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HIV-1中和抗体2G12真核表达载体的构建及活性检测
目的 构建HIV-1中和抗体全基因共表达真核质粒载体,观察其在293T细胞中的表达并检测其活性.方法 合成HIV-1中和抗体2G12轻链可变区(VL)和重链可变区(VH),与含人IgG轻、重链恒定区的载体分别连接,构建出完整的2G12轻链和重链的载体,通过PCR扩增与连接将2G12轻、重链全长构建到真核表达载体pVR中,同时将内部核糖体进入位点(Internal ribosome entry site,IRES)插入到此载体中构建双基因表达系统,重组质粒转染293T细胞进行瞬时表达,ELISA检测抗体表达效果,通过结合实验及中和实验检测细胞上清的结合活性和中和活性.结果 获得可表达人IgG的重组双基因真核表达载体,转染后上清的抗体表达量为6.43 μg/ml,并且抗体保留了原来的结合活性和中和活性.结论 所构建的载体可表达具有较好的结合活性和中和活性的抗体,本研究为真核表达载体表达人HIV中和抗体全基因方面提供了可选择的平台.
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DNA载体介导RNA干扰抑制LMP-1基因对鼻咽癌细胞转移能力的影响
目的 探讨应用DNA载体介导RNA干扰技术,抑制鼻咽癌细胞中EB病毒潜伏膜蛋白1(LMP-1)表达的可能性,观察LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞转移能力的影响.方法 将能转录出干扰RNA的DNA模板插入pAVU6+27质粒,构建能够介导RNA干扰的发夹状干扰RNA(shRNA)表达载体.采用磷酸钙共沉淀法,将质粒导入EB病毒(+)的鼻咽癌细胞C611,筛选LMP-1基因沉默的克隆,通过观察其贴壁生长能力、基底膜穿透能力和移动能力的变化,分析LMP-1基因沉默对鼻咽癌细胞转移能力的影响.结果 在shRNA表达载体有效转染的C611细胞中,LMP-1基因的表达受到稳定抑制.肿瘤细胞转移实验表明,LMP-1基因沉默的C611细胞,贴壁生长能力提高,基底膜穿透能力和细胞移动能力均明显下降.结论 shRNA表达载体能够在鼻咽癌细胞内介导RNA干扰,并获得对LMP-1基因稳定的抑制.LMP-1基因可能通过贴壁生长能力、基底膜穿透能力和细胞移动能力等,影响鼻咽癌细胞的转移.
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纳米羟基磷灰石的表面修饰及其与DNA结合的实验研究
目的 探讨纳米羟基磷灰石(nHAP)的表面修饰及其与DNA结合的可行性.方法 采用均相沉淀法制备nHAP;透射电镜观察纳米粒结构;经超声分散及碳酸钠预处理后,在pH值7.4的环境下应用多聚赖氨酸(PLL)修饰nHAP;对修饰前后的纳米粒行Zeta电位检测;采用离心后测上清DNA浓度检测PLL修饰后的nHAP(nHAP-PLL)结合DNA的能力;应用DNA抗核酸酶保护实验测定nHAP-PLL保护DNA的能力.结果 透射电镜下nHAP呈针状颗粒,粒径较均匀,约(15～20)nm×(60～80)nm左右,分散程度良好;nHAP的Zeta电位为(-42.4±7.5)mV,nHAP-PLL的Zeta电位为(8.5±1.5)mV,两组比较差异有统计学意义(P<0.01);DNA结合及抗核酸酶保护实验显示nHAP-PLL和DNA质量比达20:1时,nHAP-PLL可有效结合并保护相应DNA.结论 nHAP经PLL表面修饰后可成为一种有效的DNA结合载体.
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DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应检测
目的 观察构建的DNA载体介导的小干扰RNA Tet-on基因表达系统的调控效应.方法 构建DNA载体介导的小干扰RNA(siRNA)Tet-on表达载体,pDIRS4.1 siRNA.以增强绿色荧光蛋白(EGFP)基因和白细胞介素6(IL-6)基因为目的基因,应用脂质体介导的瞬时转染方法,分别将pDIRS4.1/EGFP siRNA载体和pEGFP-N3质粒、pDIRS4.1IL-6 siRNA载体和pIRESIL-6质粒共转染人成骨肉瘤细胞,加入系列浓度的四环素(Dox)后,观察其诱导效应.结果 pDIRS4.1 siRNA在人成骨肉瘤细胞中能够高效转染;随着Dox浓度升高,pDIRS4.1 siRNA载体在人成骨肉瘤细胞中对目的基因的沉默作用有较好的调控性,且目的基因的表达与Dox具有严格的剂量依赖关系,高浓度Dox时,IL-6表达水平降低约12倍.结论 该研究构建的以DNA载体介导的能够高效调控siRNA沉默基因效应的Tet-On基因表达系统,能够促进其在更多模型系统中进行基因功能研究的应用.
