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黄芩对实验性帕金森模型大鼠的保护作用
目的:研究黄芩对鱼藤酮所致帕金森(PD)模型大鼠的保护作用.方法:Wistar大鼠每日颈、背部皮下注射鱼藤酮葵花油乳化液制备PD大鼠模型；阳性组及不同剂量药物组在每日注射鱼藤酮之前1小时灌胃给药.ELISA法检测大鼠脑硫氧还蛋白(Tx)；荧光探针法检测纹状体活性氧(ROS)；分先光度法检测纹状体谷胱甘肽(GSH)、黑质丙二醛(MDA)含量.结果:造模后模型组大鼠出现一定程度的行为学变化,模型组Trx含量明显低于空白组、阳性组和低剂量组,药物可以一定程度上抑制氧化应激反应.结论:黄芩可以提高帕金森大鼠脑内Trx的表达,对鱼藤酮所致帕金森模型大鼠具有保护作用,这种作用可能与Trx相关.
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复方健耳剂干预庆大霉素耳毒性致豚鼠毛细胞损害的实验研究
目的 探讨中药复方健耳剂干预豚鼠庆大霉素(gentamycin,GM)耳毒性致外毛细胞损害的作用及可能机制.方法 选择杂色成年豚鼠48只,随机分为正常对照组、GM对照组、复方健耳剂+GM组(简称中药+ GM组),每组16只,其中正常对照组按常规饲养至第11天期满;GM对照组按200 mg/(kg·d)剂量,每天分2次连续注射9天,第11天终止饲养;中药+ GM组按3.994 g/(kg·d)剂量(1/2人工灌服,1/2自动饮用),预先服用复方健耳剂10天,然后在继续服用中药同时开始注射每天同等剂量GM,连续9天,第11天终止饲养.所有动物期满取出耳蜗,其中每组10只动物用于全耳蜗基底膜铺片,琥珀酸脱氢酶染色,进行耳蜗毛细胞形态学观察,另外每组6只动物,利用Real-time PCR技术检测耳蜗组织硫氧还蛋白(Trx)-1、Trx-2、凋亡信号调节激酶1(apoptosis signal-regulating kinase 1,ASK1)mRNA表达量.结果 全耳蜗基底膜检查显示,正常对照组各回三排内、外毛细胞形态正常,数量完整,排列有序;GM对照组各回三排外毛细胞损毁严重,绝大部分细胞出现严重崩解不全,或凋亡缩小,第1回比其他各回损害较重(P＜0.01),但内毛细胞仍基本存在;中药+GM组各回三排外毛细胞除少量和散在崩解不全外,大多仍存留可辨,形态如常,内毛细胞仍保持完整,各回外毛细胞损毁状况明显少于GM对照组(P＜0.01).中药+GM组Trx-1、Trx-2 mRNA表达明显高于GM对照组(P＜0.01),ASK1 mRNA表达则明显低于GM对照组(P＜0.01).结论 一定剂量GM连续使用可造成豚鼠耳蜗外毛细胞严重损害,并以第1回明显,而且以外毛细胞为主要损害靶细胞.复方健耳剂具有防治GM耳毒性外毛细胞损害作用,其机制可能与其调控硫氧还蛋白系统,阻止ASK1依赖的细胞凋亡有关.
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硫氧还蛋白和氧化/还原因子的融合荧光蛋白载体的构建及在293T细胞中的分布
目的 构建硫氧还蛋白和氧化/还原因子的融合荧光蛋白真核表达载体,并在293T细胞中得到表达和定位.方法 以RT-PCR方法从PC12细胞中克隆氧化/还原因子(APE/ref-1)的cDNA,然后亚克隆构建APE/ref-1-GFP融合真核表达载体.以PCR方法将质粒pQE30-TRX上的硫氧还蛋白cDNA亚克隆到pDsred1-1质粒上,然后将硫氧还蛋白-DsRed融合基因序列亚克隆到pCMV5质粒上,构建硫氧还蛋白-DsRed融合真核表达载体.通过磷酸钙转染293T细胞,以荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位.结果 成功构建了硫氧还蛋白-DsRed和APE/ref-1-GFP融合表达载体,并在293T细胞中得到表达,APE/ref-1-GFP融合蛋白定位在293T细胞核内;硫氧还蛋白-DsRed融合蛋白定位在293T细胞质和细胞核内.结论 为进一步研究硫氧还蛋白和APE/ref-1之间的动态相互作用奠定基础.
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PC12细胞硫氧还蛋白cDNA的克隆及在大肠杆菌中的表达
硫氧还蛋白(Thioredoxin, TRX)是广泛存在于原核和真核细胞中的低分子量蛋白质,它含有保守的Cys-Gly-Pro-Cys活性位点,作为多效性细胞因子而具有重要的生物学功能.从PC12细胞中提取总RNA,经逆转录PCR(RT-PCR)扩增出硫氧还蛋白cDNA并克隆到PUC18质粒上.序列分析表明,克隆所得序列与GenBank中大鼠硫氧还蛋白cDNA序列完全一致.将该基因亚克隆到表达质粒pQE30上,质粒pQE30-TRX在大肠杆菌M15中获得高效表达.带6His的融合蛋白约占总菌体蛋白的30%.分析鉴定表明,纯化的融合蛋白质分子量是14kD,且具有二硫键还原酶活性.
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何首乌饮减轻β-淀粉样蛋白诱导的海马神经元损伤的作用机制
目的 探讨何首乌饮对β-淀粉样蛋白(Aβ)诱导的大鼠原代培养海马神经元损伤保护作用及可能机制.方法 采用新生24h内的SD大鼠进行原代培养海马神经元,将培养10d的海马神经元分为模型组、何首乌饮保护组、何首乌饮治疗组、何首乌饮对照组及空白对照组.Hoechst33258染色观察海马神经元的凋亡率;免疫组织化学、Western blotting和RT-PCR检测各组海马神经元硫氧还蛋白1(Trx1)蛋白和mRNA的表达情况.结果 模型组细胞凋亡率增高(P＜0.05),Trx1蛋白和mRNA的表达量明显减少(P＜0.05);与模型组相比,何首乌饮治疗组和预防组的凋亡率明显降低(P＜0.05),Trx1蛋白和mRNA的表达量明显增加(P＜0.05).结论 何首乌饮可明显减轻Aβ诱导的海马神经元的损伤,其机制可能与增加抗氧化蛋白Trx1的表达有关.
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蛋白巯基的氧化还原修饰与心血管功能调节
细胞内局部环境氧化还原状态的生理范围变化可通过蛋白所含特定半胱氨酸巯基与二硫键之间产生可逆性转换参与广泛信号转导过程,而过度氧化即氧化应激则导致巯基不可逆地性转化为亚磺酸与磺酸产物,导致蛋白功能损伤.本文将讨论近年来在蛋白巯基的氧化还原反应及调节机制的研究以及与心血管功能调控关系的进展.
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硫氧还蛋白与神经退行性病变
神经退行性病变与胞内氧化还原失衡诱发的神经元损伤、死亡有密切关系.硫氧还蛋白参与维持胞内氧化还原平衡,在氧化应激中起重要的氧还调节作用,因此成为对抗神经退行性病变的重要蛋白之一.硫氧还蛋白可能通过激活某些有氧还调节功能的酶、清除自由基和调节细胞内分子通道等发挥对神经元的保护作用.对转基因动物的研究,进一步提示硫氧还蛋白在神经退行性病变的防治中可能发挥重要作用.
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慢加急性肝衰竭患者外周血PBMC中Trx-1、Trx-2表达水平研究
目的 检测慢加急性肝衰竭患者外周血单个核细胞(PBMC)中硫氧还蛋白-1(Trx-1)、硫氧还蛋白-2(Trx-2)mRNA水平并探讨其临床意义.方法 收集60例慢加急性肝衰竭患者(肝衰竭组),38例慢性乙型肝炎患者(慢性乙型肝炎组),26例健康志愿者(正常对照组)的外周血,分离单个核细胞,提取总RNA,用实时定量PCR的方法检测Trx-1、Trx-2 mRNA水平并进行统计分析.结果 肝衰竭组患者PBMC中Trx-1、Trx-2的mRNA水平较慢性乙型肝炎组及正常对照组显著升高(P＜0.05).同时,在肝衰竭患者中,Trx-1、Trx-2的mRNA水平与总胆红素水平(TBIL)呈正相关(P＜0.05).Trx-1的mRNA水平与终末期肝病模型(MELD)评分呈正相关(P＜0.05).此外,肝衰竭患者中死亡组Trx-1、Trx-2 mRNA的水平较好转者明显上调(P＜0.05).Kaplan-Meier分析表明,Trx-1 mRNA水平较高的患者预后明显劣于Trx-1 mRNA水平较低的患者(P＜0.05),其中Trx-1的截断值为0.635,敏感度为75％,特异度为64.29％.结论 Trx-1、Trx-2 mRNA及其反应的氧化损伤水平与肝衰竭的疾病严重程度和预后相关,并可能参与了疾病的发生和进展.
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PD-L1重组蛋白的表达及生物学活性分析
目的 构建细胞程序死亡因子1配体1(PD-L1)的重组表达质粒,在原核系统中表达并分析其生物学活性.方法 经密码子优化后合成PD-L1全基因序列,构建硫氧还原蛋白-pET43b/(PD-L1)重组表达质粒并在大肠埃希菌中表达;用ELISA验证表达产物与其受体结合的生物学活性.结果 正确构建了PD-L1重组表达质粒及其大肠埃菌基因工程菌,能稳定、高效地表达目的 蛋白,相对分子质量为47×103,目的 蛋白能与其受体特异性结合.结论 成功获得有生物学活性的PD-L1重组蛋白,为研制单克隆抗体及其与病毒感染慢性化的关系提供基础条件.
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耐热可溶性戊型肝炎病毒基因工程抗原的表达
目的利用硫氧还蛋白融合表达系统表达戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus,HEV)结构基因片段,获得耐热、可溶、具有生物活性的HEV基因工程抗原.方法将HEV ORF2 6964\|7126 nt基因片段插入硫氧还蛋白融合表达载体pThioHisA,转化大肠埃希菌BL21,经IPTG诱导,表达融合蛋白.裂解细菌后,离心,取上清置于80℃处理10 min,再次离心,取上清用ELISA方法测定表达产物的生物活性.结果 SDS-PAGE分析表明,HEV 结构基因获得高效表达,相对分子质量约为20 000,耐热,水溶性好,ELISA证实具有HEV特异抗原性.结论应用硫氧还蛋白融合表达系统成功表达了耐热、可溶、具有生物活性的HEV基因工程抗原.
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诊断用丁肝抗原的基因优化及其蛋白表达、纯化和鉴定
目的 获取有生物活性的丁肝抗原蛋白,探讨其作为诊断试剂的应用价值.方法 经密码子优化,合成人工编码的丁肝抗原基因序列；以M48作为表达载体,构建带有硫氧还蛋白的重组表达质粒；在大肠埃希氏菌中经IPTG诱导表达；以亲和层析纯化并以ELISA鉴定该蛋白.结果 酶切鉴定构建的质粒正确；SDS-PAGE结果显示表达和纯化的外源蛋白与预期相对分子质量大小一致；ELISA鉴定该蛋白有与丁肝抗体特异性结合的活性.结论 成功获得有生物活性的可供诊断用的丁肝抗原蛋白,为丁肝诊断试剂的研发奠定了基础.
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VEGF受体结合抑制肽的重组表达与活性分析
通过阻断肿瘤血管新生的相关因子与受体的结合抑制肿瘤血管的形成,已成为近年肿瘤治疗的重要研究策略.VEGF和碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)是促进血管内皮细胞生长重要的因子.本研究前期工作中已通过筛选噬菌体随机肽库,获得阳性克隆之一7P419(所带肽序列为GWYYDAX,X代表一特定氨基酸),该短肽具有明显的抑制VEGF的活性.本文将7P419与硫氧还蛋白Trx融合表达,检测该融合蛋白的抑制效果,并与人工合成肽7P419比较.
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不同时相亚低温治疗对心室纤颤兔脑功能的影响
目的 探究不同时相行亚低温(mild hypothermia,MH)治疗对心室纤颤(venricular fibrillation,VF)兔脑功能的影响.方法 本实验在兰州大学医学院实验室进行.45只健康雄性日本大耳白兔随机(随机数字法)分为常温复苏组(normothermic resuscitation group,NR)、CA前亚低温组(mild hypothermia pre-cardiac arrest group,HP)、复苏后30 min亚低温组(mild hypothermia resuscitation 30 min group,HRe30),复苏后90 min亚低温组(mild hypothermia resuscitation 90 min group,HRe90),常温假手术组(normothermic sham group,NS)和亚低温假手术组(hypothermia sham group,HS),采用体外电击法建立心搏骤停(cardiac arrest,CA)心肺复苏(CPR)兔模型,应用体表降温法诱导亚低温,并维持至实验结束.所有动物于诱发CA前15min、自主循环恢复(restoration of spontaneous circulation,ROSC)后30、60、120、360和600 min分别测定心率(HR)、左室舒张期末压(LVDEP)、左室内压上升或下降大速率(peak±dp/dtmax)和平均动脉压(MAP)等血流动力学指标,并留取动脉血待测血清神经元特异性烯醇化酶(NSE)和硫氧还蛋白(Trx)浓度.实验终点时处死动物,留取全脑组织标本,利用原位末端缺口标记法(TUNEL)光镜下观察海马CA1区细胞凋亡情况并统计凋亡指数(AJ).多组间比较采用单因素方差分析,以P＜0.05为差异有统计学意义.结果 ①血流动力学:观察期间NR组HR(次/min)于复苏后30、60、120、360、600 min均高于HP、HRe30和HRe90组;HP组LVEDP复苏后30 min明显低于NR、HRe30和HRe90组,于复苏后30 min、120 min明显高于NR、HRe30和HRe90组.HP组-dp/dtmax(mmHg/s)于复苏后30、60、120、360、600 min明显高于NR组.②血清学指标:HP组NSE(μg/L)于复苏后360 min、600min低于NR、HPRe30和HRe90组;NR组Trx(ng/L)于复苏后60、120、360、600 min时高于HP、HRe30和HRe90组;HP组Trx于复苏后60、120、360、600min时低于HRe30、HRe90组.③病理学:NR组海马CA1区神经元细胞凋亡情况较HP、HRe30、HRe90组严重,AI值(％)明显升高[(62.25±10.43)％ vs.(20.61±5.02m、(25.08±3.92)％、(30.33±7.15) ％,P=.001].结论 MTH对心室纤颤兔CPR模型脑功能有保护作用,复苏前行MTH保护作用更显著.
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蚯蚓组织中硫氧还蛋白还原酶抑制剂初探
目的研究蚯蚓组织成份对硫氧还蛋白系统的影响.方法乙酸盐缓冲液抽提蚯蚓组织成份,不同处理的蚯蚓提取液与硫氧还蛋白系统反应.在340nm波长处,用NADPH作为被监测的反应底物来动态监测硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的催化活性.结果蚯蚓提取液与TrxR单独作用后,监测底物NADPH的吸光值几乎不发生变化.蚯蚓提取液的溶剂及煮沸后的上清液不具有以上作用.结论蚯蚓组织中含有能够抑制TrxR活性的物质,该物质的化学本质为蛋白质.
关键词： 蚯蚓 硫氧还蛋白 硫氧还蛋白还原酶 NADPH 硫氧还蛋白还原酶抑制剂 -
TRX及TXNIP在溃疡性结肠炎患者中的表达及作用
目的 检测UC 患者血清及结肠组织中TRX 及TXNIP 的表达,分析这两种氧化应激因子与UC 病情严重程度的相关性,探讨二者在UC 发生发展中可能的作用.方法 收集29 例UC 患者(病例组)及25 例正常人(对照组/C 组)的外周静脉血和结肠黏膜活检组织.按照Sutherland DAI 评分标准予以患者评分后,分为轻中度活动组(A 组= 17 例)、重度活动组(B 组= 12 例).分别采用免疫组织化学染色法和酶联免疫检测技术(ELISA) 检测各组患者血清和结肠组织中TRX 及TXNIP 的表达.根据检测结果,对TRX 、TXNIP 与UC 患者病情严重程度的相关性进行统计学分析.结果 血清学检测显示:TRX 和TXNIP 在各组中的表达水平为:C 组0.05),余各组之间均有明显差异(P<0.05).免疫组织化学染色显示:TRX 在各组中的表达水平为:C 组A 组>B 组.各组间的表达均有明显差异(P<0.05).相关性分析:血清中TRX 及TXNIP 的表达与UC 患者病情的严重程度均具有显著相关性(r = 0.421,P <0.01; r = 0.439,P <0.01); 结肠组织中TRX 和TXNIP 的表达与UC 患者病情的严重程度均具有显著相关性(r = 0.940,P <0.01; r = -0.940,P<0.01).结论 活动期UC 患者血清中及结肠组织中TRX 与TXNIP 的表达与病情的严重程度密切相关,二者可能通过氧化应激机制参与了UC 的发病,其表达在一定程度上可以反映疾病的活动度.
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硫氧还蛋白、硫氧还蛋白相互作用蛋白与消化系疾病的关系
硫氧还蛋白系统是一类具有氧化还原活性的小分子蛋白系统,由硫氧还蛋白(TRX)、还原型辅酶Ⅱ(NADPH)和硫氧还蛋白还原酶(TRX-R)3部分组成,具有调节细胞氧化还原状态、对抗氧化应激、激活转录因子促进细胞生长以及抑制细胞凋亡等作用.硫氧还蛋白相互作用蛋白\硫氧还蛋白结合蛋白2\维生素D3上调蛋白1(TXNIP\TBP-2\VDUP-1)属于硫氧还蛋白结合蛋白的家族成员,通过抑制硫氧还蛋白系统的功能而发挥介导氧化应激、抑制细胞增殖及诱导细胞凋亡等作用,是TRX的负性调节因子.氧化应激与细胞凋亡参与了许多消化系疾病的发生发展.TRX与TXNIP作为氧化应激相关因子,可能在消化性疾病中发挥一定的作用.本文就TRX及TXNIP的结构特点、生物学功能以及与消化系疾病的关系等方面作一综述.
关键词： 硫氧还蛋白 硫氧还蛋白相互作用蛋白 氧化应激 消化系疾病 -
胃癌相关基因GCRG224的克隆及其在大肠杆菌中的表达
目的:利用硫氧还蛋白融合表达系统表达胃癌相关基因GCRG224.方法:采用PCR技术从pGEM-T质粒上扩增出含完整ORF的GCRG224 cDNA序列,将其克隆至硫氧还蛋白融合表达载体pET102/D-TOPO中,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达重组融合蛋白,SDS-PAGE分析表达产物.结果:高效表达出相对分子量约16 800的重组融合蛋白.薄层凝胶扫描显示,其表达量占菌体总蛋白质的22.3%.结论:在大肠杆菌中成功表达了GCRG224重组融合蛋白.
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2型糖尿病肾病患者血清中Trx，Txnip的变化及意义
目的：探讨硫氧还蛋白( Trx),硫氧还蛋白相互作用蛋白( Txnip)与2型糖尿病肾病患者的关系。方法用ELISA法检测T2DM组(96例)及同期门诊健康体检者D组(23例)人群血清中Trx,Txnip水平,其中按照尿微量白蛋白与尿肌酐值的比值(ACR),将T2DM组分为A组(<30 mg/g ,35例),B组(30~300 mg/g,37例),C组(>300 mg/g ,24例),同时检测糖化血红蛋白( HbA1c)、空腹血糖( FPG)、尿素氮( BUN)、肌酐( Cr)、总胆固醇( TC)、体重指数( BMI )、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL－C)。结果糖尿病组患者血清中Trx的水平较健康对照组显著降低(P<0.01), Txnip的水平较健康对照组明显升高(P<0.05),A组与B组两因子水平未见统计学差异(P>0.05),B组与C组比较两因子有统计学差异(P<0.05),糖尿病组ACR和Trx正相关(r ＝0.706, P<0.001),和Txnip负相关(r ＝－0.607,P<0.001)。结论 Trx和Txnip表达与DN的病变发展有关,有可能作为检验DN的敏感指标,为早期诊断糖尿病肾病及分期提供方法。调节二者表达及活性可成为糖尿病肾病诊治的新思路。
关键词： 2型糖尿病 糖尿病肾病 硫氧还蛋白 硫氧还蛋白相互作用蛋白 尿微量白蛋白/肌酐值 -
2型糖尿病前期患者硫氧还蛋白相互作用蛋白的变化
目的 探讨2型糖尿病前期患者硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)等的变化.方法 选取2型糖尿病前期患者(PD组)141例、2型糖尿病患者(DM组)24例、正常糖耐量组(NGT组)36例,检测血糖(FBG)、胰岛素(INS)、血清硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、硫氧还蛋白(TRX)水平,并对结果进行分析.结果 3组空腹血糖值、胰岛素(INS)、硫氧还蛋白相互作用蛋白(TXNIP)、硫氧还蛋白(TRX)比较差异有统计学意义(P＜0.05).结论 TXNIP、TRX在2型糖尿病前期已出现升高,提示在糖尿病前期已启动慢性氧化应激.
关键词： 糖尿病前期 硫氧还蛋白相互作用蛋白 硫氧还蛋白 氧化应激 -
人11β-羟基类固醇脱氢酶基因克隆与表达的实验研究
目的:构建人Ⅰ型11β羟基类固醇脘氢酶(11β-HSD1)原核表达载体并表达目的蛋白,为代谢综合征的研究奠定基础.方法:从HepG2细胞系中提取细胞总RNA,经反转录合成cDNA第一链后再以其为模版,扩增11β-HSD1基因.pET32a原核表达载体和PCR扩增出的产物经过Bam HI和XhoⅠ双酶切后,在16℃过夜的条件下用T4 DNA连接酶连接上述酶切产物,然后用该产物转化Top10大肠杆菌感受态细胞,挑克隆后进行测序.将克隆成功的11β-HSD1重组质粒转化大肠杆菌菌株BL21(DE3),分别用不同浓度、不同时间的IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖)诱导其表达,并优化诱导条件.表达的蛋白采用聚丙烯酰胺凝胶电泳结合考马斯亮蓝染色的方法观察目的基因的表达情况.结果:挑选的克隆经测序证实pET32a-11β-HSD1重组质粒构建成功,11β-HSD1基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的硫氧还蛋白trxA基因融合,在IPTG浓度为10μM,诱导时间为5小时时,上清中有明显的分子量约为52 kDa的重组蛋白产生,且目的蛋白分子量的大小与预期一致.结论:本实验成功构建了人pET32a-1 1β-HSD1蛋白原核表达载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)后成功诱导了其融合表达.目的蛋白主要以可溶性蛋白的形式存在于上清中,为进一步研究其结构、功能、制备抗体等奠定了基础.
关键词： Ⅰ型11β羟基类固醇脱氢酶 原核表达 硫氧还蛋白 融合表达
