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HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列的电子延伸及验证
目的:研究痢疾杆菌福氏2a入侵前和入侵后3 h的人上皮细胞差异表达的新基因.方法:采用增毒的痢疾杆菌福氏2a 2457T侵袭HeLa细胞,检查HeLa细胞中细菌的数量并用RT-PCR方法从HeLa细胞中提取总RNA,制备探针.采用含有约3000个代表新基因的芯片进行芯片杂交,分析杂交结果.将所获得的新的156条EST序列为种子序列用cDNA微阵列实验,以人类EST数据库为基础库,应用SiClone软件进行EST拼接、校对并尽可能延长获得大片段或全长cDNA.选取基因组未注释的编码区序列作为新基因进行RT-PCR实验验证.结果:共鉴定到≥3倍或≤0.33的差异表达的代表新基因的EST序列45条,其中25个延伸序列鉴定为与重要的肠道功能相关的已知基因,并有3个在痢疾杆菌侵袭期间高表达的存在显著差异的新EST序列,他们分别名为:NPCCKHl2、ADBCSB02和HTBAMG05,这3个基因是新的人基因或假基因.结论:鉴定出了在HeLa细胞感染痢疾杆菌前后差异表达的新EST序列,为进一步研究痢疾杆菌与寄主相互作用奠定了基础.
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日本血吸虫(大陆株)成虫表达序列标签的获取及电子延伸
目的获取日本血吸虫(Schistosoma japonicum,Sj)新基因.方法从Sj(大陆株)成虫cDNA文库中随机挑选单个重组克隆进行部分测序以获取表达序列标签(expressed sequence tag,EST),用其提供的BLAST程序和Genebank数据库进行序列比较和同源性分析;建立电子拼接的方法,对所获EST进行电子延伸,并对Si延伸后序列进行同源性分析.结果在Si成虫cDNA文库中,随机挑选182个单个重组克隆,获取53个有价值EST序列,并在Genebank中登录,获得53个EST的延伸序列及分析结果.结论 Si表达基因EST测序、同源性分析及EST的电子延伸是获取Sj新基因的有效对策.
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日本血吸虫thioredoxin基因的克隆和表达
目的结合分子生物学和生物信息学方法筛选鉴定日本血吸虫新基因.方法从日本血吸虫(Schistosoma japonicum,大陆株)成虫cDNA文库中获取表达序列标签(expressed sequence tag,EST),用电子拼接的方法延伸序列,用NCBI提供的BLASTx程序和Genbank数据库进行同源性分析以筛选基因;设计特异性引物从日本血吸虫成虫mRNA中扩增筛选基因并预测和分析;扩增产物克隆到原核表达载体并表达.结果筛选出日本血吸虫Thioredoxin全长基因并对其进行了序列分析,克隆全长cDNA至PET原核载体并表达成功.结论结合EST、电子延伸和传统的分子生物学方法是高效筛选S.japonicum功能基因的有效策略.
