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肝窦内皮细胞的分离培养及体外生长规律的观察
目的：建立大鼠肝窦内皮细胞（SEC）的分离培养的方法，观察SEC体外培养的生长特点。方法通过门静脉插管进行胶原酶原位灌注，结合离体消化、Percoll密度梯度离心法分离SEC；应用Ⅷ因子和CD14间接免疫荧光法观察SEC表面分子的表达进行细胞鉴定；应用光学显微镜、电子显微镜、并首次使用原子力显微镜（AFM）观察体外培养状态下SEC的超微结构及形态学变化。结果 SEC获得率为每只大鼠（2.95±0.31）×107，细胞活力好。免疫荧光法鉴定CD14阳性率约达99%，Ⅷ因子相关抗原抗体阳性率约为2%。光学显微镜下观察，细胞形态变化典型，并持续增殖。电子显微镜下观察到细胞典型的由成簇窗孔组成的筛板样结构；AFM下实现了对SEC的三维结构的观察，细胞骨架清晰。结论高纯度、活力好的SEC的成功培养及体外生长规律的观察，为研究SEC在肝脏生理病理过程中作用提供了前提条件。
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Nonidet P-40致流感病毒脱包膜的AFM观察研究
目的 利用原子力显微镜(AFM)观察经非离子表面活性剂Nonidet P-40(NP-40)不同浓度系列处理的A型流感病毒表面形态变化,观察不同表面活性剂-病毒表面相互作用情况,以提供一种较为温和的病毒表面裂解条件,为利用AFM进一步研究病毒下层结构提供基础.方法 用不同浓度的非离子犁表面活性剂NP-40对完整的A型流感病毒进行处理,以轻敲模式经AFM成像,获得病毒球状体和丝状体的高度图、振幅图以及相位图,并观察和比较不同浓度非离子表面活性剂对病毒表面形态和结构的影响.结果 NP-40各浓度对病度表面破坏程度不一,病毒随NP-40浓度增高而逐渐降解,并出现部分剥离病毒表面.暴露下层衣壳,更清晰地展示包膜下层表面突起的表面形态学结果.结论 通过表面活性剂优化处理病毒颗粒,实现了利用AFM观测流感病毒包膜下形态结构的设想.
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原子力显微镜对不同类型胶原蛋白与细胞黏附情况的研究
目的 研究不同类型胶原蛋白与成纤维细胞及角质形成细胞的黏附情况,并用原子力显微镜观察其相互作用.方法 分别用牛肌腱胶原、鼠尾胶原和标准Ⅳ型胶原包被培养板,接种相同数量的原代角质细胞,在不同时相用活细胞电子计数仪测定未黏附细胞的数量,观察不同类型胶原所未黏附的细胞数量的多少,并用原子力显微镜观察胶原蛋白与细胞的黏附情况.结果 接种后5min,三种胶原(鼠尾胶原、牛肌腱胶原、标准Ⅳ型胶原)中未贴壁的细胞数差别较大,Ⅳ型胶原中未贴壁的细胞少;但培养至1h,三种胶原中未贴壁的细胞数无明显差别,三者的贴壁率几乎相同;培养至第6小时三种胶原中未贴壁的细胞数仍然无明显差别,三者的贴壁率仍然基本相近.原子力显微镜可以清晰观察到胶原及胶原与细胞间黏附的微观结构.结论 牛肌腱胶原和鼠尾胶原与Ⅳ型胶原对角质形成细胞的黏附作用无明显差别,原子力显微镜可以用于观察胶原及胶原与细胞间黏附的微观结构.
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原子力显微镜在细胞形态学中应用的现状和前景
原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)因其制作标本简单、观察环境广泛、扫描分辨率较高和超微图像清晰等诸多优点而广泛应用于生物医学领域.其纳米级的高分辨率为人类探索微观世界提供了一个新的武器.近年来,AFM在细胞形态学研究中的应用进展很快,这些研究成果在生物医学和临床医学中均有较好的应用前景.本文概述了原子力显微镜的基本工作原理并阐述原子力显微镜在细胞形态学研究中应用的现状和前景.
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原子力显微镜观测甲状腺相关眼病患者外周血T细胞
目的 应用原子力显微镜(AFM)对甲状腺相关眼病(TAO)患者外周血T细胞的膜表面进行观测,比较与正常T细胞的异同.方法 采用病例对照研究方法,选择42例TAO患者作为TAO组,根据病情将其分为活动期组(18例)和静止期组(24例),另外选择92例正常人作为正常组.经免疫磁珠法分离得到外周血T细胞,细胞培养进一步将T细胞纯化.流式细胞分析法对T细胞进行鉴定并检测其纯度,AFM原位扫描细胞样品.3组AFM观测数据采用单因素方差分析和Dunnett-t检验.结果 3组T细胞在形态上均呈现较为规则的圆形;正常组T细胞直径约在7～8μm,高度在600～850 nm之间;而TAO急性期T细胞直径偏大,约在9～11 μm之间,表面的凹凸不平较明显,可见颗粒状突起及凹陷,边缘还可观察到有细微的树枝状突起分布;静止期T细胞直径略小,约在8～10μm之间,而膜表而凹凸不平的程度介于其他两组之间.平均粗糙度、峰数、平均峰值高度、平均低谷高度、表面积差值指标在3组中有所不同(F=28.809,58.213,169.789,35.933,121.325;P<0.05),而峰数、表面积差值则存在两两差异(P=0.047,0.002).结论 应用AFM可观测到TAO患者外周血T细胞与正常T细胞膜表而的超微结构有所不同,而且TAO活动期和静止期的T细胞形态上也有差别.
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原子力显微镜观测小分子化合物J2对大鼠角膜移植术后内皮细胞膜表面的影响
目的 探讨应用原子力显微镜(AFM)观察大鼠角膜移植术后的内皮细胞,观测小分子J2化合物对角膜内皮细胞超微结构的影响.方法 队列研究方法.将30只取右眼行穿透性角膜移植术后的实验大鼠编号后计算机随机抽号分为2组,每组15只.A组为J2药实验组,B组为安慰剂对照组.每组于术后第5、10、15、20、25天,分别计算机选号随机取下3只大鼠的角膜植片,经苏木素-咿红染色及AFM样品固定.两组AFM观测数据平均粗糙度(Ra)、平均峰值高度(Rp)、平均低谷高度(Rv)采用单因素方差分析.结果 A组植片平均存活时间为(33.12±6.80)d,B组为(18.87±4.19)d,两组比较差异有统计学意义(F=47.7449,P=0.000).AFM观测发现两组样品在植片存活第5天均显示为较规则的六边形结构,直径约15μm,可见细胞表面的凹凸不平结构.随着时间延长,两组样品出现不同改变,术后第20天:B组样品的细胞结构无法辨认,凹凸不平的表面分辨困难,而A组的细胞仍然保持结构清晰.Ra、Rp和Rv在同期比较中,两组结果存在差异有统计学意义.术后第5天,A组:Ra(97.64±31.58)nm,Rp(297.79±25.19)nm,Rv(545.55±25.83)nm;B组:Ra(112.61±34.29)nm,Rp(265.06±24.17)nm,Rv(544.41±21.78)nm(Fa=30.9416,P=0.0000;Fp=263.6018,P=0.0000;Pv=1.2013,P=0.2735).术后第10天,A组:Ra(102.98±32.98)nm,Rp(711.38±21.94)nm,Rv(639.89±22.58)nm;B组:Ra(222.85±31.28)nm,Rp(111.22±20.35)nm,Rv(746.49±23.17)nm(Fa=2086.4535,P=0.0000;Fp=53768.4676,P=0.0000;Pv=3257.3178,P=0.0000).术后第15天,A组:Ra(87.44±34.97)nm,Rp(344.18±21.09)nm,Rv(482.61±22.27)am;B组:Ra(197.64±35.72)nm,Rp(510.76±24.98)nm,Rv(545.62±23.17)nm(Fa=1458.1057,P=0.0000;Fp=7788.6963,P=0.0000;Pv=1153.2860,P=0.0000).术后第20天,A组:Ra(85.85±32.53)nm,Rp(348.69±21.26)nm,Rv(367.65±23.12)nm;B组:Ra(201.36±34.12)nm,Rp(788.58±20.34)am,Rv(563.33±21.01)nm(Fa=1801.1215,P=0.0000;Fp=67 057.9516,P=0.0000;Pv=11 770.2195,P=0.0000).术后第25天,A组:Ra(104.97±32.47)nm,Rp(395.05±20.38)nm,Rv(396.17±21.59)nm;B组:Ra(43.85±31.28)nm,Rp(249.88±20.79)nm,Rv(154.88±22.37)nm(Fa=551.4134,P=0.0000;Fp=7458.9255,P=0.0000;Pv=18 070.5189,P=0.0000).结论 角膜移植术后,A、B两组的角膜内皮细胞应用AFM观测可发现在Ra、Rp及Rv比较上存在差异,小分子化合物J2可延迟角膜移植发生排斥反应的时间.
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氟影响大鼠牙釉质发育的扫描电镜和原子力显微镜观察
目的 观察大鼠氟斑牙模型下颌切牙釉质的超微结构,探讨过量氟对牙体微观结构的影响.方法 30只5周龄SD大鼠雌雄各半,均分为3组,对照组用不含氟的去离子水喂养,低氟组用含22.5 mg/L F-(50 mg/L NaF)、高氟组用含45 mg/L F-(100 mg/L NaF)的去离子水喂养;饲养8周后,取所有大鼠下颌切牙,制备用于扫描电镜和原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)观察的牙体组织切片,分析比较不同氟浓度对大鼠釉质微观结构的影响.结果 扫描电镜结果显示,对照组样本釉质中釉柱结构完整,晶体排列紧密,层次清晰;高氟组样本釉柱结构瓦解,晶体松散、弯曲折断;低氟组样本釉柱结构形态的变化介于对照组与高氟组之间.AFM结果显示,对照组、低氟组及高氟组样本釉质中层的平均粗糙度分别为(550.6±32.0)、(415.0±24.2)及(194.3±11.3) nm,高氟组与对照组相比差异有统计学意义(P＜0.05).结论 在高氟环境下形成的大鼠牙釉质出现明显的结构坍塌,釉柱间无间隙;高氟可造成大鼠发育中牙釉质的釉柱晶体正常结构丧失.
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人牙釉质酸蚀过程中三维形貌的原子力显微镜观察
目的 比较不同酸蚀时间处理后牙釉质表面的三维形貌并分析粗糙度的改变,探讨酸蚀对牙釉质微观形貌的影响.方法 将15颗新鲜前磨牙包埋、切割、打磨后得到光滑牙釉质切片,按单纯随机法分为5组,用37％磷酸凝胶分别酸蚀0(对照组)、5、10、20和30s,原子力显微镜观察釉质表面形貌,分析轮廓改变,计算图像的算术平均粗糙度(Ra)、均方根粗糙度(Rq)、十点高度平均差(Rz)值及表面积、容积并对5组的结果数据进行单因素方差分析,用Turkey's法进行组间两两比较,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 镜下形貌观察显示,0～20 s内釉质的釉柱结构逐渐明显,釉质表面由较光滑逐渐变为典型鱼鳞状；20 s后表面形态变化不明显.表面轮廓观察显示,随着酸蚀时间由0s增加至30 s,釉柱间隙首先被溶解,酸蚀深度逐渐增加到2.8μm,30 s后釉柱顶部宽度减小至1.8μm,且高度略降低.从0s到30 s,Ra值由(19.69±3.42) nm增加到(359.51±75.79)nm,Rq值由(22.02±5.57) nm增加到(431.02±83.09) nm,Rz值由(0.24±0.08) μm增加到(2.38±0.26) μm;组间比较显示,Ra和Rq值的20s组与30 s组和Rz值的10、20和30 s组差异无统计学意义(P＞0.05),其余各组间差异均有统计学意义(P＜0.05).同时釉质表面积由(406.77±3.88) μm2 (0 s)增大到(546.69±84.02) μm2 (30 s),容积由(65.73±14.46) μm3 (0 s)增大到(474.63±52.50)μm3(30 s).结论 随着酸蚀时间的增加,釉质表面酸蚀深度不断增大,表面粗糙度增加,表面积及容积增大,酸蚀会造成釉质微观形貌的明显改变.
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人颞下颌关节关节盘、软骨及下颌骨的纳米弹性性能
为探讨人颞下颌关节(TMJ)各结构及下颌骨骨组织在纳米量级的材料力学性能的分布特点,采用原子力显微镜及毫微压痕测量法,对3位正常成年男性6个TMJ的关节盘、髁突软骨、关节窝软骨和下颌骨皮质骨、松质骨不同部位的纳米弹性模量进行测量和分析.结果显示:人TMJ内关节盘、髁突软骨和关节窝软骨的不同部位具有不同的弹性模量,而各结构的弹性模量以前、内侧较高,中、后部及外侧较小.下颌骨皮质骨的弹性模量是松质骨的2倍多,而下颌骨颊侧骨组织的弹性模量则明显低于舌侧.提示在纳米范围测量,TMJ内各结构以及下颌骨骨组织为非均质性材料,其不同结构或同一结构不同区域在纳米量级所承受的局部力学载荷不同.
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900MHz电磁辐射对体外培养大鼠海马神经干细胞超微结构的影响
目的 观察900MHz电磁辐射对体外培养大鼠海马神经干细胞超微结构的影响.方法 体外培养新生大鼠海马神经干细胞,分为假辐照组(0mw/cm2)、辐照1组(1mW/cm2)和辐照2组(3mW/cm2).假辐照组在辐照1组和2组进行辐照时置于常规条件下培养.辐照1组和辐照2组又根据辐照方式不同分为2个亚组:连续辐照亚组,于细胞接种后第2天起每天辐照2h,连续6d；一次性辐照亚组,于接种后第6天一次性辐照12h.采用原子力显微镜(AFM)观察细胞表面超微结构的变化,测定细胞膜表面的平均粗糙度,以轮廓算术平均偏差(Ra)表示.采用透射电镜(TEM)观察胞内超微结构的变化.结果 900MHz电磁辐射后,与假辐照组相比,辐照1组和2组神经干细胞表面粗糙,有“孔洞”、“裂隙”样改变,细胞质均匀化改变,细胞器结构明显改变,细胞核形态结构破坏,核膜消失,染色质固缩、边集,这些改变在辐照2组更为明显.与假辐照组相比,辐照1组和2组细胞表面粗糙度(Ra)明显增加(P＜0.05),其中辐照2组较辐照1组更为显著(P＜0.05).前述变化在连续辐照和一次性辐照的细胞中均存在且相似.结论 900MHz电磁辐射可致体外培养的神经干细胞胞膜和胞内超微结构出现明显的损伤样改变,且与微波辐照剂量可能有一定关系.
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重组肿瘤相关抗原蛋白与肿瘤治疗性DNA疫苗静电耦合成为复合纳米颗粒的初步研究
目的:验证原核表达的重组肿瘤相关抗原蛋白SUR-IM与肿瘤治疗性DNA疫苗pVAX1-2PFcGB能够通过静电耦合形成复合纳米颗粒.方法:通过蛋白-DNA琼脂糖凝胶电泳阻滞实验、DNaseⅠ消化核酸的保护实验及原子力显微镜观察验证二者是否结合;此外,通过体外瞬时转染293T细胞研究蛋白质所结合的质粒是否能够在体外顺利表达.结果:证实二者确实能够通过静电耦合形成纳米级的颗粒,结合后蛋白质对DNA具有一定的保护作用,并且蛋白不会影响与之结合的质粒在细胞中的高效表达.结论:该复合纳米颗粒将蛋白质和核酸组分有机结合在一起,使肿瘤抗原、免疫佐剂及DNA肿瘤疫苗协同发挥作用,为日后进行抗肿瘤功能研究奠定了重要基础.
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乙酰胆碱对乙酰胆碱酯酶立体结构影响的初步原子力显微观察
目的为探索乙酰胆碱酯酶(AChE)活性中心狭隙与其快速水解功能的适应原理,研究乙酰胆碱(ACh)对AChE立体结构的影响.方法在云母表面重组磷脂膜,将AChE重组到磷脂膜上,用原子力显微技术观察.结果天然AChE表面平滑,边界清晰,中间突出,略呈椭圆球体, 蛋白颗粒长径为(62±25)nm, 短径为(53±13)nm,高度为(6±2)nm; 反应后酶蛋白表面变得粗糙,形态不甚规则,蛋白颗粒中心出现近圆形孔洞.结论 ACh对AChE立体结构具有明显影响.
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原子力学显微镜对液体纳米药物的直接观察
目的:建立液体纳米药物的观察方法.方法:用原子力学显微镜观察液体纳米药物.结果:未纳米药物在云母片上呈不均匀分布,呈现大小不同的颗粒,而液体纳米药物则呈均匀分布,并且颗粒比较均一.结论:为进一步探讨液体纳米药物在生物医学的应用及临床价值提供了依据.
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次声暴露对L929细胞膜影响的原子力显微镜观察
目的应用原子力显微镜观察次声作用后L929细胞膜的变化,探讨次声对细胞膜影响的机制.方法经过培养的L929细胞暴露于16 Hz、130dB的次声环境中,每天2 h,连续3 d后,应用原子力显微镜对对照和次声作用后的L929细胞膜表面进行纳米级水平的扫描观测.结果、次声暴露后,在7.5μm×7.5μm和4.0μm×4.0μm的扫描图像中可以看到,细胞膜表面正常的突起明显变短、凹陷变浅,呈鹅卵石样改变,膜表面变得较为平缓.结论一定强度的次声作用可引起细胞膜表面结构的直接改变,这种改变可能是次声对细胞作用的特征之一.
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基于原子力显微镜的损伤星形胶质细胞弹性模量变化的研究
目的：探讨星形胶质细胞受到损伤刺激后弹性模量的变化。方法分离、提取新生2 d SD大鼠星形胶质细胞，通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）抗体免疫荧光染色对其进行鉴定。实验分为对照组和损伤组，损伤组为应用细胞损伤仪损伤后6h的星形胶质细胞，对照组不予损伤。应用原子力显微镜在液相下测试各组细胞的弹性模量，并对两组结果进行比较、分析。结果大鼠星形胶质细胞纯化率达95%以上。损伤后6 h的星形胶质细胞形态紊乱，部分细胞胞体可见肿胀。获得了星形胶质细胞的力学地形图和力压痕曲线。损伤组星形胶质细胞弹性模量较对照组显著增加[（1689±693）Pa vs.（724±283）Pa，P＜0.01]。结论损伤刺激会造成星形胶质细胞弹性模量增大，为进一步从细胞水平了解创伤性脑损伤后的颅内物理微环境提供理论基础。
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用原子力显微镜检验渗出液细胞
显微镜是临床检验中不可缺少的工具,电子显微镜发明以后,使临床检验上升到了一个新的高度.比如用电镜检验头发以诊断微量元素情况等,但由于一般扫描电镜和透射电镜样品制备复杂且需要真空条件,所以至今没有广泛应用于临床常规检验.
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通过原子力显微镜观察内皮细胞不同阶段纳米结构的变化及异常黑胆质成熟剂疗法对“退行性”硬化性主动脉瓣膜病的影响
主动脉瓣膜钙化可引起主动脉瓣狭窄、关闭不全等疾病，导致老年退行性瓣膜病的重要病理改变。西方国家整体人群中发病率达2．5％，严重危害患者生命安全，造成沉重的社会负担。由于除手术外缺乏有效的治疗手段，因此探讨主动脉瓣瓣膜钙化的机制，研究阻断其病理过程进展的可能性已经成为近年来心脏外科医师关注的热点之一[1]。
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兔跟腱基质中胶原纤维和蛋白多糖结构的原子力显微镜观察
目的:探讨肌腱基质中的胶原纤维和蛋白多糖之间的结构关系,明确肌腱的功能、结构基础.方法:实验于2004-03/05在解放军第一五○医院全军军事训练医学研究所完成.6只5月龄的雄性新西兰大白兔,跑台慢速跑步训练8周后,完整切取的双侧跟腱,立即冷冻切片、乙醇梯度脱水,风干后用原子力显微镜观察.结果:在原子力显微镜下,可以清晰看到平行排列的胶原纤维和D带结构;当扫描范围是500 nm×500 nm时,在相位像上可广泛见到带状物质在胶原纤维内、间编织排列,与胶原纤维形成多维网状结构;这种物质可能是蛋白多糖的侧链.结论:胶原纤维和蛋白多糖之间存在复杂的编织排列,这可能是肌腱的功能、结构基础;而原子力显微镜是观察这种结构的良好方法.
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胚脑来源与骨髓来源神经干细胞的比较:应用原子力显微镜的观察
目的:应用原子力显微镜(atomic force microscopy,AFM)观测胚鼠前脑来源的神经干细胞及成鼠骨髓诱导来源的神经干细胞表面的形貌结构,并比较两者的异同.方法:实验于2003-09/2004-09在南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所完成.分别取怀孕10.5～14.5 d胚鼠行前脑来源神经干细胞和成鼠骨髓来源神经干细胞培养,神经干细胞培养基、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF,20 μg/L)维甲酸(300 μg/L)持续诱导培养10 d,以平板克隆法测定两种来源干细胞的克隆形成率,光学显微镜和原子力显微镜分别进行观测.结果:光学显微镜下两种来源的神经干细胞均表现为大圆形细胞,直径6～12 μm,细胞形貌相似;但神经来源神经干细胞显示更强的增殖能力,其细胞克隆形成率显著大于骨髓来源神经干细胞(x2=4.444,P＜0.05);原子力显微镜下可观测到神经来源干细胞表面有较多颗粒样隆起,其表面粗糙,平均粗糙度为(18.5±2.0)nm,均方根粗糙度为(20.7±2.5)nm,而骨髓来源神经干细胞表面相对光滑,其表面平均粗糙度为(10.2±1.2)nm,均方根粗糙度为(12.9±1.3)nm,两者经t检验统计分析差异有非常显著性意义(P＜0.01).结论:神经来源神经干细胞较骨髓来源神经干细胞表面有更多颗粒样隆起,表面更粗糙,可能与其有更强的增殖能力有关.
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虎眼万年青多糖的原子力显微镜观察
目的:研究虎眼万年青多糖的微观形貌.方法:采用原子力显微镜(AFM)观察虎眼万年青多糖的微观形貌.结果:虎眼万年青多糖的单一多糖OCA-ba呈多股紧密并行螺旋形排列. 结论:利用AFM可以快速、直观地观察虎眼万年青多糖的微观形貌,推断这种现象是由于该多糖中所含糖醛酸发生糖链间氢键缔合所致.
