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携带靶向干扰小鼠早期生长反应基因1短发夹RNA的慢病毒载体转染小鼠视网膜的干扰效率研究
目的 构建携带绿色荧光蛋白(GFP)和靶向干扰早期生长反应基因1(Egr-1)短发夹RNA(shRNA)共表达的慢病毒载体,转染小鼠视网膜组织,观察其对Egr-1基因的干扰效率.方法 针对已经筛选确定的Egr-1基因shRNA有效靶序列,构建携带GFP和靶向干扰Egr-1 shRNA的慢病毒载体LV-shRNA(Egr-1).15日龄C57BL/6小鼠完全随机法分为实验组和阴性对照组,每组10只.LVshRNA(Egr-1)慢病毒载体经玻璃体腔注射转染至实验组小鼠右眼内,不针对任何特异基因的LV-NC 慢病毒载体通过同样的转染途径转染至阴性对照组小鼠右眼内,实验组及阴性对照组小鼠左眼不做任何处理设为空白对照组.2周后荧光显微镜下观察转染情况,实时定量PCR(RQ-PCR)、免疫印迹(Western blot)、免疫荧光检测Egr-1的表达,观察Egr-1基因的干扰效率.结果 慢病毒载体经玻璃体腔注射途径转染小鼠视网膜后,GFP广泛分布于视网膜全层,包括视网膜色素上皮层.与空白对照组和阴性对照组注射眼比较,RQ-PCR检测显示实验组注射眼Egr-1 mRNA表达明显下调(0.290+0.074比1.006±0.033、1.010±0.086,均P＜0.001),抑制率为71.29%;免疫印迹显示实验组注射眼内Egr-1蛋白表达明显下调(0.224±0.035比0.674±0.050、0.688±0.049,P＜0.001),抑制率为67.44%.免疫荧光检测发现实验组注射眼在视网膜除内核层有少许Egr-1阳性细胞分布外,没有荧光表达.结论 成功构建携带绿色荧光蛋白和靶向干扰Egr-1基因shRNA的慢病毒载体,经玻璃体腔注射转染小鼠眼内其转染效率高,分布范围广,且对小鼠视网膜Egr-1基因抑制效率高.
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EGR1对HTLV-1病毒感染后宿主细胞自噬的影响
目的 探讨早期生长反应基因1(EGR1)对成人T淋巴细胞白血病病毒1型(HTLV-1)感染后宿主细胞自噬的影响.方法 获得病毒早期感染模型,免疫印迹检测病毒核心蛋白p19、宿主细胞EGR1的表达;荧光素酶报告基因检测EGR1的5′端调控序列转录活性;筛选有效的EGR1 siRNA,将EGR1 siRNA转染HeLa细胞,随后HTLV-1病毒阳性细胞系MT2与HeLa细胞进行共培养,免疫印迹检测病毒核心蛋白p19、EGR1、自噬相关蛋白LC3;real-time PCR检测病毒载量;免疫荧光检测自噬体数目.结果 共培养后,宿主细胞EGR1蛋白表达和调控序列荧光素酶活性逐渐增强,且EGR1蛋白的表达与细胞自噬水平呈现正相关;筛选了有效的EGR1 siRNA,命名为siE2;共培养模型干扰EGR1的表达后,病毒核酸载量、核心蛋白p19的表达以及自噬相关蛋白LC3B/LC3A比例均下调,同时伴有胞内自噬体数目的减少(P<0.01).结论 EGR1与HTLV-1感染后宿主细胞自噬水平和病毒复制密切相关.
关键词： 早期生长反应基因1 成人T淋巴细胞白血病病毒1型 细胞自噬 病毒复制 -
反义寡核苷酸抑制早期生长反应基因1表达对移植静脉内膜增生的影响
目的 研究反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)抑制早期生长反应基因1(early growth response gene-1,Egr-1)表达对移植静脉血管平滑肌细胞增殖和内膜增生的影响.方法构建Egr-1 ASODN,建立自体静脉移植模型,Egr-1 ASODN转染移植静脉,术后随机分为1、2、6、24 h,3、7、14、28、42 d组,以未应用Egr-1 ASODN的大鼠为对照组.荧光显微镜检测Egr-1 ASODN转染移植静脉情况;应用原位杂交和RT-PCR方法检测Egr-1 mRNA的表达;联合应用免疫组织化学方法和Western blot检测Egr-1蛋白表达情况.结果 实验组移植1 h,Egr-1 ASODN主要位于移植静脉的外膜、中膜和部分内皮细胞(荧光灰度值为67±11),移植2 h至24 h,Egr-1 ASODN则主要位于移植静脉的中膜,移植7 d,Egr-1 ASODN主要位于移植静脉的内膜.移植后期未检测到Egr-1 ASODN的表达.Egr-1 mRNA的表达只呈现一个高峰(基因表达值1.8±0.5).移植早期Egr-1蛋白表达主要位于中膜的VSMC、部分单核细胞和内皮细胞,而移植后期在中膜和新生内膜的VSMC都未检测到Egr-1蛋白的表达.与对照组相比VSMC的增殖程度和内膜厚度均明显减轻(P＜0.01).结论 Egr-1 ASODN可显著抑制移植静脉的内膜增生,其作用可能是通过抑制Egr-1基因及其蛋白产物表达,从而抑制VSMC增殖、促进其凋亡而实现的.
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早期生长反应基因1敲除对肝癌组织基因表达谱的影响
目的:对比观察早期生长反应基因1(EGR-1)敲除大鼠与野生大鼠肝癌模型基因表达谱的变化,探讨EGR-1基因是否参与调控肝癌的生长与转移.方法:应用cDNA表达芯片对EGR-1基因敲除大鼠和野生大鼠肝癌模型的癌标本组织抽提的mRNA进行芯片杂交,并对两者的基因表达谱进行对比分析.将同一基因在一个模型中的表达高于另一个模型的3倍以上作为基因差异表达的判断标准.结果:野生大鼠肝癌模型与EGR-1敲除大鼠肝癌模型相比较,前者有25条已知基因和2条未知基因表达上调,而后者有41条已知基因和23条未知基因表达上调;其中包括与细胞增殖和肿瘤转移相关的重要基因.结论:EGR-1基因敲除可引起大鼠肝癌模型基因表达谱的明显变化;EGR-1很可能参与了肝癌细胞生长与转移的调控.
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早期生长反应基因1在急性胰腺炎肝脏损害机制中的作用
目的 研究早期生长反应基因1(Egr-1)在急性胰腺炎肝脏损害机制中的作用.方法 24只雄性Wistar大鼠随机分为4组,分别用生理盐水,1%、3%及5%牛磺胆酸钠溶液进行相应处理,观察各组大鼠肝组织Egr-1免疫组化染色结果并进行胰腺病理评分,检测血清AST、LDH及TNF-α和IL-1β水平.从正常Wistar大鼠分离培养肝细胞,观察原代培养肝细胞在TNF-α刺激及PD98059预处理后Egr-1 mRNA表达情况.结果 肝组织Egr-1表达与急性胰腺炎肝损害程度呈正相关,且原代培养肝细胞Egr-1 mRNA表达水平与肝细胞损害程度呈正相关.结论 Egr-1可能参与急性胰腺炎肝损害过程,并且其作用机制部分依赖于细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2).
关键词： 早期生长反应基因1 胰腺炎 肝损害 有丝分裂素激活蛋白激酶类 -
早期生长反应基因1对巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α的影响
背景: 体内外研究已证实肺巨噬细胞合成和分泌肿瘤坏死因子α等参与肺组织局部损伤和炎症反应,但具体发生机制仍不明确.目的: 观察核转录因子早期生长反应基因1对巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α的影响.设计、时间及地点: 随机分组设计,于2004-06/2006-12在湘雅医学院病理学系完成.材料: 标准石英粉尘(SiO2)为Sigma公司产品;早期生长反应基因1抗体为Santa Cruz公司产品;小鼠巨噬细胞系RAW264.7购自中科院上海生物细胞研究所细胞库.方法: 实验将巨噬细胞分为正常对照组、二氧化硅刺激组、Egr-1+二氧化硅组和IgG+二氧化硅组,前两组加无血清培养基,后两组分别加入5,10,20 mg/L不同浓度的Egr-1和IgG抗体干预.主要观察指标: 酶联免疫吸附实验检测各组细胞上清中肿瘤坏死因子α蛋白的水平;反转录-聚合酶链反应检测细胞内肿瘤坏死因予α mRNA的表达.结果: ①与二氧化硅刺激组相比,不同浓度Egr-1+二氧化硅组细胞上清中肿瘤坏死因子α蛋白水平均下降(P<0.01),且10mg/L组与5,20mg/L组相比,差异有显著性意义(P<0.05).不同浓度IgG+二氧化硅组相比,上清液中肿瘤坏死因子α蛋白水平差异无显著性意义(F=1.008,P=0.438).②-二氧化硅刺激组肿瘤坏死因子α mRNA表达高于正常对照组(P<0.01),而Egr-1+二氧化硅组mRNA表达低于二氧化硅刺激组和IgG+二氧化硅组(P<0.01).结论: 二氧化硅致巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子α增加可能通过激活核转录因子早期生长反应基因1介导的信号通路而实现.
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自体移植静脉中早期生长反应基因1的表达及意义
目的:研究自体静脉移植后早期生长反应基因1(Egr-1)表达的动态变化,探讨其在内膜增生(IH)中的作用.方法:Wistar大鼠80只,建立自体静脉移植模型.应用原位杂交和RT-PCR方法检测Egr-1 mtRNA的表达,应用Western蛋白印迹和免疫组化方法检测Egr-1蛋白表达情况,同时进行组织形态学研究.结果:自体静脉移植后,Egr-1mRNA和Egr-1蛋白的表达具有双相变化.移植1 h,Egr-1 mRNA阳性率为(35±7)%,6 h和24h时下降,7 d时重新升高,4周达高峰(45±6)%.移植早期2 h即有Egr-1蛋白的表达,阳性率为(30±5)%,并持续至6h,24 h～3 d表达下降,移植4周Egr-1蛋白的阳性表达率达到高峰(40±9)%.结论:Egr-1的激活及表达与自体移植静脉内膜增生关系密切,Egr-1可能成为防治移植静脉内膜增生及狭窄、闭塞的一个新的干预靶点.
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pGL3/EGR1-Bax重组载体的构建及对非小细胞肺癌细胞的转染
目的 构建早期生长反应基因1(EGR1)启动子与Bax基因共表达载体pGL3/EGR1-Bax并转染非小细胞肺癌细胞.方法 以小鼠脑组织基因组DNA为模板,采用PCR法分别扩增EGR1和Bax基因全长编码序列,分别克隆入载体pTA2,构建重组质粒pTA2/EGR1和pTA2/Bax,测序鉴定；再将EGR1与Bax基因亚克隆至pGL3-Basic载体中,构建双基因共表达载体pGL3/EGR1-Bax,测序鉴定.采用基因转染技术将基因导入非小细胞肺癌NCI-H460细胞,分别以未转染及空pGL3-Basic载体转染的NCI-H460细胞株作为空白对照组和阴性对照组,采用RT-PCR技术和Western blotting方法检测NCI-H460细胞EGR1和BaxmRNA和蛋白的表达.结果 测序鉴定证实,构建的双基因共表达载体pGL3/EGR1-Bax的EGR1、Bax序列与GenBank发布基因序列完全一致.与对照组和空载体转染组NCI-H460细胞比较,pGL3/EGR1-Bax转染组NCI-H460细胞中EGR1和Bax的mRNA表达以及Bax的蛋白表达明显增强.结论 成功构建双基因共表达载体pGL3/EGR1-Bax,并实现了EGR1和Bax基因在NCI-H460细胞中的有效表达.
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诱导pIRES-Egr1-EGFP-Omi/HtrA2的表达对人眼脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1凋亡的影响
目的 诱导pIRES-Egr1-EGFP-Omi/HtrA2质粒在人眼脉络膜黑色素瘤细胞OCM-1的表达,观察其对OCM-1细胞凋亡的影响.方法 设计合成pIRES-Egr1-EGFP及pIRES-Egr1-EGFP-Omi/HtrA2质粒,用LipofectamineTM2000脂质体法分别转染入OCM-1细胞,50 μmol/L双氧水干预转染细胞后,荧光显微镜观察两组细胞转染表达效率.Western blot检测质粒表达后Omi/HtrA2以及X连锁凋亡抑制蛋白(XIAP)的蛋白,流式细胞仪和噻唑蓝(MTT)法检测细胞捌亡.结果 构建的两组质粒分别转染入OCM-1细胞,转染pIRES-Egr1-EGFP组和pIRES-Egr1-EGFP-Omi/HtrA2组细胞在双氧水干预后表达绿色荧光细胞数均较干预前增加(P＜0.05),分别为78.9±7.8和80.3±3.2 pIRES-Egr1-EGFP-Omi/HtrA2组细胞在双氧水干预后,Omi/HtrA2和XIAP蛋白的表达分别较诱导前增加53.5％和降低31.9％,差异有统计学意义(P＜0.01)；细胞凋亡率显著增加,细胞凋亡数增加到[(8.19±2 13)％,P＜0.01].结论 双氧水能有效的启动pIRES-Egr1-EGFP-Omi/HtrA2质粒并诱导其下游的基因表达,引起细胞的凋亡增加,其机制与Omi/HtrA2以及XIAP蛋白表达变化相关.
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女贞子抗CCl4致小鼠肝损伤的作用机制研究
目的 观察女贞子抗CCl4致小鼠肝损伤的作用,并探讨其可能的作用机制.方法 将昆明种小鼠随机分为模型组、女贞子水提物组和齐墩果酸组,分别预防性给予各组小鼠相应药物4d后,ip给予各组小鼠CCl4造模,处死小鼠后,计算肝脏指数和测定血清丙氨酸转氨酶(ALT)的含量;用实时荧光定量PCR法检测肝脏早期生长反应基因1(EGR-1)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP-2)和角化细胞源性趋化因子(KC) mRNA的表达.结果 与模型组比较,女贞子水提物能显著降低小鼠血清中ALT的含量,使肝脏炎症反应基因EGR-1、MIP-2和KC mRNA的表达显著降低.结论 女贞子抗CCl4致小鼠肝损伤的作用机制可能与抑制肝脏炎症反应基因的表达有关.
