法检测CD56+/CD3-、CD3-/CD16+NK细胞及CD8+/CD3+内穿孔素表达的百分数,分析其与NK细胞绝对值、NK细胞百分数、CD4+T、CD8+T淋巴细胞绝对值及血浆病毒载量的相关性.结果中国HIV感染者的NK细胞CD56+/CD3-及CD3-/CD16+亚群穿孔素表达百分数(平均13.17%,平均24.05%)高于CD8+T细胞穿孔素表达百分数(平均9.03%);NK细胞内穿孔素表达低于健康对照(P＜0.05,P＜0.05),CD8+T细胞内穿孔素表达高于健康对照(P＜0.05);NK细胞及CD8+T细胞内穿孔素表达水平与其绝对计数显著相关,与疾病进展不相关.HAART治疗组NK细胞内穿孔素表达升高,CD8+T细胞内穿孔素表达无显著变化.结论中国HIV感染者NK细胞内穿孔素表达降低,抗病毒治疗后升高;CD8+T细胞内穿孔素表达升高,抗病毒治疗后无显著变化.
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NK细胞用于肿瘤免疫治疗的研究进展
NK细胞是具有多种免疫学功能的淋巴样细胞。NK细胞的描述可以追溯到25年前，但有关NK细胞识别转化细胞和病毒感染细胞的机制至今仍令人困惑。缺乏真正意义的特有标志也是NK细胞研究的一大难题，目前多采用“阳性筛选”(NK细胞具备相对特异的标志)和“阴性排除”(NK细胞绝对不具备的标志)相结合的办法来给NK细胞定性。人类NK细胞为CD56和CD16阳性，CD3、CD4和CD19为阴性。少部分NK细胞可以为CD8阳性。小鼠NK细胞为NK1.1和ASGM1阳性，CD3、CD4和CD8为阴性。NK细胞杀伤肿瘤细胞不受MHC限制，也不需预先与抗原接触或显示任何记忆反应。NK细胞对肿瘤的杀伤优势表现为直接溶解和分泌细胞因子两个方面，其杀伤肿瘤既可通过穿孔素又可通过Fas配基。NK细胞可以产生TNF-α、IFN-γ和IL-1，这些细胞因子在NK细胞抗癌反应中有十分重要地位。NK细胞具有对异体骨髓快速排异的能力，但并不介导实体组织的移植排异〔1，2〕，NK细胞对异体骨髓的排异功能可以追溯到30年前，但NK细胞对造血干/祖细胞杀伤的机制仍不清楚，可以肯定地说并不仅限于NK细胞的杀伤功能〔1〕。
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抗人CD134单抗对植物血凝素诱导的外周血单个核细胞穿孔素表达的影响
目的 观察不同浓度抗人CD134单抗对外周血单个核细胞(PBMC)穿孔素表达的影响及时间效应,旨在探讨抗人CD134单抗治疗自身免疫性疾病的可能机制.方法 在植物血凝素诱导下,分别以1 μg/ml、5 μg/ml和10 μg/ml的抗人CD134单抗作用于人PBMC,于6 h、12 h、24 h、48 h用反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测穿孔素mRNA表达,流式细胞仪检测穿孔素蛋白表达.结果 不同浓度的CD134单抗作用不同时间后,健康成人PBMC穿孔素mRNA和蛋白的表达均有不同程度的下调,且在24 h达低值.当CD134单抗≤5 μg/ml时,随着单抗浓度的增加,穿孔素mRNA明显下调,其差异有统计学意义,当CD134单抗浓度＞5 μg/ml时,穿孔素mRNA不再下调(P＞0.05);穿孔素蛋白表达也有类似的变化.结论 抗人CD134单抗可以在转录水平和翻译水平上抑制穿孔素的表达,这种作用在24 h达到高峰且会饱和,这可能被用于治疗某些自身免疫性疾病.
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黄芪对心肌炎小鼠心肌穿孔素mRNA和CVB3m mRNA表达的影响
目的探讨黄芪注射液治疗小鼠柯萨奇B3(CVB3)病毒性心肌炎(VMC)的疗效及其机制.方法 BALB/c小鼠24只腹腔感染柯萨奇病毒B3亲心肌细胞株(CVB3m)后,随机等分为两组:黄芪治疗组(黄芪注射液每天10g/kg腹腔注射)和对照组.实验第8天留取心肌,分别进行心肌病理检查,心肌穿孔素(perforin,PFP)mRNA和CVB3m mRNA逆转录多聚酶链反应(RT-PCR)分析,并对心肌组织PFP mRNA和CVB3m mRNA表达水平进行相关性分析.结果 (1)心肌组织病理改变:黄芪治疗组明显轻于对照组;(2)心肌PFP mRNA表达水平RT-PCR半定量:黄芪治疗组心肌PFP mRNA的表达明显低于对照组(1.10±0.07与1.31±0.12,P＜0.01);(3)心肌CVB3m mRNA表达水平RT-PCR半定量:黄芪治疗组心肌CVB3m mRNA表达明显低于对照组(1.07±0.04与1.18±0.02,P＜0.01);(4)心肌PFPmRNA水平与CVB3mmRNA水平呈显著正相关(r=0.68,P＜0.01).结论 PFP介导的细胞毒性作用在病毒性心肌炎的发病中起重要作用.黄芪对小鼠急性心肌炎模型中心肌组织CVB3m病毒复制有明显的抑制作用,心肌组织中PFP mRNA表达水平与心肌组织CVB3m mRNA的表达水平的变化具有同步性,黄芪对CVB3m诱导的小鼠急性心肌炎模型有显著的治疗作用.
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吡罗昔康提高γδT细胞杀伤胃癌细胞的机理探讨
目的 探讨吡罗昔康提高γδT细胞杀伤胃癌细胞的作用机理.方法 按常规方法培养γδT细胞,以不同浓度吡罗昔康诱导,收集培养上清液用于细胞因子IFN-γ、TNF-α、IL-12检测,沉淀细胞用流式细胞仪测定穿孔素、粒酶B和NKG2D,并用乳酸脱氢酶释放法检测γδT细胞杀伤胃癌细胞活性.结果 培养前γδT细胞数为5.12%,培养后γδT细胞数为91.27%.吡罗昔康浓度为0.04 mmol/L时诱导的γδT细胞穿孔素和粒酶B表达高且明显高于对照组,差异均有统计学意义(P均<0.05);吡罗昔康能显著抑制γδT细胞NKG2D的表达,并随着药物浓度的增加抑制作用越明显;经吡罗昔康诱导的γδT细胞能抑制TNF-α的分泌,并且随着药物浓度的增加抑制作用越明显.吡罗昔康各浓度组诱导的γδT细胞对SGC-7901细胞杀伤活性与对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05),但是对BGC-823细胞的杀伤活性,浓度在0.04mmol/L时作用强(76%),明显高于对照组(58%),与对照组比较差异有统计学意义(P<0.05).结论 经吡罗昔康诱导后γδT细胞杀伤胃癌细胞BGC-823活性明显增高的机制可能与γδT细胞表达较高浓度的穿孔素和粒酶B有关.这些结果从细胞免疫方面为吡罗昔康能够防治胃癌提供了一定的实验依据.
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冠心病患者外周血CD4+CD28null T淋巴细胞亚群变化及其临床意义
目的 探讨冠心病患者外周血CD+4CDnull28 T淋巴细胞的数量以及其表达穿孔素情况.方法 空腹采肘静脉血,采用流式细胞分析仪测定68例急性冠脉综合征(ACS),56例稳定型心绞痛(SAP)患者和65名健康人循环CD+4CDnull28 T淋巴细胞亚群扩增情况.结果 ACS患者循环CD+4CDnull28 T淋巴细胞数量(11.6%)显著高于SAP患者(2.84%)和健康者(0.59%);CD+4 Perforin+ T淋巴细胞数量(12.0%)也明显高于SAP组(3.06%)和对照组(0.25%).结论 ACS患者CD+4CDnull28 T淋巴细胞显著增加且表达穿孔素,这些细胞浸润到斑块处,可能通过细胞毒功能破坏血管内皮细胞而导致斑块破裂,从而参与ACS的发生.
