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NADPH氧化还原反应平台及其在Ang II介导ROS信号通路中的调节作用
血管紧张素II(Ang II)作为肾素血管紧张素系统(RAS)初的效应分子早是在肾脏中发现的,新近的研究表明这一系统对哺乳动物所有组织和血管细胞都有作用,影响心脏、肾、血管和脑的功能,调节平滑肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、单核/巨噬细胞及心肌细胞的各种效应.Ang II同时也是激活 NADPH 氧化酶的主要刺激因子.Ang II通过与血管紧张素I型受体(AT1-R)结合,激活NADPH氧化酶,促进ROS的产生,使氧化应激增加,这是高脂血症、高血压、糖尿病和动脉粥样硬化的共同机制之一.本文结合本课题组近年来的研究成果,通过对NADPH氧化还原反应平台及其在Ang II介导的ROS信号通路中的生理作用进行分析,阐明其作用的分子机制,从而有助于开发抑制Ang II激活NADPH产生ROS的药物,对预防和治疗ROS所介导的疾病具有非常重要的意义.
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问号钩端螺旋体对J774A.1和THP-1细胞NADPH氧化酶活性及ROS产生的影响
目的：探索问号钩端螺旋体(简称钩体)对小鼠和人单核-巨噬细胞株NADPH氧化酶活性及活性氧簇( ROS)产生的影响,了解不同宿主巨噬细胞对问号钩体的杀菌机制。方法采用问号钩体56601株感染J774A.1和THP-1细胞建立钩体细胞感染模型,光度法测定细胞NADPH氧化酶活性和超氧离子O-2水平,免疫荧光法检测细胞ROS水平变化。结果光度法检测结果显示,问号钩体赖株感染2 h、4 h、12 h和24 h后,J774A.1细胞NADPH氧化酶活性分别从感染前的0.6190μmol·min-1· mg-1上升至0.3055μmol · min-1· mg-1、6.1415μmol · min-1· mg-1、1.4871μmol·min-1·mg-1和0.9646μmol · min-1· mg-1；THP-1细胞 NADPH 氧化酶活性分别从感染前0.7235μmol·min-1·mg-1上升至0.8842μmol·min-1·mg-1、1.8971 μmol·min-1·mg-1、1.1254μmol·min-1·mg-1和0.5627μmol·min-1·mg-1；超氧离子结果显示,J774A.1细胞超氧离子水平由正常细胞的0.1890 μmol/L 分别上调至0.2363μmol/L、0.2977μmol/L、0.3240μmol/L 和0.3057μmol/L；THP-1细胞由正常细胞的0.1237μmol/L 分别上调至0.1493μmol/L、0.2490μmol/L、0.2700μmol/L和0.2727μmol/L；免疫荧光检测结果表示,钩体感染J774A.1和THP-1细胞2 h、4 h、12 h和24 h后,细胞ROS水平较正常细胞逐渐变强,24 h出现降低。结论问号钩体感染J774A.1和THP-1细胞NADPH氧化酶活性和超氧离子O-2均显著上调,且J774A.1细胞上调更明显,结果有助于揭示巨噬细胞杀灭问号钩体的分子机制。
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蚯蚓组织中硫氧还蛋白还原酶抑制剂初探
目的研究蚯蚓组织成份对硫氧还蛋白系统的影响.方法乙酸盐缓冲液抽提蚯蚓组织成份,不同处理的蚯蚓提取液与硫氧还蛋白系统反应.在340nm波长处,用NADPH作为被监测的反应底物来动态监测硫氧还蛋白还原酶(TrxR)的催化活性.结果蚯蚓提取液与TrxR单独作用后,监测底物NADPH的吸光值几乎不发生变化.蚯蚓提取液的溶剂及煮沸后的上清液不具有以上作用.结论蚯蚓组织中含有能够抑制TrxR活性的物质,该物质的化学本质为蛋白质.
关键词： 蚯蚓 硫氧还蛋白 硫氧还蛋白还原酶 NADPH 硫氧还蛋白还原酶抑制剂 -
醛糖还原酶干预支气管哮喘气道炎症的研究进展
近年来研究结果显示,醛糖还原酶(aldose reductase,AR)在支气管哮喘(简称哮喘)炎性病理过程中扮演着重要角色,而抑制AR活性可以抑制炎症反应中炎症细胞因子、炎性相关活性氧(reactive oxygen species,ROS)等的释放,从而减轻气道炎症、减轻气道高反应性和黏液的大量分泌,在一定程度上阻止哮喘病理过程的进展.一、AR及AR抑制剂AR是醛-酮还原酶(AKR)超家族中的一员,是以烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸( NADPH)为辅酶的单体多肽.
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子痫前期对滋养细胞脂肪酸氧化的影响及其与p38MAPK信号通路的相关性
目的 探讨重度子痫前期对胎盘滋养细胞线粒体长链脂肪酸氧化酶——长链三羟基酰基辅酶A脱氢酶(LCHAD)表达的影响及其与p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)信号通路的相关性.方法 体外培养胎盘滋养细胞,分别用早发型重度子痫前期、晚发型重度子痫前期、重度子痫前期伴发HELLP综合征及正常妊娠妇女的血清刺激胎盘滋养细胞(分别命名为早发组、晚发组、HELLP组、正常对照组),每组再分别加入DMEM/F12培养基、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶抑制剂(NADPH-Ⅰ)和p38MAPK抑制剂(p38-Ⅰ)处理细胞.采用实时荧光定量PCR技术和蛋白印迹法检测各组滋养细胞LCHAD mRNA和蛋白的表达.结果 (1)LCHAD mRNA的表达:正常对照组+培养基、早发组+培养基、早发组+ NADPH-Ⅰ、早发组+p38-Ⅰ、晚发组+培养基、晚发组+NADPH-Ⅰ、晚发组+p38-Ⅰ、HELLP组+培养基、HELLP组+NADPH-Ⅰ、HELLP组+p38-Ⅰ滋养细胞LCHAD mRNA的相对表达量分别为1.00±0.03、0.14±0.08、0.95±0.20、1.43±1.02、0.37±0.18、1.51 ±0.36、1.60±0.31、0.10 ±0.04、0.49 ±0.10、0.44±0.21.早发组+培养基、晚发组+培养基、HELLP组+培养基与正常对照组+培养基比较,LCHAD mRNA的相对表达量均明显降低,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05);与正常对照组比较,晚发组+ NADPH-Ⅰ、晚发组+p38-Ⅰ LCHADmRNA的相对表达量均有明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05),而HELLP组LCHAD mRNA的相对表达量均有明显降低,差异也有统计学意义(P＜0.05).(2) LCHAD蛋白的表达:正常对照组+培养基、早发组+培养基、早发组+ NADPH-Ⅰ、早发组+p38-Ⅰ、晚发组+培养基、晚发组+NADPH-Ⅰ、晚发组+ p38-Ⅰ、HELLP组+培养基、HELLP组+NADPH-Ⅰ、HELLP组+p38-Ⅰ组LCHAD蛋白的相对表达量分别为19.4±2.2、10.7±1.1、17.9±3.3、19.1 ±2.9、16.4±2.3、20.3±2.3、20.9 ±4.3、12.4±2.3、17.6±2.6、17.7 ±2.0.与正常对照组比较,早发组+培养基、晚发组+培养基及HELLP组LCHAD蛋白的相对表达量均明显降低,分别比较,差异均有统计学意义(P＜0.05),而早发组+NADPH-Ⅰ、早发组+p38-Ⅰ、晚发组+NADPH-Ⅰ、晚发组+p38-Ⅰ LCHAD蛋白的相对表达量无明显变化(P＞0.05).早发组、晚发组、HELLP组中,NADPH-Ⅰ亚组、p38-Ⅰ亚组与培养基亚组比较,LCHAD蛋白的相对表达量均有明显升高,差异均有统计学意义(P＜0.05).结论 重度子痫前期对胎盘滋养细胞中的脂肪酸氧化代谢有一定的影响,尤其以HELLP综合征为明显.NADPH-Ⅰ、p38-Ⅰ能缓解早、晚发型重度子痫前期和HELLP综合征中的脂肪酸氧化代谢障碍,p38MAPK信号通路可能参与了该过程.
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灵芝三萜合成关键元件GLCYP450及其还原酶GLNADPH的基因克隆及共表达载体构建
细胞色素P450是灵芝三萜生物合成途径中的关键元件,其催化反应过程中需要有NADPH/NADH为其传递电子.本课题组根据已获得的赤芝(Ganoderma lucidum (Leyss.Ex Fr.) Karst.)基因组数据中的CYP450和NADPH转录本序列,利用RT-PCR方法获得灵芝CYP450 (GLCYP450)和NADPH(GLNADPH)基因的全长cDNA序列,并在序列两端引入相应的限制性内切酶位点,通过酶切及连接反应,将GLCYP450和GLNADPH重组到酵母表达载体pESC-URA中,成功构建了酵母表达载体质粒pESC-GLNADPH-GLCYP4 50,为通过合成生物学手段研究灵芝三萜生物合成奠定基础.
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NADPH对人脐静脉内皮细胞缺糖缺氧复灌损伤早期的保护作用
目的 探讨还原型辅酶Ⅱ(NADPH)对人脐静脉内皮细胞(HUVECs)缺糖缺氧复灌(OGD/R)损伤早期的保护作用及其对occludin、基质金属蛋白酶(MMP)9蛋白表达的影响.方法 体外培养HUVECs系,建立稳定的HUVECs缺糖缺氧复灌损伤模型,实验分3组:正常对照组、缺糖缺氧复灌组、缺糖缺氧复灌+NADPH组.细胞增殖试剂盒(CCK-8法)检测HUVECs活力;细胞毒性试剂盒检测HUVECs内乳酸脱氢酶(LDH)释放;倒置显微镜观察HUVECs形态变化;比色法检测HUVECs裂解液中超氧化物歧化酶(SOD)活力及丙二醛(MDA)含量;Western Blot法检测各组occludin、MMP9蛋白的表达.结果 与缺糖缺氧复灌组比,NADPH处理可提高缺糖缺氧复灌损伤后HUVECs的存活率(P<0.05),减少损伤后HUVECs中LDH释放(P<0.05),促进HUVECs形态的恢复,减少MDA生成(P<0.05),提高SOD活力(P<0.05);缺糖缺氧复灌处理后,给予NADPH处理可抑制MMP9水平上调(P<0.05),促进occludin水平恢复(P<0.05).结论 NADPH对HUVECs具有保护作用,其保护作用与抑制氧化应激反应,调节MMP9、occludin蛋白的表达有关.
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蝉花通过抑制肾小管NADPH氧化酶/氧化应激治疗糖尿病肾病的研究
目的:探讨蝉花对链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠肾小管损伤的改善作用,基于调控肾小管NADPH氧化酶/氧化应激延缓糖尿病肾损害.方法:动物实验分为对照组(CON)、蝉花组(CSM)、糖尿病组(DM)和蝉花治疗组(DM+CSM);24周后检测24 h尿蛋白、血尿素氮、血肌酐;肾组织检测活性氧(ROS)、丙二醛(MDA)水平,分离肾小管组织并用Western-blot检测caspase-3蛋白表达,Masson染色观察肾组织纤维化情况.细胞实验以晚期糖基化终末产物(AGEs)刺激大鼠原代肾小管上皮细胞(TEC),蝉花干预后观察NADPH氧化酶及氧化应激变化.结果:DM组大鼠24 h尿蛋白、血肌酐、血尿素氮在24周均明显高于对照组;干预24周后,DM+蝉花组大鼠的24 h尿蛋白、血肌酐水平低于DM组,DM+蝉花组尿素氮水平和DM组相比有下降的趋势,但无统计学意义.DM组NGAL、KIM-1、Casepase-3、INT％表达水平明显高于对照组,DM+蝉花组中的各指标均明显低于DM组.DM组中MDA、ROS和8-OHdG水平均明显高于对照组,DM+蝉花组肾组织MDA、ROS和8-OHdG水平均明显低于DM组.在细胞实验中AGEs组的NADPH氧化酶活性和ROS水平明显高于对照组,AGEs+蝉花组的NADPH氧化酶活性和ROS水平低于AGEs组.结论:蝉花可通过抑制肾小管NADPH氧化酶/氧化应激治疗糖尿病肾病.
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Ghrelin对PI3K/Akt抑制剂预处理大鼠中枢血压调节及NADPH表达的影响
目的 研究食欲刺激素(ghrelin)对PI3K/Akt抑制剂预处理大鼠中枢血压调节及血管烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)表达的影响.方法 选取10~12周龄雄性SD大鼠18只,腹腔内注射麻醉,股动、静脉插管,侧脑室内插管.随机分为3组,人工脑脊液(aCSF)对照组,ghrelin组,PI3K抑制剂(wortmannin)预处理组,每组6只.aCSF组侧脑室内注射aCSF(10 μL);ghrelin组侧脑室内注射aCSF(10 μL),10 min后侧脑室内注射食欲刺激素(50 pmol/10 μL);wortmannin预处理组侧脑室内注射wortmannin (20 nmol/10 μL),10 min后侧脑室内注射食欲刺激素(50 pmol/10 μL).观察各组血压、心率的变化.用酶联免疫吸附法,实验结束后测定NADPH浓度.结果 Ghrelin组平均动脉压(MAP)大下降幅度(-12.3±2.6)mmHg,心率(HR)大下降幅度(-29.5±13.4) bpm,与aCSF组相比,差异具有统计学意义(P<0.01, P<0.05).wortmannin预处理组侧脑室内注射食欲刺激素后MAP大下降幅度(-4.0±2.7)mmHg,与ghrelin组相比,差异具有统计学意义(P<0.01);与aCSF组比较,差异无统计学意义.在延髓和下丘脑中,ghrelin组NADPH浓度为(67.3±8.2)μmol/L和(67.5±7.2) μmol/L,均明显高于aCSF组(P<0.01);wortmannin预处理组与aCSF对照组及ghrelin组比较,差异均无统计学意义.结论 ghrelin通过PI3K/Akt信号传导通路引起降压作用并上调NADPH表达.
关键词： Ghrelin 侧脑室内注射 血压 Wortmannin NADPH -
氧化应激与病毒性心肌炎
病毒性心肌炎是指由柯萨奇病毒、埃可(ECHO)、脊髓灰质炎、腺病毒,流感病毒等病毒感染引起的心肌局限性或弥漫性的急性或慢性炎症病变,属于感染性心肌疾病.重症易发生恶性心率失常、急性心衰、心源性猝死等,在临床及法医尸检中常常得到证实.在病毒所致的心肌损伤中包括病毒的直接损伤、免疫应答反应、炎细胞的浸润等.近年对于氧化应激与急性病毒性心肌炎的相关性研究越来越深入,已证实活性氧和细胞抗氧化防御机制之间的失衡在病毒性心肌炎的心肌损伤过程中起到了重要作用.本文将综述氧化应激的来源及其在病毒性心肌炎发病机制中的作用和当前抗氧化治疗的现状.
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NADPH氧化酶在高脂诱导的人脐静脉血管内皮细胞氧化应激损伤中的作用
目的 探讨NADPH氧化酶在高脂诱导的人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)氧化应激损伤中的作用.方法 不同浓度(0.1、0.2、0.4、0.8 mmol·L-1)棕榈酸(palmitic acid,PA)刺激HUVECs0、12、24、48 h,CCK-8法检测血管内皮细胞增殖能力;免疫印迹法检测血管内皮细胞NADPH氧化酶亚基p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox的表达水平;免疫荧光法检测血管内皮细胞细胞内活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)的表达水平.结果 0.4 mmol·L-1 PA刺激HUVECs24、48 h组的细胞增殖率出现明显降低.因此,实验中我们采用0.4 mmol· L-1PA刺激24 h作为模型组;0.4 mmol·L-1PA刺激HUVECs24、48 h时,p22phox、p47phox、p67phox、gp91phox的表达均明显升高(P＜0.05),24h组与48 h组差异不明显(P＞0.05);0.4mmol·L-PA刺激血管内皮细胞24、48 h时,细胞内ROS表达水平均明显增高(P＜0.05),24 h组与48 h组差异不明显(P＞0.05);与模型组(0.4 mmol·L-1 PA刺激24 h)相比,NADPH氧化酶抑制剂diphenyliodonium(DPI,10 μmol·L-1)预处理可以使模型组血管内皮细胞ROS表达水平明显下调(P＜0.05).结论 NADPH氧化酶活性对高脂所致血管内皮细胞氧化应激损伤的防治有重要意义.
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兔血管平滑肌细胞活性氧的生成途径
目的探讨兔血管平滑肌细胞(VSMC)生成活性氧的途径.方法兔VSMC原代培养,噻唑蓝(MTT)法检测不同浓度过氧化氢(H2O2)对VSMC活力的影响;100μmol/L H2O2作用后不同时段,流式细胞仪检测VSMC细胞内超氧阴离子(·O2-)生成;逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测VSMC NADPH氧化酶各亚基mRNA表达.结果随H2O2浓度增加,VSMC细胞活力逐渐下降,浓度≥30 μmol/L时,各时段吸光度值即有显著降低(P＜0.05).100μmol/L H2O2作用后,(1)VSMC细胞内·O2-生成,其作用在24 h达峰值(DHE阳性细胞百分率24.01%);(2)VSMCp22phox mRNA的表达增加,并在1 h达峰值(为0 h的2倍),gp91phox和nox1mRNA的表达下降,尤其nox1,在1 h达低值(为0 h的15%).结论一定浓度的外源性H2O2可促进VSMC生成·O2-,NADPH氧化酶参与这一细胞效应.
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重症卡介苗淋巴结炎与儿童X连锁慢性肉芽肿病
慢性肉芽肿病(chronic granulomatous disease,CGD)是少见的原发性吞噬细胞免疫缺陷病.患者的多形核粒细胞不能通过烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸(NADPH)氧化酶产生超氧阴离子(O2-)来有效杀灭入侵的微生物.患者在儿童早期易于发生反复致命的过氧化氢酶阳性细菌和真菌感染,在慢性炎症部位形成肉芽肿[1].
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通心络对血管外膜损伤后氧化应激反应及内膜病变的作用
目的:探讨通心络对血管外膜损伤后内膜病变的作用及机制.方法:纯种高血脂新西兰大白兔18只,采用胶原酶消化+钝性机械分离的方法建立兔颈动脉外膜损伤模型后,随机分为对照组、通心络组和阿托伐他汀组,对照组给予盐水灌胃,另两组分别给予通心络和阿托伐他汀进行干预,共12周.采用HE染色法检查外膜损伤血管的形态变化,用免疫组化染色法测定血管组织中α-actin、CD68及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达；用实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RQ-PCR)技术检测外膜损伤后血管组织中NADPH氧化酶亚单位p22phox mRNA的表达.结果:与对照组比较,通心络和阿托伐他汀均可显著抑制内膜病变的形成,并明显增加病变中α-actin及Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的表达(P＜0.05),抑制p22phox mRNA的表达(P＜0.05).结论:通心络及阿托伐他汀均可有效地抑制血管外膜损伤后内膜病变的形成,并增加病变的稳定性,抗氧化应激可能是两种药物作用的机制.
