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中药WCA对人胃癌细胞SGC-7901体内作用基因的筛选与验证
目的:探讨以四君子汤等健脾中药为基础的复方胃肠安(WCA)对胃癌细胞的体内作用分子机制.方法:采用人胃癌细胞SGC-7901裸小鼠皮下移植瘤模型系统评价WCA对胃癌细胞的体内抑瘤作用;链霉素抗生物素-过氧化酶法(SP法)检测增殖细胞核抗原PCNA表达,末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记(TUNEL法)检测凋亡指数以及SP法检测caspase-3的活化表达;cDNA array筛选出WCA组N. S.对照组差异表达2倍以上基因,Real-time Quantitative PCR验证与增殖、凋亡、分化及信号转导密切相关的19条基因的表达;SP法检测部分有差异表达的基因在细胞内的蛋白表达.结果:与对照组比较,WCA组对皮下移植瘤生长的平均抑制率为(44.32+5.67)%,3次实验WCA组的平均瘤重分别为(0.99±0.76),(1.02±0.16),(0.88±0.47)g,分别低于对照组的(1.93±0.58),(1.65±0.46),(1.63±0.52)g(P＜0.05);WCA组移植瘤PCNA阳性表达率(35.73±6.01)%、强阳性表达率(3.39±1.48)%和总阳性率(39.03±7.37)%均分别低于对照组的(53.48±9.34)%,(8.78±5.43)%,(62.26±13.80)%(P＜0.05);凋亡指数为(9.72±4.51)%高于对照组的(2.45%±1.37)%(TUNEL法);WCA组活化caspase-3表达阳性率为(5.20±2.26)%,较对照组的(2.82±1.84)%高(P=0.0367);与对照组比较,全基因表达谱芯片筛选出WCA组共45个2倍以上差异表达基因,其中上调表达24个,下调表达21个.35个已克隆基因,10个表达序列标签(expression sequence tag,EST);2-△△CT法对19条目标基因的表达量进行评估,与对照组比较,表达量显著差异4倍以上的有Stat3(2-△△CT=0.16),RIPX(2-△△CT=0.18),ROD1(2-△△CT=0.23),bcl-2(2-△△CT=0.10),均为下调表达作用;WCA组P-Stat3阳性表达率(35.93±12.67)%、强阳性表达率(3.64%±1.72)%和总阳性率(39.57±13.31)%均分别低于对照组的(56.49±9.34)%,(13.16±7.06)%,(69.65±10.80)%,差异有显著性;bcl-2蛋白阳性表达率(1.62±0.82)%低于对照组的(7.53±3.73)%(P＜0.05).结论:健脾中药复方WCA在体内可抑制胃癌细胞增殖,诱导凋亡;WCA对胃癌细胞SGC-7901在核酸层次上有影响作用的已知基因主要为Stat3,RIPX,ROD1,bcl-2,均为下调表达作用;在蛋白表达水平的作用机制与抑制磷酸化的Stat3,bcl-2蛋白在细胞内的表达,上调活化caspase-3的表达有关.
关键词： 胃癌 健脾中药 基因表达 cDNA微阵列 实时定量聚合酶链反应 -
应用cDNA微阵列技术研究EB病毒LMP1介导的鼻咽癌中转移相关基因的表达
探讨EB病毒基因组编码的癌蛋白LMP1对鼻咽癌细胞中转移相关基因表达的影响.采用蛋白质印迹法检测在强力霉素(Dox)诱导下,鼻咽癌细胞系pTet-on-LMP1 HNE2(L7细胞)中LMP1表达的时效和量效关系.应用cDNA微阵列技术建立诱导性LMP1介导鼻咽癌细胞中转移相关基因差异表达谱;运用RT-PCR验证cDNA微阵列筛选差异基因表达的可靠性.与LMP1不表达的L7细胞比较,LMP1高表达的L7细胞中7个基因的表达显著上调,12个基因的表达显著下调.随机选择其中4个基因进行RT-PCR,结果显示,这些基因表达阳性,且与微阵列中的变化趋势一致.LMP1可能通过激活和/或抑制一些转移相关基因的表达而参与鼻咽癌转移过程.
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cDNA微阵列技术比较胚胎大鼠脑和脊髓神经干细胞的基因差异表达
目的从分子水平探讨脑和脊髓来源的神经干细胞(NSCs)的生物学特性,并鉴定这两种来源的NSCs的分子表达差异.方法应用cDNA微阵列技术对脑和脊髓来源的NSCs的基因表达情况进行检测和比较,在成功分离、培养和鉴定脑和脊髓两种来源的NSCs的基础上,抽提细胞总RNA并纯化、定量,以32P逆转录标记合成cDNA探针.AltasTM cDNA Expression Array(Clontech Co)与探针杂交、洗膜后在磷屏上曝光并扫描成像,以Arrayvision5.1软件分析杂交结果.结果cDNA阵列膜上覆盖的1 176个基因中,绝大部分基因表达无明显差异,但也有14个基因在两种来源的NSCs中的表达有显著差异,其中8个在脑来源的NSCs中表达较高,6个在脊髓来源的NSCs中表达较显著.在两种来源的NSCs都明显表达的基因中,许多分子如P-选择素(P-selectin)、钙黏素(cadherin)、乙酰胆碱受体α、cyclins、某些转录因子和原癌基因等可能在NSCs的自我更新(增殖)、神经球形成和保持不分化状态中起重要作用.结论两种来源的NSCs的生物学特性基本相同,但也存在一定的差异.
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cDNA微阵列分析BALB/c小鼠肝脑组织中差异性表达基因的研究
目的 分析BALB/c小鼠肝、脑组织差异基因表达谱.方法 TRIZOL 法提取总RNA,反转录cDNA,采用36K小鼠全基因组寡核苷酸芯片,运用荧光双交换方法分析BALB/c小鼠肝脑组织中mRNA转录本含量.经芯片扫描、图像采集后,运用MAS2.0软件对差异基因进行基因功能分析(GO)和KEGG通路分类.结果 基因芯片结果表明与脑组织相比,在肝组织中共发现差异表达基因6 132个,其中包括上调基因2 974个,下调基因3 158个,GO分析上述差异表达基因主要涉及代谢、细胞信号转导、DNA结合与转录、细胞周期、细胞骨架、细胞粘附和发育等.KEGG信号通路分析显示:上调差异基因中71个通路的改变差异具有统计学意义(P<0.05),下调差异基因中有80个通路的改变差异具有统计学意义(P<0.05).结论 小鼠肝与脑组织基因表达谱的差异涉及多个基因表达调控途径,研究这些基因分子功能有助于深入了解各组织独特的功能表达系统.
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慢性髓系白血病不同病期基因表达谱研究
本研究旨在探讨慢性髓系白血病(chronic myeloid leukemia,CML)急变的分子机制.采用cDNA微重排方法对4例CML急变期、4例CML慢性期患者进行基因差异表达分析.结果显示,共筛选出至少在3张芯片有差异表达的基因74条,其中下调52条,上调22条;差异表达基因包括:细胞骨架/运动相关基因、信号传导相关基因、转录因子相关基因、免疫相关基因、代谢相关基因、细胞周期相关基因、原癌和抑癌基因、细胞受体相关基因、蛋白质翻译合成相关基因及功能未知的基因等.结论:急变是多基因异常相互作用的结果,其中功能异常的信号转导、细胞周期调控、细胞分化及免疫的相关基因可能是导致CML急变的关键基因.
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髓样细胞核分化抗原在强直性脊柱炎病人的表达
目的通过比较强直性脊柱炎(AS)患者和健康志愿者的基因表达谱,寻找与AS相关的新基因并探讨其在病因和发病机制中的意义. 方法用含588个基因的cDNA微阵列,检测AS和健康志愿者的外周血单个核细胞的基因表达谱,初步筛选出在AS中差异表达的基因,为了进一步验证cDNA微阵列差异表达基因结果,扩大各组病例数,再用RT-PCR技术同时检测、对比健康志愿者和AS患者外周血单个核细胞(PBMC)、关节液单个核细胞(SFMC)和关节滑膜细胞这些差异表达基因的变化. 结果和健康志愿者组的PBMC比较,AS病人骨髓样细胞核分化抗原(MNDA)、迁移抑制因子相关蛋白8(MRP8)和MRP14、粘附分子ICAM-1和integrin β1表达明显增高,其中MNDA和MRP8的变化相关系数为0.793.在AS的SFMC和关节滑膜细胞中,MNDA表达也显著增高(与健康志愿者组PBMC比较,P值分别为0.038和0.027);MNDA区别AS和健康志愿者的统计学鉴别准确率达1.AS病人在接受抗TNF-α单克隆抗体治疗3个月后,MNDA在关节滑膜细胞的表达水平显著下降(P=0.018). 结论 MNDA是AS发病过程中一个重要的并与单核/巨噬细胞致炎密切相关的免疫因子,其可能成为一种用于AS的诊断、治疗监控指标.
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酪丝缬肽对人肝癌细胞SMMC-7721血管生成相关基因表达谱的影响
目的:观察小分子三肽化合物酪丝缬hk(tyroscryatide,YSV)对人肝癌细胞系SMMC-7721的抑制作用,并分析YSV对肿瘤细胞血管生成相关基因表达的影响.方法:建立人肝癌细胞SMMC-7721的体外培养体系,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测YSV对体外培养的SMMC-7721的增殖抑制作用,应用功能分类基因芯片分析人肝癌细胞SMMC-7721经药物作用后血管生成相关基因表达的差异变化,同时应用RT-PCR方法验证相关基因的表达.结果:YSV能显著抑制人肝癌SMMC-7721的生长,10mg/L YSV作用72h对SMMC-7721的增殖抑制率为42.34%,与对照组比较有统计学意义(P＜0.05).在113个血管生成相关基因中,YSV组相比对照组,基因下调0.667倍以上的有7个.RT-PCR在基因水平上证实YSV能显著抑制血管内皮生长因子(VEGF)和白介素8(IL-8)的表达.结论:YSV在体外能够显著抑制人肝癌细胞SMMC-7721的生长,并能在基因水平上下调肿瘤细胞血管生成相关因子的表达.
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HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列的电子延伸及验证
目的:研究痢疾杆菌福氏2a入侵前和入侵后3 h的人上皮细胞差异表达的新基因.方法:采用增毒的痢疾杆菌福氏2a 2457T侵袭HeLa细胞,检查HeLa细胞中细菌的数量并用RT-PCR方法从HeLa细胞中提取总RNA,制备探针.采用含有约3000个代表新基因的芯片进行芯片杂交,分析杂交结果.将所获得的新的156条EST序列为种子序列用cDNA微阵列实验,以人类EST数据库为基础库,应用SiClone软件进行EST拼接、校对并尽可能延长获得大片段或全长cDNA.选取基因组未注释的编码区序列作为新基因进行RT-PCR实验验证.结果:共鉴定到≥3倍或≤0.33的差异表达的代表新基因的EST序列45条,其中25个延伸序列鉴定为与重要的肠道功能相关的已知基因,并有3个在痢疾杆菌侵袭期间高表达的存在显著差异的新EST序列,他们分别名为:NPCCKHl2、ADBCSB02和HTBAMG05,这3个基因是新的人基因或假基因.结论:鉴定出了在HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列,为进一步研究痢疾杆菌与寄主相互作用奠定了基础.
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基因芯片技术和前列腺癌分子标志物的新发现(文献综述)
前列腺癌的高发生率要求发展新的诊断和治疗策略.近年来,DNA微阵列技术的开发和应用标志着生命科学研究领域的一次变革,它有望彻底揭示肿瘤进展过程中的基因调节机制.这对于肿瘤诊断准确性的提高、开发作用于致病基因的分子药物从而对肿瘤进行精确治疗,具有极其重大的意义.本文对DNA微阵列技术的原理、在肿瘤研究特别是在前列腺癌研究领域中的应用做一简要介绍,以加深对这些生命科学热点问题的认识.
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肝癌转移复发的分子机制与预测:从组学研究到临床应用
肿瘤转移是一个涉及癌细胞本身、癌细胞与癌周微环境及宿主免疫状态的相互作用等的复杂过程,许多因素参与调节.既往的单因素研究难以反映转移过程的本质,难以准确预测临床过程.人类基因组计划的顺利实施,比较基因组杂交( comparative genomic hybridization,CGH)、基因作图、cDNA微阵列等高通量新技术的发展,彻底改变了传统的单个基因研究模式,使我们能从全基因组水平分析相关基因表达水平及其结构的改变,以及其相互作用网络、途径及调控机制等.这些技术已成为功能基因组研究的重要手段,也使研究肿瘤转移过程中多基因改变的模式及其调控机制成为可能.
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早期生长反应基因1敲除对肝癌组织基因表达谱的影响
目的:对比观察早期生长反应基因1(EGR-1)敲除大鼠与野生大鼠肝癌模型基因表达谱的变化,探讨EGR-1基因是否参与调控肝癌的生长与转移.方法:应用cDNA表达芯片对EGR-1基因敲除大鼠和野生大鼠肝癌模型的癌标本组织抽提的mRNA进行芯片杂交,并对两者的基因表达谱进行对比分析.将同一基因在一个模型中的表达高于另一个模型的3倍以上作为基因差异表达的判断标准.结果:野生大鼠肝癌模型与EGR-1敲除大鼠肝癌模型相比较,前者有25条已知基因和2条未知基因表达上调,而后者有41条已知基因和23条未知基因表达上调;其中包括与细胞增殖和肿瘤转移相关的重要基因.结论:EGR-1基因敲除可引起大鼠肝癌模型基因表达谱的明显变化;EGR-1很可能参与了肝癌细胞生长与转移的调控.
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cDNA微阵列对22例弥漫型胃癌基因的检测
目的从转录组水平识别弥漫型胃癌与正常胃黏膜间的基因表达差异,探讨胃癌分子发生发展机制.方法收集22例弥漫型胃癌患者的新鲜冻存胃癌组织及同例相应正常胃黏膜.杂交芯片采用含14 592个点的cDNA表达谱芯片.差异表达基因的筛选标准为该基因在50%以上样本中的肿瘤与正常组织荧光强度比(ratio比值)＞2或＜0.5.采用系统聚类法进行基因表达的相似性分析,标本组间比较采用方差分析.应用实时定量RT-PCR方法对芯片结果进行验证.结果胃癌组织与正常胃黏膜间的差异表达基因共357个,其中表达上调者153个,下调者204个.上调基因功能主要与细胞骨架运动、基质重建、细胞增殖及信号传导等相关;下调基因功能则主要与细胞免疫防御、毒理代谢、功能分化、核-浆转运及凋亡抑制等相关.TNM分期的Ⅰ+Ⅱ期组与Ⅲ+Ⅳ期组间,有7个基因的表达差异有统计学意义(P＜0.05).RT-PCR验证结果与芯片表达结果一致.结论运用cDNA芯片进行弥漫型胃癌基因表达谱分析,有助于从分子水平全方位阐明弥漫型胃癌的发病机制及生物学特性,也有助于进一步发现新的分子诊断指标和基因治疗靶标.
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微阵列技术筛选肺鳞癌分子标志物的研究
目的研究肺鳞癌基因表达谱,筛选肺鳞癌的差异表达基因.方法利用cDNA微阵列技术研究6个分期为Ⅰ期的手术切除鳞癌标本的基因表达谱,找出在6个基因表达谱中均呈上调或下调的基因,并选择其中表达上调的nm23与表达下调的BRCA2基因,利用免疫组化方法进行验证.结果共有107个基因在全部6个肺鳞癌标本中出现差异表达,其中26个表达上调,81个表达下调.nm23蛋白在20个肺鳞癌标本中表达增强,而BRCA2则呈低表达,与cDNA微阵列技术检测结果相符.结论 cDNA微阵列技术可用于肺鳞癌差异表达基因的研究,利用多张微阵列芯片重复筛选出的差异表达基因可初步作为肺鳞癌的候选分子标志物.
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微阵列技术在肿瘤研究中的应用
微阵列技术 (microarray)又常称为微排列或微点阵,目前新兴的DNA芯片 (DNA chip)即是微阵列中主要的一种,微阵列与 DNA芯片二者的名词常混用.微阵列根据其在固相载体上排列的探针不同,可大致分为两类:一类是 cDNA或寡核苷酸微阵列 (cDNA microarray);另一类是组织微阵列(tissue microarray).肿瘤的发生、发展涉及多个基因的改变,由于技术上的不足和缺陷,在肿瘤的基因表达和基因间相互作用的研究上,不但费时费力,而且事倍功半,长期停留在零敲碎打的水平上.自1995年微阵列技术问世以来,人们立即将其应用于肿瘤研究,并取得了许多重要进展,为人类终揭示肿瘤的发生、发展规律带来了新的希望和可能.
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神经节细胞胶质瘤恶变及其差异表达基因分析
目的探讨神经节细胞胶质瘤恶性进展的分子变化,为进一步研究分子病因奠定基础.方法取同一患者不断恶化的3次手术标本,行cDNA微阵列检测,分析在不同阶段持续存在的差异表达基因.结果初发(WHOⅡ级)、复发(WHOⅢ级)和再发(WHOⅣ级)的标本与正常脑组织相比,差异表达基因共19条,其中下调者16条,上调者3条.在下调的基因中,功能明确者有抑制RAFl/MEK/ERKs激酶通路激活的磷酸酰乙醇胺结合蛋白,抑制肿瘤血管增生、侵袭,调控细胞凋亡的碳酰还原酶;抑制c-myc基因表达的肺库否样因子;参与人DNA切除修复的多聚酶ε.结论神经节细胞胶质瘤恶变过程中持续存在的分子变化,以抑制肿瘤增殖基因表达下调为主,其中RAF激酶抑制蛋白、DNA多聚酶ε和碳酰还原酶是参与细胞信号传导和DNA损伤修复等具重要功能的基因,值得进一步研究.
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口腔癌和癌前病变细胞中氧化应激相关基因差异表达
目的 筛选口腔鳞状细胞癌和癌前病变细胞中与氧化应激相关的差异表达基因,探讨氧化应激损伤与口腔癌发生的相关性及其作用机理.方法 采用核酸微阵列技术,对口腔鳞状细胞癌细胞株Tca8113、KB及口腔癌前病变细胞株DOK细胞的基因表达谱进行比较研究,检测、筛选口腔鳞状细胞癌中与氧化应激相关的差异表达基因.结果 与氧化应激相关的差异表达基因有28条.与氧化应激关系较密切的差异表达基因有9条,如过氧化物酶、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽合成酶、谷胱甘肽S-转移酶、硫氧还原酶及硒蛋白等.另外,细胞角蛋白17、细胞角蛋白10及细胞角蛋白7在Tea8113和KB细胞中表达明显增高.结论 氧化应激损伤可能通过某种信号通路引起细胞角蛋白发生变化,从而导致口腔鳞状细胞癌的发生.氧化应激损伤可能与口腔鳞状细胞癌的发生密切相关.
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千里光致小鼠肝损伤的基因表达谱分析
目的 在基因表达层次上探讨中药千里光对小鼠肝脏的毒性机制.方法 实验小鼠分别灌胃千里光提取物15和30 d后,以cDNA微阵列技术研究千里光对小鼠肝脏基因表达谱的影响,根据差异表达基因的生物学功能,探讨千里光对小鼠肝脏的毒性机制.结果 千里光给药15 d组小鼠相对正常对照组差异表达基因有39条,其中上调基因8条,下调基因31条,功能已知基因23条,功能未知基因16条.给药30 d组小鼠差异表达基因有655条,其中上调基因337条,下调基因318条,已知功能基因213条,未知功能基因442条.两给药组共同的差异表达基因有21条,其中上调基因2条,下调基因19条.结论 千里光可导致小鼠肝脏基因表达谱显著变化,且差异表达基因与其肝损伤间有高度关联性,这对阐明千里光属植物的肝损伤机制具有十分重要的作用.
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应用cDNA微阵列技术研究胶质母细胞瘤凋亡相关基因的表达
目的研究胶质母细胞瘤凋亡相关基因的表达.以探讨凋亡相关基因的异常表达在肿瘤的发生、发展过程中的作用.方法采用cDNA微阵列技术,研究胶质母细胞瘤与正常脑组织之间凋亡相关基因表达的差异.采用看家基因对杂交信号进行校正.差异大于1.5倍的基因视为差异有显著性意义,并从中选择6个基因采用RT-PCR进行验证.结果共有28个基因的表达存在差异,其中有17个基因在胶质母细胞瘤表达升高,11个表达下降.RT-PCR结果与基因芯片结果一致.结论众多凋亡相关基因参与了胶质母细胞瘤的发生和发展,其中部分基因如CRAF1、hHR23B等是新发现的与胶质母细胞瘤有关的基因.
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用cDNA微阵列研究K562/A02细胞多药耐药机制
DNA芯片技术是90年代初期发展起来的一种DNA分析新技术.cDNA微阵列是DNA芯片的一种,是将组织或细胞中经RT-PCR得到的300～500 bp的cDNA片段固定于芯片上而得到的.芯片上每一个cDNA点阵的序列和意义都是已知的,通过比较两种来源的RNA,可以判断cDNA微阵列上每个基因在二者之间表达水平的差异.
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cDNA微阵列实验分析中常用的统计方法
针对cDNA微阵列杂交实验从设计、收集样本到数据的采集、整理和分析等全过程,介绍了如何基于统计学原理对各个过程常见的问题进行处理,并对各种方法的优缺点简要概述,为研究者有效进行微阵列实验提供参考.
