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反义寡聚核苷酸对CVB3蛋白基因表达的抑制作用及量效关系的研究
目的观察病毒基因组5′端非编码区内与翻译起始有关的位点和结构蛋白编码区的特异性反义核酸对病毒蛋白表达的影响及其量效关系.方法应用病毒致细胞病变作用保护实验、空斑形成实验和空斑形成减少实验、Western blot实验等方法,观察特定的反义核酸抑制病毒感染的效果.结果针对IRES位点、AUG区域和VP1区的3条反义核酸Scb561、Scb733、scb2785,对病毒感染有明显的抑制作用.病毒的感染量为0.01 MOI时,3种反义核酸在5μmol/L时对病毒的抑制率均在90%以上,当病毒增加到10 MOI时,抑制率仍在50%以上.Scb561和Scb733可明显的抑制病毒基因表达,当Scb561的浓度在0.625μmol/L时感染后的细胞内病毒蛋白量明显减少,增加到2.5μmol/L时病毒蛋白表达几乎看不到.另外Scb561、Scb733剂量与抗病毒效果呈现正相关关系.随着Scb561和Scb733浓度的增加,其抗病毒活性也随之增加直到抑制率达到90%以上,有效剂量在0.6～5μmol/L之间,且对细胞无毒性作用.非特异寡聚核苷酸对照实验显示,5μmol/L浓度时对病毒感染无明显抑制作用.结论针对核糖体进入位点和翻译起始位点的反义核酸,有明显的特异性抑制病毒基因表达的作用.为反义寡聚核苷酸成为一个潜在的治疗病毒感染的药物提供了重要的研究基础.
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反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌抑制作用的研究
目的 研究反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌牛长的抑制作用,探讨其潜在的抗结核作用.方法 在7H9培养基中接种5×10~5 CFU耻垢分枝杆菌MC~2155,同时加入20μmol/L针对结核分枝杆菌中必须基因Rv3806c在耻垢分枝杆菌中的同源基因MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸.以耻垢分枝杆菌MC~2155单独培养作为对照.观察和绘制细菌生长曲线;测定细胞膜MSMEG_6401编码的磷酸核糖转移酶的生物活性;应用高压气相色谱测定耻垢分枝杆菌细胞壁中糖的含量.结果 anti-ODNs作用6 d后的耻垢分枝杆菌平均吸光度值(A值)为0.84±0.09;而野生型耻垢分枝杆菌平均,4值为1.27±0.01,试验组耻垢分枝杆菌较对照组增殖速度平均降低0.45(P<0.01);anti-ODNs作用6 d后耻垢分枝杆菌平均CFU计数的对数值为8.27±0.19;而野生型耻垢分枝杆菌平均CFU对数值为8.89±0.14,试验组耻垢分枝杆菌较对照组增殖速度平均降低0.62个log单位;在应用等量的膜蛋白的情况下,实验组磷酸核糖转移酶的生物活性降低约40%;试验组和对照组细菌反映细胞壁糖含量的指标甘露糖-半乳糖/阿拉伯糖比值没有明显差异(2组实验组分别为0.63和0.69;2组对照组分别为0.67和0.69).结论 针对MSMEG_6401的反义寡脱氧核苷酸对耻垢分枝杆菌的增殖有一定程度的抑制作用,推测反义寡脱氧核苷酸技术有一定抗结核价值;结核分枝杆菌的Rv3806c基因或是其编码产物可能是一个好的抗结核药物作用靶位.
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CpG 寡脱氧核苷酸增强小鼠抗结核分枝杆菌感染的作用与机制
目的观察CpG 寡脱氧核苷酸(ODN)对结核分枝杆菌感染小鼠的保护作用及其机制.方法将96只雌性BALB/c小鼠按随机数字表法分为4组,每组24只,分别为CpG ODN免疫组(A组)、对照ODN免疫组(B组)、感染对照组(C组)和正常对照组(D组).A组和B组小鼠于攻毒前2周腹腔注射CpG ODN和对照ODN(30 μg/只).A 、B、C 3组小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌(H37Rv ,1×106条/只).攻毒后3周,每组处死12只小鼠,观察肺脾组织病理学变化,检测肺脾组织Toll样受体9(TLR9)mRNA、γ干扰素(IFN-γ)mRNA、白细胞介素(IL)-4 mRNA、IL-10 mRNA和IL-6 mRNA表达以及肺和脾组织菌落计数.同时观察4组小鼠生存率.结果 CpG ODN能够提高结核分枝杆菌感染小鼠的生存率.A组[(20.37±1.12)g]小鼠体重高于B组[(17.50±0.62)g]和C组[(17.15±0.97)g, P均<0.01];A组小鼠肺湿重[(0.25±0.02)g]与B组[(0.27±0.34) g,P>0.05]相似,但低于C组[(0.28±0.26) g,P<0.01];A组小鼠脾湿重[(0.63±0.37)g]高于B组[(0.39±0.05)g]和C组[(0.38±0.02) g, P均<0.01].A组小鼠肺部炎症较B组和C组小鼠为轻.A组小鼠肺脏和脾脏组织匀浆未见结核分枝杆菌菌落生长.A组小鼠肺、脾组织TLR9 mRNA表达(分别为0.61±0.29和0.72±0.48)与B组(分别为0.58±0.35和0.64±0.28)和C组(分别为0.60±0.32和0.65±0.31)相似(P>0.05),但高于D组(分别为0.11±0.08和0.26±0.22,P<0.01),CpG ODN对TLR9 mRNA的表达无影响.A组小鼠肺、脾组织IFN-γ mRNA表达(分别为0.44±0.07和0.76±0.09)高于B组(分别为0.19±0.05和0.22±0.05)和C组(分别为0.16±0.04和0.18±0.08,P均<0.01).A组小鼠肺、脾组织IL-6 mRNA的表达(分别为1.56±0.29和8.21±0.82)高于B组(分别为0.86±0.55和0.16±0.09)和C组(分别为0.78±0.21和0.06±0.04,P均<0.01).A组小鼠肺、脾组织IL-4 mRNA的表达(分别为0.18±0.05和0.06±0.02)低于B组(分别为0.31±0.06和1.22±0.01)和C组(0.35±0.04,1.31±0.31,P均<0.01).A、B、C 3组小鼠肺组织IL-10 mRNA的表达分别为0.28±0.06、0.26±0.04、0.28±0.05,差异无统计学意义(P>0.05);A组脾组织IL-10 mRNA的表达(0.05±0.02)低于B组(0.57±0.09)和C组(0.65±0.15,P均<0.01).结论 CpG ODN可促进Th1型免疫反应,抑制Th2型免疫反应,增强小鼠抵抗结核分枝菌感染的能力.
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CpG寡脱氧核苷酸促进小鼠清除体内结核分枝杆菌的机制
目的 探讨CpG寡脱氧核苷酸(CpG-ODN)增强小鼠体内结核分枝杆菌清除能力的可能机制.方法 将雌性BALB/c小鼠随机分为免疫组36只和对照组24只,并分别腹腔注射CpG-ODN 30 μg(溶于200 μl生理盐水)和200 μl生理盐水.2周后每只小鼠经尾静脉注射结核分枝杆菌H37Rv 1×106 CFU.感染后3周和4周每组分别处死12只小鼠,免疫组小鼠饲养至感染后6周处死.肺和脾组织进行菌落计数,观察肺和脾组织的病理学变化.用实时定量聚合酶链反应方法检测肺和脾组织γ-干扰素、白细胞介素(IL)-4、IL-10、IL-12、IL-18和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)mRNA表达的相对含量.组间比较采用t检验.结果 感染后3周,免疫组小鼠的肺和脾组织经培养后无结核分枝杆菌生长.感染后4周,免疫组小鼠的肺和脾组织培养后有结核分枝杆菌生长,但明显少于对照组;肺组织中IL-18、γ-干扰素和iNOS的mRNA表达的相对含量分别为(3.6±0.5、0.32±0.14和23.2±4.7),均明显高于对照组的(1.6±1.1、0.20±0.10和16.2±5.1),IL-12p40 mRNA表达的相对含量(5.7±0.6)明显低于对照组(14.5±1.9),IL-4和IL-10 mRNA表达的相对含量(0.30±0.09和0.28±0.05)与对照组(0.26±0.05和0.29±0.08)无明显差别;脾组织中IL-18、γ-干扰素和iNOS mRNA表达的相对含量(5.5±1.3、0.52±0.07和9.1±1.8)明显高于对照组(0.8±0.4、0.21±0.06和6.0±1.4),IL-12p40、IL-4和IL-10 mRNA表达的相对含量(2.1±0.3、0.23 ±0.10和0.10±0.04)明显低于对照组(5.1±0.4、1.21±0.26和0.57±0.13).与感染后4周比较,免疫组小鼠感染后6周,肺组织γ-干扰素mRNA表达的相对含量(0.95±0.27)明显增高,IL-18、IL-4和IL-10 mRNA表达的相对含量(3.51±0.86、0.45±0.35和0.24±0.21)无明显变化,IL-12p40和iNOS mRNA表达的相对含量(1.72±1.41和1.1±0.5)明显降低;脾组织IL-12p40和IL-18 mRNA表达的相对含量(0.08±0.02)和(0.11±0.03)明显降低,IL-10 mRNA表达的相对含量(0.39±0.11)明显增高,γ-干扰素、IL-4和iNOS mRNA表达的相对含量(0.63±0.32、0.30±0.16和8.4±2.7)无明显变化.结论 CpG-ODN增强小鼠清除体内结核分枝杆菌的能力与IL-18、γ-干扰素和iNOS的表达增强及IL-4和IL-10的表达抑制密切相关.
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反义寡核苷酸抑制早期生长反应基因1表达对移植静脉内膜增生的影响
目的 研究反义寡脱氧核苷酸(antisense oligodeoxynucleotides,ASODN)抑制早期生长反应基因1(early growth response gene-1,Egr-1)表达对移植静脉血管平滑肌细胞增殖和内膜增生的影响.方法构建Egr-1 ASODN,建立自体静脉移植模型,Egr-1 ASODN转染移植静脉,术后随机分为1、2、6、24 h,3、7、14、28、42 d组,以未应用Egr-1 ASODN的大鼠为对照组.荧光显微镜检测Egr-1 ASODN转染移植静脉情况;应用原位杂交和RT-PCR方法检测Egr-1 mRNA的表达;联合应用免疫组织化学方法和Western blot检测Egr-1蛋白表达情况.结果 实验组移植1 h,Egr-1 ASODN主要位于移植静脉的外膜、中膜和部分内皮细胞(荧光灰度值为67±11),移植2 h至24 h,Egr-1 ASODN则主要位于移植静脉的中膜,移植7 d,Egr-1 ASODN主要位于移植静脉的内膜.移植后期未检测到Egr-1 ASODN的表达.Egr-1 mRNA的表达只呈现一个高峰(基因表达值1.8±0.5).移植早期Egr-1蛋白表达主要位于中膜的VSMC、部分单核细胞和内皮细胞,而移植后期在中膜和新生内膜的VSMC都未检测到Egr-1蛋白的表达.与对照组相比VSMC的增殖程度和内膜厚度均明显减轻(P＜0.01).结论 Egr-1 ASODN可显著抑制移植静脉的内膜增生,其作用可能是通过抑制Egr-1基因及其蛋白产物表达,从而抑制VSMC增殖、促进其凋亡而实现的.
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乙酰肝素酶反义寡核苷酸对Hep-2细胞侵袭力抑制的研究
目的 探讨乙酰肝素酶(heparitinase,HPSE)反义寡核苷酸(antisense oligodexyribonucleotides,AS-ODN)对Hep-2细胞HPSE mRNA、HPSE蛋白的表达及其侵袭力的活性抑制.方法 设计合成互补于HPSE mRNA起始密码区的HPSE AS-ODN,以阳离子脂质体Lipofectin包埋后转染人喉癌Hep-2细胞进行培养,采用流式细胞分析技术和逆转录一聚合酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测Hep-2细胞HPSE蛋白及其mRNA表达的变化;以Matrigel细胞侵袭试验分别对HPSE AS-ODN对Hep-2细胞侵袭力的抑制进行检测.结果 AS-ODN各组与正常对照组和脂质体组比较及AS-ODN各组间比较HPSE mRNA和HPSE蛋白的表达及细胞侵袭力均有明显抑制作用,差异有统计学意义(P<0.01);AS-ODN在终浓度为100、200、400 nmol/L时对Hep-2细胞侵袭力的抑制率分别为60.1%、80.8%and 94.0%.结论 HPSEASON通过下调HPSEmRNA和HPSE蛋白的表达可显著抑制Hep-2细胞的侵袭力并呈剂量依赖性.
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Toll样受体9配体CpG寡脱氧核苷酸鼻内预免疫对豚鼠鼻变态反应抑制作用的研究
目的 探讨Toll样受体9(toll like receptor 9,TLR9)配体CpG寡脱氧核苷酸(CpG oligodeoxynucleotides)鼻内预免疫对豚鼠变应性鼻炎(allergic rhinitis,AR)的抑制作用.方法 50只实验豚鼠采用随机数宁表法分为5组,每组10只,分别为:空白对照组(简称对照组)、AR模型组(AR组)、CpG组、CpG+卵清蛋白组(ovalbumin,OVA,CpG+OVA组)、CpG模拟序列+OVA组(CpG-M+OVA组).AR组及对照组给予生理盐水预免疫;CpG组给予5.2 μg CpG826;CpG+OVA组给予5.2μg CpG+4.8μg OVA;CpG-M+OVA组给予不具免疫活性的CpG1982加OVA滴鼻.4个实验组动物依次进行腹腔OVA和氢氧化铝凝胶基础致敏,2次鼻腔激发,对照组则给予生理盐水.观察鼻黏膜组织损伤情况及嗜酸粒细胞计数.酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清及鼻黏膜组织匀浆中白细胞介素(IL)5及γ干扰素(interferon γ,IFN-γ)的水平.免疫荧光(immunofluorescence,IF)观察细胞间黏附分子(intercellular adhesion molecule,ICAM)1在鼻黏膜上皮组织的表达.采用SPSS 11.0软件对数据进行分析.结果 CpG组动物的喷嚏,抓鼻症状要轻于AR组(Z值分别为3.412、3.523,P值均<0.05),CpG+OVA组症状轻于CpG-M+OVA组(Z值分别为3.984、4.452,P值均<0.05).CpG组豚鼠鼻黏膜组织嗜酸粒细胞平均((x)±s,下同)计数为(20.0±9.6)个,低于模型组的(53.5±19.8)个,CpG+OVA组豚鼠鼻黏膜组织嗜酸粒细胞计数为(9.5±5.7)个,低于CpG-M+OVA组的(49.2±18.9)个,差异有统计学意义(q值分别为3.785、4.576,P值均<0.05).ELISA结果显爪CpG组血清及鼻黏膜组织匀浆中IL-5水平低于AR组(q值分别为3.890、4.019,P值均<0.05),而CpG+OVA组低于CpG-M+OVA组(q值分别为4.128、4.245,P值均<0.05),而各组IFN-γ的水平差异尢统计学意义(F值分别为2.078、2.102,P值均>0.05).免疫荧光结果赤示CpG组鼻黏膜组织ICAM-1的表达水平要低于AR组,CpG+OVA组低于CpG-M+OVA组(Z值分别为3.697、3.765,P值均<0.05).结论 CpG寡脱氧核苷酸鼻内预免疫是一种行之有效的抑制鼻变态反应发生的方法.
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survivin反义寡核苷酸诱导淋巴瘤细胞凋亡及对化疗药的增敏作用
目的观察survivin反义寡核苷酸(ASODN)对淋巴瘤细胞的增殖、凋亡及对化疗药物敏感性的影响.方法人工合成survivin硫代ASODN,通过脂质体转染淋巴瘤细胞株Raji后,用MTT法检测细胞毒作用;用荧光染色、流式细胞术检测细胞凋亡;RT-PCR、Westem blot检测survivin mRNA及蛋白的表达.结果①survivin ASODN抑制Raji细胞增殖呈时间和剂量依赖性;②survivin ASODN处理组Raji细胞凋亡率为33.0%,正义寡核苷酸(SODN)组为11.5%,两组相比,差异有显著性(P＜0.05);③survivin ASODN处理组Raji细胞survivin蛋白及nRNA的表达水平显著下降;④survivin ASODN和Vm26联合处理组Raji细胞增殖受抑率为56.5%,显著高于单用survivin ASODN组的29.2%(P＜0.05)和单用Vm26处理组的26.9%(P＜0.05).结论 survivin ASODN能够抑制Raji细胞增殖、诱导凋亡,并能增加Raji细胞对化疗药物的敏感性,推测可能通过下调survivin mRNA及蛋白表达而起作用.
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生存素反义寡脱氧核苷酸对人胃癌细胞株凋亡的影响
生存素(survivin)是凋亡抑制蛋白(IAP)基因家族成员之一,在多数肿瘤组织中高表达.目的:观察生存素反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对人胃癌细胞株凋亡的影响.方法:将体外培养的人胃癌细胞株SGC-7901分为不同浓度生存素ASODN组、无关寡脱氧核苷酸(N-ODN)组和对照组.以四甲基偶氮唑蓝(MTT)试验检测生存素ASODN对SGC-7901细胞生长的影响;通过形态学观察、DNA电泳和流式细胞仪分析反映细胞凋亡情况;以端粒重复序列扩增-酶联免疫吸附测定(TRAP-ELISA)方法检测端粒酶活性.结果:生存素ASODN能抑制SGC-7901细胞生长,诱导细胞凋亡,抑制端粒酶活性.凋亡细胞形态学上表现为细胞膜起泡、染色质固缩、核碎裂、凋亡小体形成;DNA电泳呈现凋亡特征性阶梯状条带;流式细胞仪分析显示G1期前出现亚二倍体凋亡峰.结论:生存素ASODN能诱导人胃癌细胞株SGC-7901凋亡,抑制细胞生长及其端粒酶活性.
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含CpG基序的单链寡核苷酸增强感染人轮状病毒乳鼠的细胞免疫应答
目的 探讨含CpG基序的单链寡核苷酸(CpG ODN)干预对感染人轮状病毒(HRV)乳鼠细胞免疫应答的影响.方法 将40只ICR乳鼠随母鼠按窝随机均分为对照组、HRV感染组、CpG ODN预处理组和CpG ODN治疗组,每组10只.病毒攻击后第4天处死乳鼠,无菌取小肠、脾,对小肠组织按统一损伤标准评分,测定乳鼠脾脏指数,噻唑蓝(MTT)比色法检测脾淋巴细胞刺激指数,ELISA法检测脾淋巴细胞培养上清液中IFN-γ、IL-4的含量,流式细胞仪检测脾T淋巴细胞亚群.采用单因素方差分析比较各组数据.结果 HRV感染组、CpG ODN预处理组和CpG ODN治疗组肠黏膜损伤评分分别为4.00±1.31、2.75±1.28和2.87±0.99,各组间比较,差异有统计学意义(F=11.32,P＜0.01),与HRV感染组比较,CpG ODN预处理组、CpG ODN治疗组的小肠组织黏膜损伤评分显著降低,差异有统计学意义(P＜0.05).与对照组比较,HRV感染组脾淋巴细胞刺激指数、CD8+T淋巴细胞所占百分比升高,CD4+T淋巴细胞所占百分比、CD4+/CD8+降低,Th1细胞因子IFN-γ表达增强,CpG ODN预处理组、CpG ODN治疗组的脾脏指数、脾脏淋巴细胞刺激指数、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞所占百分比、IFN-γ均升高(P＜0.05);与HRV感染组比较.CpG ODN预处理组、CpG ODN治疗组的脾脏指数、脾脏淋巴细胞刺激指数、CD4+T淋巴细胞所占百分比、CD4+/CD8+和IFN-γ均升高(P＜0.05).结论 CpG ODN增强感染HRV乳鼠的细胞免疫应答,以Th1型细胞免疫应答为主.
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重组反义c-myc腺病毒抑制K562细胞生长、诱导凋亡的作用
目的:研究重组反义c-myc腺病毒(Ad-AS-c-myc)对人慢性粒细胞K562细胞系抑制生长,诱导凋亡作用及分子机制,探讨Ad-AS-c-myc用于慢性粒细胞白血病基因治疗的可能性.方法:采用重组腺病毒Lac-Z(Ad-LacZ)及Ad-AS-c-myc联合多聚季胺转染K562细胞,X-gal染色判断转染效率.采用形态学、MTT试验、RT-PCR、DNA凝胶电泳、流式细胞仪及免疫细胞化学等方法进行研究.结果:多聚阳离子可提高腺病毒载体对K562细胞的转染,Ad-LacZ十多聚季胺转染率达86%.Ad-AS-c-myc能抑制K562细胞c-myc基因在转录水平的表达,K562细胞生长受抑(抑制率38%);Ad-AS-c-myc可使K562细胞G1、G2期阻滞,增殖相关基因PCNA表达降低,Apo 2.7蛋白阳性细胞率增高,DNA电泳出现DNA梯形条带.结论:Ad AS-c-myc对K562细胞具有抑制生长及诱导凋亡作用,其生物学作用与K562细胞c-myc及PCNA的表达降低有关.Ad-AS-c-myc在慢性粒细胞白血病基因治疗中具有潜在的临床价值.
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脂质体包裹99Tcm-HYNIC-survivin ASODN中胞嘧啶含量对荷肝癌裸鼠显像的影响
目的 研究胞嘧啶(C)含量对反义探针肿瘤特异性聚集的影响,为佳反义显像碱基序列的筛选提供帮助.方法 以survivin为靶序列制备3种(A1、A2、A3)C含量不同(10％、20％、30％)的20个碱基单链ASODN,耦联HYNIC,经99 Tcm标记、Cellufine GH-25纯化、脂质体包裹后获得3种标记化合物.分别对荷肝癌裸鼠行反义显像,各组计量资料比较采用Kruskal-Wallis H检验.结果 注射后4h,3种标记化合物在荷肝癌裸鼠体内均表现为肝、肾高摄取.随着C含量升高,3种标记化合物的肾脏摄取依次升高,分别为(1.50±0.06)、(2.80±0.09)和(3.96±0.03) ％ID/g;肿瘤摄取依次降低,分别为(2.08±0.08)、(1.69±0.01)和(1.20±0.09) ％ID/g;体内显像的T/NT比值分别为4.49～4.93、4.12～4.21和3.35～ 3.85,差异有统计学意义(H=12.50,P＜0.05);生物分布的T/NT比值分别为4.08 ～ 4.94、4.02～4.18和3.66～3.85,差异有统计学意义(H=10.82,P＜0.05).结论 Survivin ASODN中的C含量越低,标记化合物的肾内滞留率越低,肿瘤特异性结合率越高,显像质量越好.
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氩氦冷冻联合非甲基化CpG-ODN对兔肝癌模型的抗肿瘤效应
目的 探讨氩氦冷冻治疗对肝癌转移的影响及继发免疫效应的抗肿瘤效果.方法 兔VX2肝肿瘤模型54只,30只随机分为A、B和C组,每组10只,分别给予氩氦冷冻、手术切除和假手术(对照组),观察肿瘤转移和生存期;另外24只,随机分成D、E和F组,每组8只,分别给予氩氦冷冻+CpG-ODN、氩氦冷冻和手术治疗,治疗后2周在兔大腿肌肉接种VX2瘤组织.结果 A组肝内转移率低于C组(P=0.003),A组肺转移时间比C组推迟;A组和B组相比,不促进肿瘤转移.再接种VX2瘤组织2周后D、E和F组瘤重分别为(0.425±0.327)g(n=6)、(0.704±0.325)g(n=8)和(1.119±0.261)g(n=7),D组与F组瘤重差异有显著性(P=0.003).结论 氩氦冷冻治疗肝肿瘤不促进转移,CpG-ODN能增强氩氦冷冻治疗后的抗肿瘤效果.
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IGF-IR反义硫代磷酸型寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡的病理学研究
目的:探讨IGF-IR基因的反义硫代磷酸型寡核苷酸对胶质瘤细胞的形态学影响.方法:根据IGF-IR cDNA序列设计正义、反义寡核苷酸片段,并对其部分碱基进行硫代磷酸修饰.体外培养的胶质瘤细胞分别经正义寡核苷酸和反义寡核苷酸处理,应用倒置显微镜活细胞观察、HE染色光镜观察、透射电镜及DNA琼脂糖凝胶电泳等方法研究IGF-IR反义硫代磷酸型寡核苷酸诱导胶质瘤细胞凋亡作用.结果:经反义寡核苷酸转染的胶质瘤细胞中,呈现典型的凋亡形态学改变.凋亡细胞早期表现为细胞体积、容量减少,染色质凝聚,继之染色质集聚于核膜下成新月状或块状;细胞核内染色质可完全固缩成团呈“黑洞”样或萎缩的核破裂形成一些较小的膜包绕的球体位于胞质内,后出泡形成凋亡小体.DNA琼脂糖凝胶电泳分析经反义寡核苷酸处理的胶质瘤细胞DNA降解片段,可见有明显的小分子量DNA梯状条带,而野生型和正义寡核苷酸处理的胶质瘤细胞未见DNA梯状条带.结论:IGF-IR所介导的分泌环路IGF-I/IGF-IR,在胶质瘤细胞增殖和维持恶性表型中起重要作用;IGF-IR反义硫代磷酸型寡核苷酸能诱导胶质瘤细胞凋亡.
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反义寡聚脱氧核苷酸体外对乙型肝炎病毒基因表达的抑制作用
目的探讨乙型肝炎病毒(HBV)C基因翻译起始区和C基因区反义寡聚脱氧核苷酸对HBV表达的序列性抑制作用.方法以乙型肝炎病毒基因组(HBV DNA)转染人肝癌细胞系HepG2而建立起来的转染细胞系2.2.15作为实验对象,设计了一系列互补于HBV mRNA编码核心蛋白基因区(C区)15聚反义硫代寡聚核苷酸(ASON),通过脂质体介导将这些合成的外源基因导入2.2.15细胞中,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测作用细胞培养上清液中乙型肝炎病毒E抗原(HBeAg)和乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)含量,提取细胞中的HBV DNA经PCR扩增后,用Southern blotting方法对PCR产物进行半定量分析.结果与HBV mRNA C基因起始区互补的反义硫代寡核苷酸序列特异性地抑制乙型肝炎病毒基因表达,而正义硫代寡核苷酸未见有抑制效应,与HBV mRNA C基因内部互补的序列很少或无抗病毒活性.ASON作用24 h后的细胞培养上清液及细胞内HBV DNA量比对照组明显减少.另外,ASON对细胞生长无毒性作用.结论反义硫代寡核苷酸能够在细胞水平有效地抑制乙型肝炎病毒基因的表达.
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联合应用反义bcl-2和反义IL-6寡核苷酸对小细胞肺癌细胞株NCI-H446的作用
目的观察联合应用反义bcl-2硫代磷酸寡脱氧核苷酸(bcl-2 AS-PS-ODN)和白细胞介素6(IL-6)AS-PS-ODN对小细胞肺癌细胞株NCI-H446增殖和活力的影响.方法以bcl-2 AS-PS-ODN和IL-6 AS-PS-ODN单独及联合作用于NCI-H446,经细胞克隆形成实验、细胞增殖实验观察其对细胞增殖和活力的影响,经细胞凋亡线粒体流式检测试剂盒检测细胞凋亡的变化,经半定量RT-PCR检测IL-6 mRNA表达水平的变化.结果细胞增殖曲线、细胞克隆形成实验及细胞凋亡实验显示联合用药能更强地抑制细胞活力,促进细胞凋亡.bcl-2 AS-PS-ODN单独作用时,IL-6 mRNA表达上升74.3%,IL-6 AS-PS-ODN单独作用以及与bcl-2 AS-PS-ODN联合作用时,IL-6分别下调67.7%和52.4%.结论联合用药较单独用药对NCI-H446细胞株显示出更好的抑制效果.
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bcl-2反义寡核苷酸对白血病细胞药物敏感性的影响
目的探讨bcl-2基因反义寡核苷酸(ASODN)对白血病细胞药物敏感性的影响.方法 MTT法测bcl-2 ASODN对U937细胞足叶乙甙(VP16)敏感性,计算细胞存活率,绘制剂量-效应曲线,直线回归求半数致死量IC50;DNA电泳、AO/EB荧光染色测定细胞凋亡率.结果 VP16与bcl-2 ASODN联合作用比单独用VP16或VP16与SODN细胞存活率显著减少.bcl-2 ASODN 作用后VP16对U937细胞的IC50由7.93 μoml/L降至2.67 μoml/L.与单独VP16作用组相比,bcl-2 ASODN与VP16联合作用后梯状DNA片段明显增加,细胞凋亡率增高.结论 bcl-2 ASODN能促进VP16诱导的白血病细胞凋亡,提高白血病细胞对VP16的敏感性.bcl-2反义寡核苷酸在克服化疗药物耐药性方面,具有良好的应用前景.
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rhTNF-α联合bcl-2反义寡核苷酸对急性髓细胞白血病细胞株HL-60增殖与凋亡的作用
目的探讨基因重组人类肿瘤坏死因子α(rhTNF-α)和bcl-2反义寡核苷酸(ASPO)对HL-60细胞增殖与凋亡的作用,进一步认识肿瘤坏死因子α(TNF-α)和bcl-2两者调控肿瘤细胞凋亡的作用及相互联系. 方法单独和联合应用rhTNF-α和bcl-2 ASPO处理HL-60细胞,通过MTT法检测HL-60细胞生长和存活特性变化;原位细胞凋亡检测和流式细胞技术检测细胞凋亡;应用RT-PCR、免疫组织化学检测癌基因bcl-2表达的改变. 结果 rhTNF-α和bcl-2 ASPO的联合应用明显增强对HL-60细胞的增殖抑制;细胞凋亡率明显升高;癌基因bcl-2在mRNA和蛋白表达明显下降. 结论 TNF和bcl-2 ASPO在诱导HL-60细胞凋亡中可能存在协同作用,为血液肿瘤的联合治疗提供了新的途径.
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反义核酸逆转Hep-2v细胞多药耐药的研究
目的:探讨克服肿瘤细胞的多药耐药(multidrug resistance,MDR)的有效方法.方法:用反义硫代磷酸寡聚脱氧核苷酸(asODN)对Hep-2v细胞进行多药耐药(MDR)逆转实验,(1)将Hep-2细胞经长春新碱(VCR)筛选建立Hep-2v耐药细胞株为靶细胞;(2)针对mdr1 mRNA序列计算机辅助设计人工合成两个15mer反义寡聚脱氧核苷酸序列:asODNⅠ、Ⅱ,以硫代法修饰,其中序列Ⅰ和Ⅱ的作用位点相邻接,互补位点为MDR-mRNA的330～359碱基;(3)MDR逆转实验:两个反义序列分别或联合作用于Hep-2v细胞,MTT法测定反义核酸作用前后VCR对Hep-2v细胞IC50,比较其细胞毒作用;用流式细胞仪(FCM)检测反义核酸作用后各实验组细胞表面糖蛋白P-170的阳性率;RT-PCR法检测mdr1 mRNA表达水平.结果:两个反义核酸均使Hep-2v细胞的P-170阳性率下降,mdr1 mRNA水平低调,VCR对Hep-2v的细胞毒作用IC50从900nmol/L降至＜200nmol/L.结论:两个反义核酸用于Hep-2v的MDR均获得明显的逆转效果,序列Ⅰ+Ⅱ联合作用的效果更强,表明两个序列可能有协同作用.
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转化生长因子-α表皮生长因子受体反义寡聚核苷酸抑制人大肠癌细胞增殖的研究
目的 探讨转化生长因子-α（TGF-α）、表皮生长因子受体（EGFR）反义寡脱氧核苷酸(ASODN)对人大肠癌细胞株HR8348的作用。 方法 将TGF-α、EGFR反义寡核苷酸经脂质体包裹后转染人大肠癌细胞（浓度均为10 μmol/L）。采用四唑蓝比色法（MTT法）、细胞周期分析、裸鼠体内接种等方法测定瘤细胞体内外增殖的变化。结果 TGF-α反义ODN、EGFR反义ODN均可明显抑制HR8348的增殖（抑制率分别为80.0%、82.5%），并使裸鼠体内成瘤率下降（均为20.0%；对照组为100.0%）。G0/G1期细胞数明显增多（分别为63.9%、67.1%；对照组为31.1%），S期细胞数相应减少（分别为35.6%、32.6%；对照组为53.9%）。结论 TGF-α反义ODN、EGFR反义ODN均能有效抑制大肠癌细胞的体内外生长增殖。
