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钩端螺旋体主要属特异性蛋白抗原分布及其免疫性研究
目的 确定致病性问号钩端螺旋体(钩体)属特异性外膜蛋白的抗原性和交叉免疫反应性,为研制通用性钩体基因工程疫苗及检测试剂盒提供依据.方法 采用Ni-NTA亲和层析法,提取了4种钩体外膜蛋白主要基因型重组表达产物rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2,并用SDS-PAGE检测表达及提纯效果.上述重组蛋白常规皮下免疫家兔获得抗血清,显微镜凝集试验(MAT)检测各抗血清交叉凝集效价.采用盐变法提取了我国15群问号钩体参考标准株及非致病的双曲钩体Patoc Ⅰ株的外膜蛋白.以兔抗血清为一抗,采用Western blot检测上述4种外膜蛋白自然表达情况及其免疫反应性.结果 rLipL21、rLipL32/1和rLipL32/2、rLipL41/1和rLipL41/2、rOmpL1/1和rOmpL1/2表达量分别约占细菌总蛋白的10%、40%和35%、15%和10%、30%和15%,各重组蛋白SDS-PAGE提纯后均仅见单一的蛋白条带.重组蛋白兔抗血清在同一基因不同基因型表达产物之间有广泛的交叉免疫反应性,与不同钩体血清群的MAT效价为1:2～1:128.各血清群钩体外膜中均可检出上述4种外膜蛋白,但LipL21仅存在于问号钩体中.结论 LipL21、LipL32、LipL41、OmpL1均为钩体属特异性表面抗原,可作为通用性钩体疫苗及检测试剂盒的候选抗原.
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问号钩端螺旋体lipL41基因表达及重组抗原分析
目的构建问号钩端螺旋体(钩体)ltB/ctB-lipL41/1融合基因及其原核表达系统.方法采用连接引物聚合酶链反应(PCR)构建ltB-lipL41/1和ctB-lipL41/1融合基因,常规方法构建其原核表达系统.采用十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测目的重组蛋白rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1表达情况;用免疫印迹和神经节苷脂-酶联免疫吸附试验(GM1-ELISA)分别检测上述目的重组蛋白的免疫原性和佐剂活性;采用PCR和显微镜凝集试验(MAT)分别检测97株问号钩体野生株lipL41/1基因及其表达情况;用ELISA检测228例钩体患者血清lipL41基因产物的抗体.结果与报道的相关序列比较,ltB-lipL41/1和ctB-lipL41/1融合基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.6%～99.9%和99.8%～100%.rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1表达产量均约为细菌总蛋白的10%,主要以包涵体形式存在.rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1均分别能与rLipL41/1兔抗血清和牛GM1结合.87.6%(85/97)问号钩体野生株含有lipL41基因,84.5%(82/97)问号钩体野生株分别与rLipL41/1和rLipL41/2兔抗血清出现效价范围为1:4～1:128的MAT阳性结果.84.6%(193/228)和78.5%(179/228)的患者血清分别rLipL41/1和rLipL41/2抗体阳性.结论成功地构建了ltB-lipL41/1和ctB-lipL41/1融合基因及其原核表达系统.所表达的rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1融合蛋白有良好的免疫原性和佐剂活性.lipL41基因存在于不同问号钩体血清群中并高频率表达.rLTB-rLipL41/1和rCTB-rLipL41/1具有成为钩体属特异性疫苗抗原的良好前景.
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问号钩端螺旋体mce基因及其编码蛋白特征的初步分析
目的 建立基于mce基因的PCR检测方法,分析问号钩端螺旋体(钩体)mce基因保守性,获得钩体mce基因生物信息学分析结果.方法 以NCBI/Blast、NCBI/Cds软件搜索Mce内部存在的保守功能结构域及mce基因的特异性；采用TMHMM Server-2.0预测所编码蛋白跨膜区结构；根据已报道问号钩体赖株mce基因设计引物,采用PCR扩增问号钩体赖株全长mce基因,测序并使用DNAStar软件进行测序结果比对.以13株国内流行问号钩体菌株基因组DNA为模板,对基于mce基因PCR检测方法进行验证.扩增产物进行测序、比对,同时根据推定的氨基酸序列做系统发生树.结果 生物信息学研究表明,Mce含有与病原菌黏附侵袭相关的Mce超家族保守功能结构域；Mce中存在一明显的跨膜结构；同时,mce基因特异存在于问号钩体中；所克隆的mce基因与已报道序列(GenBank accession No.:NP_712236)一致；PCR检测结果表明,我国13株问号钩体株均携带mce基因；核苷酸和氨基酸序列相似性均＞95％.结论 问号钩体mce基因特异、保守存在于各致病性的问号钩体中；Mce具有明显的跨膜结构并含有Mce超家族结构域,与问号钩体黏附侵袭宿主细胞有关.
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钩端螺旋体在豚鼠组织中的动态分布和钩体病的病理改变
我们应用问号钩端螺旋体(简称钩体)赖型赖株建立钩体豚鼠感染模型,观察病理改变,应用免疫组织化学法显示感染后不同时期钩体抗原在肝、肾和肺组织中的分布特点,并应用透射电镜观察钩体病超微结构病变,为研究其发病机制奠定基础[1].
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问号钩端螺旋体感染对内皮细胞黏附分子ICAM-1、VCAM-1表达的影响
目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染对内皮细胞表面细胞间黏附分子-1 (ICAM-1)和血管细胞黏附分子-1(VCAM-1)表达的影响及差异.方法 采用问号钩体赖株体外感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后运用real-time RT-PCR技术检测细胞ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平.采用组织镀银染色法检测问号钩体感染C3H/HeJ小鼠后肺、肝、肾组织内钩体侵袭情况.采用免疫组化法检测小鼠肺、肝、肾组织中 ICAM-1和 VCAM-1表达的差异.结果 问号钩体感染HUVEC后细胞ICAM-1和VCAM-1 mRNA表达水平与感染前相比均显著升高(P<0.05),且VCAM-1 mRNA表达水平显著高于ICAM-1(P<0.05).组织镀银染色结果显示在感染C3H/HeJ小鼠肺、肝、肾组织内均出现入侵钩体.免疫组化结果显示,问号钩体感染小鼠后,肺、肝、肾组织内均出现ICAM-1和VCAM-1表达升高,但VCAM-1的表达量显著高于ICAM-1(P<0.05).结论 问号钩体感染可激活内皮细胞ICAM-1和VCAM-1的表达,且VCAM-1的表达量显著高于ICAM-1,从而介导特异性炎症细胞浸润至感染部位.
关键词： 问号钩端螺旋体 黏附分子 细胞间黏附分子-1 血管细胞黏附分子-1 -
问号钩端螺旋体对J774A.1和THP-1细胞NADPH氧化酶活性及ROS产生的影响
目的：探索问号钩端螺旋体(简称钩体)对小鼠和人单核-巨噬细胞株NADPH氧化酶活性及活性氧簇( ROS)产生的影响,了解不同宿主巨噬细胞对问号钩体的杀菌机制。方法采用问号钩体56601株感染J774A.1和THP-1细胞建立钩体细胞感染模型,光度法测定细胞NADPH氧化酶活性和超氧离子O-2水平,免疫荧光法检测细胞ROS水平变化。结果光度法检测结果显示,问号钩体赖株感染2 h、4 h、12 h和24 h后,J774A.1细胞NADPH氧化酶活性分别从感染前的0.6190μmol·min-1· mg-1上升至0.3055μmol · min-1· mg-1、6.1415μmol · min-1· mg-1、1.4871μmol·min-1·mg-1和0.9646μmol · min-1· mg-1；THP-1细胞 NADPH 氧化酶活性分别从感染前0.7235μmol·min-1·mg-1上升至0.8842μmol·min-1·mg-1、1.8971 μmol·min-1·mg-1、1.1254μmol·min-1·mg-1和0.5627μmol·min-1·mg-1；超氧离子结果显示,J774A.1细胞超氧离子水平由正常细胞的0.1890 μmol/L 分别上调至0.2363μmol/L、0.2977μmol/L、0.3240μmol/L 和0.3057μmol/L；THP-1细胞由正常细胞的0.1237μmol/L 分别上调至0.1493μmol/L、0.2490μmol/L、0.2700μmol/L和0.2727μmol/L；免疫荧光检测结果表示,钩体感染J774A.1和THP-1细胞2 h、4 h、12 h和24 h后,细胞ROS水平较正常细胞逐渐变强,24 h出现降低。结论问号钩体感染J774A.1和THP-1细胞NADPH氧化酶活性和超氧离子O-2均显著上调,且J774A.1细胞上调更明显,结果有助于揭示巨噬细胞杀灭问号钩体的分子机制。
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钩端螺旋体M23超家族金属内肽酶生物学活性及致病相关性的研究
目的 了解并确定问号钩端螺旋体黄疸出血型赖株LA2582 和LA2901 基因产物金属内肽酶活性及其致病相关性.方法 采用生物信息学软件分析LA2582 和LA2901 基因结构与功能.构建LA2582 和LA2901 基因胞外区原核表达系统,Ni-NTA 亲和层析法提纯目的重组表达产物rLA2582 和rLA2901.采用分光光度法检测rLA2582 和rLA2901 水解偶氮酪蛋白底物的活性.采用荧光分光光度法检测rLA2582 和rLA2901 水解Dabsyl-Leu-Gly-Gly-Gly-Ala-Edans 荧光标记五肽底物的活性并测定其Km 和Kcat 值.采用SDS-PAGE 和分光光度法分别检测rLA2582 和rLA2901 水解细胞外基质(ECM)分子Ⅰ型胶原蛋白(COL1)、纤维连接蛋白(FN)和刚果红标记弹性蛋白(ELN)的活性.采用实时荧光定量RT-PCR 和Western blot 法分别检测问号钩端螺旋体赖株感染人脐静脉内皮细胞(HUVEC)后LA2582 和LA2901 基因mRNA 和蛋白质表达水平.结果 LA2582 和LA2901 基因产物均为含信号肽和HXH 基质金属蛋白酶基序的锌离子依赖M23 家族Gly-Gly 金属内肽酶.rLA2582 和rLA2901 不能水解偶氮酪蛋白,但能水解荧光五肽底物,其Km 和Kcat 值分别为126. 54μmol/ L 和4. 67/ s 、190. 25 μmol/ L 和4. 86/ s .rLA2582 和rLA2901 具有水解COL1、FN 和ELN 的活性.问号钩体赖株感染HUVEC 后,LA2582 和LA2901 基因mRNA、蛋白质表达水平均显著升高(P<0. 05).结论 问号钩体赖株LA2582 和LA2901 基因产物是具有水解ECM 分子活性的锌离子依赖M23 金属内肽酶,与问号钩体侵袭力密切相关.
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问号钩端螺旋体感染过程中单核-巨噬细胞和中性粒细胞浸润差异及机制
目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)感染过程中单核-巨噬细胞和中性粒细胞浸润的差异及其机制.方法 采用问号钩体赖株感染C3H/HeJ小鼠后运用HE染色法检测小鼠肺、肝、肾组织病理变化.采用免疫组化法检测肺、肝、肾组织中外周血来源的CD11b阳性单核-巨噬细胞和Ly6G阳性中性粒细胞浸润的差异.采用趋化因子抗体芯片检测问号钩体感染小鼠血清中单核-巨噬细胞和中性粒细胞趋化因子表达水平变化.结果 问号钩体感染C3H/HeJ小鼠后,肺、肝、肾组织出现典型的钩体病病理变化,如炎性细胞浸润、肺出血、肝细胞坏死、肾充血等.免疫组化结果显示,问号钩体感染小鼠后,肺、肝、肾组织中出现大量外周血来源的单核-巨噬细胞浸润,而在以上组织中只检测到少量中性粒细胞浸润.小鼠趋化因子抗体芯片检测结果显示,问号钩体感染小鼠血清中单核-巨噬细胞趋化因子(I-309、MCP-1、MCP-5、MIP-1α和RANTES)表达水平与正常小鼠相比显著升高(P<0.05),而中性粒细胞趋化因子(KC、LIX和 MIP-2)表达水平无显著变化(P>0.05).结论 问号钩体感染过程中,单核-巨噬细胞而非中性粒细胞作为主要的浸润吞噬细胞在清除入侵问号钩体时起着重要作用.
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问号钩端螺旋体磷脂酶C鉴定及其诱导巨噬细胞凋亡机制
目的：确定问号钩端螺旋体（简称钩体） LB361基因产物磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C （ phosphatidylinositol phospholipase C ，L-PI-PLC）功能及其诱导巨噬细胞凋亡的作用与机制。方法采用生物信息学技术分析问号钩体赖型赖株LB361基因序列中PI-PLC结构功能域。采用原核表达系统表达该基因产物（ rL-PI-PLC）。采用IP3荧光偏振试验了解rL-PI-PLC水解PIP2底物产生IP3的活性。采用实时荧光定量RT-PCR及Western blot法分别检测问号钩体赖株感染人THP-1巨噬细胞时LB361基因转录、表达及分泌情况。构建LB361基因转染THP-1细胞株，分别采用激光共聚焦显微镜法和流式细胞术，检测LB361基因产物THP-1通过IP3引起内质网钙释放，从而导致细胞胞内游离钙离子浓度（[ Ca2＋] i）升高并诱导细胞凋亡的作用。结果 rL-PI-PLC能水解PIP2产生IP3，其Km和Kcat值分别为199μmol/L和8．566×10-5 S-1。问号钩体赖株感染THP-1细胞后，LB361-mRNA及L-PI-PLC蛋白表达水平显著升高并外分泌。与未转染正常细胞比较，LB361基因转染THP -1细胞中IP3浓度及[ Ca2＋] i明显升高，从而引起部分 THP-1细胞发生[ Ca2＋] i 依赖性凋亡。结论问号钩体LB361基因产物是磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C，该酶在问号钩体感染巨噬细胞过程中可引起[ Ca2＋] i升高而导致细胞凋亡。
关键词： 问号钩端螺旋体 磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C 巨噬细胞 胞内游离钙离子浓度 细胞凋亡 -
钩端螺旋体脂多糖诱生炎性细胞因子及小鼠感染组织中单核-巨噬细胞浸润
目的：了解问号钩端螺旋体脂多糖( L-LPS)诱导人单核细胞或小鼠单核-巨噬细胞产生炎性细胞因子的作用以及问号钩端螺旋体感染后小鼠内脏组织中外周血单核-巨噬细胞浸润情况。方法采用酚水法提取问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型赖株L-LPS并用鲎试验测定其内毒素活性。采用细胞因子抗体芯片，检测L-LPS作用或问号钩端螺旋体赖株感染后人THP-1单核细胞株或小鼠J774A.1单核-巨噬细胞产生细胞因子情况。分别采用HRP标记外周血单核-巨噬细胞特异性CD68抗体免疫组化法和细胞因子抗体芯片，分别检测问号钩端螺旋体赖株感染C3H/HeJ小鼠肺、肝、肾组织中单核-巨噬细胞浸润情况以及血清细胞因子水平。结果 L-LPS凝固鲎试剂活性约为大肠埃希菌脂多糖(E-LPS)的1/5。 L-LPS作用后THP-1或J774A.1细胞分别有29和9种细胞因子水平明显升高(P<0.05或P<0.01)，其中主要促炎细胞因子为IL-6和TNF-α，同时包含多种单核-巨噬细胞趋化因子表达增强。问号钩端螺旋体感染细胞上清或感染小鼠血清中细胞因子检测结果与L-LPS作用细胞相似。问号钩端螺旋体赖株感染小鼠后，肺、肝、肾组织中出现大量外周血单核-巨噬细胞浸润。结论 L-LPS具有很强的诱导单核-巨噬细胞上调多种促炎细胞因子和单核-巨噬细胞趋化因子表达的作用，单核-巨噬细胞是问号钩端螺旋体感染小鼠内脏组织中浸润的主要炎症细胞。
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钩端螺旋体 LPS 和外膜蛋白诱导巨噬细胞凋亡及其与 Fas／FasL 相关性研究
目的：了解致病性问号钩体螺旋体（简称钩体）脂多糖（ L-LPS）和外膜蛋白（ L-OMP）诱导J774A．1小鼠巨噬细胞死亡及其与Fas/FasL相关性。方法分别采用酚水法和Triton X-114法从问号钩体黄疸出血群赖型赖株中提取L-LPS和L-OMP。采用流式细胞术检测紫外线灭活前后问号钩体赖株、多黏菌素B（PMB）处理前后L-LPS、蛋白酶K（PK）作用前后L-OMP诱导J774A．1细胞凋亡及坏死情况。采用siRNA沉默J774A．1细胞Fas或FasL基因并用实时荧光定量RT-PCR检测靶基因沉默效果。采用流式细胞术测定L-LPS或L-OMPs诱导Fas或FasL基因沉默J774 A．1细胞凋亡的作用。结果紫外线灭活前后问号钩体赖株可引起相似的J774A．1细胞早期凋亡率（55．6％和47．1％）和晚期凋亡/坏死率（7．9％和7．6％）。100 ng L-LPS或100μg L-OMP作用1×105 J774A．1细胞4 h后，早期凋亡率和晚期凋亡/坏死率分别为40．4％和34．0％、7．5％和6．9％，但等量PMB预处理L-LPS或PK预处理L-OMP诱导细胞凋亡或坏死的作用消失。 Fas或FasL基因沉默后，L-LPS诱导的J774A．1细胞早期凋亡率均显著下降（P＜0．05），L-OMP仅使Fas基因沉默J774A．1细胞早期凋亡率有所下降（P＜0．05）。结论 L-LPS和L-OMP可诱导Fas/FasL相关巨噬细胞凋亡，从而有利于问号钩体在宿主体内建立有效感染。
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问号钩端螺旋体过氧化物还原酶AhpC在氧化应激中的功能研究
目的 确定问号钩端螺旋体(简称钩体)赖株AhpC蛋白的过氧化物还原酶活性及其在问号钩体感染宿主细胞过程中是否具有抵抗氧化应激的功能.方法 构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株ahpC基因原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rAhpC,检测其酶学活性和保护DNA不被氧化的功能.用定点突变方法验证AhpC的过氧化半胱氨酸和还原性半胱氨酸.经不同浓度的Conoidin A抑制问号钩体过氧化物还原酶活性后,比较抑制前后构体内的活性氧自由基(reactive oxygen species,ROS)水平和钩体存活率的变化.结果 所构建的原核表达系统能有效表达rAhpC.rAhpC具有过氧化物还原酶的活性,其催化反应依赖于硫氧还蛋白和硫氧还蛋白还原酶系统.AhpC分子中含有的两个半胱氨酸对维持酶的活性起着至关重要的作用,其中Cys47是AhpC的过氧化半胱氨酸,而Cys167是还原性半胱氨酸.AhpC能够保护质粒DNA免遭过氧化氢的氧化损伤.经不同浓度的Conoidin A抑制问号钩体的过氧化物还原酶的活性后,钩体在巨噬细胞内的存活率明显下降,并且呈现出剂量依赖的效应,表明钩体存活率的降低与钩体的过氧化物还原酶活性丧失从而无法有效降解构体内活性氧水平有着密切的关系.结论 问号钩体的AhpC具有过氧化物还原酶的活性,能抵抗宿主细胞引起的氧化损伤,与钩体在巨噬细胞内的存活有关.
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问号钩端螺旋体鞘磷脂酶类溶血素基因功能分析及其感染细胞后转录水平变化
目的 了解问号钩端螺旋体(简称钩体)鞘磷脂酶类溶血素基因sph1～sph4产物溶血活性及其感染细胞后转录水平的变化.方法 以致病性问号钩体黄疸出血群赖型赖株、波摩那群波摩那型罗株和非致病性双曲钩体三宝垄群Patoc型Patoc Ⅰ株基因组DNA为模板,采用PCR扩增全长sph1～spl4基因片段,扩增产物T-A克隆后测序.构建sph1～sph4基因原核表达系统,采用SDS-PAGE检测目的 重组蛋白rSph1～rSph4的表达情况,Ni-NTA亲和层析柱提纯rSph1～rSpM.采用绵羊血平板对rSph1～rSph4溶血活性进行鉴定,实时荧光定量RT-PCR检测问号钩体赖株感染J774A.1细胞前后sph1～sph4基因转录水平的变化.结果 问号钩体赖株和罗株基因组DNA中均能扩增sph1～sph4基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.与报道的相应基因序列比较,所克隆的sph1～sph4基因核苷酸序列相似性均为100%.所构建的原核表达系统能分别表达目的蕈组蛋白rSph1～rSph4.rSph1～rSph4均有溶血活性,其中以rSph2溶血活性强.问号钩体赖株感染J774A.1细胞后,sph1～sph4基因转录水平均上调,其中sph2和sph4基因mRNA水平上调更为明显.结论 sph1～sph4基因仅存在于致病性问号钩体中,其表达产物有溶血活性.问号钩体赖株感染细胞后sph1～sph4基因转录水平的上调,提示此类鞘磷脂酶类溶血素可能在问号钩体感染宿主过程中有重要作用.
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问号钩端螺旋体脂蛋白LipL32膜定位及其免疫应答
目的 确定问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性脂蛋白抗原LipL32膜定位及其自然抗体应答情况和抗体类型.方法 IPTG诱导目的 重组蛋白rLipL32-1和rLipL32-2表达,Ni-NTA亲和层析法提纯rLipL32.采用显微镜凝集试验(MAT)检测四川地区钩体患者血清标本及rLipL32兔抗血清与我国问号钩体参考标准株的交叉凝集情况.采用胶体金免疫电镜技术对LipL32进行膜定位.建立基于rLipL32的ELISA,检测钩体患者血清中特异性抗体类型及其水平.结果 黄疸出血群是四川地区主要的优势钩体血清群.rLipL32兔抗血清均能与我国问号钩体参考标准株发生MAT效价为1∶80～1∶320的交叉凝集反应.LipL32是位于钩体外膜表面的蛋白质分子.156例MAT阳性钩体患者血清标本中,rLipL32-1和rLipL32-2特异性IgM阳性率分别为91.0%～92.9%和90.4%～92.3%,特异性IgG阳性率分别为99.4%和97.4%～98.1%.结论 LipL32是问号钩体属特异性表面蛋白抗原.自然感染钩体时,LipL32-1和LipL32-2可诱导机体产生IgM和IgG两类血清抗体.rLipL32-1和rLipL32-2可作为研制检测试剂盒的候选抗原.
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问号钩端螺旋体毒力相关蛋白InvA转录和表达特征的研究
目的 确定我国不同基因种问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株携带毒力相关基因invA的情况,了解问号钩体赖株感染细胞前后invA基因转录和表达水平的变化.方法 采用PCR检测4个不同基因种问号钩体株及双曲钩体Patoc Ⅰ株invA基因.克隆问号钩体全长invA基因并测序,构建问号钩体黄疸出血群赖型赖株invA基因原核表达系统.Ni-NTA亲和层析法提纯目的重组蛋白rlnvA后免疫家兔获得抗血清,免疫双扩散法检测其效价.建立问号钩体赖株感染人胚肾上皮细胞HEK293模型,采用荧光定量RT-PCR和Western blot分别检测问号钩体赖株感染HEK293细胞前后invA基因的转录和表达水平的变化.结果 4个不同基因种的问号钩体株均含有invA基因,双曲钩体Patoc Ⅰ株则否.4株不同基因种的问号钩体invA基因核苷酸和氨基酸序列相似性分别为99.33%～100%和98.66%～100%.所构建的原核表达系统能有效地表达rInvA.rInvA兔抗血清免疫双扩效价为1:16.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min以后可大量黏附于细胞表面.问号钩体赖株感染HEK293细胞30 min时,invA基因mRNA水平明显上调,45 min时达到峰值,然后逐渐下降.问号钩体赖株感染HEK293细胞后45 min和60 min时可检出InvA蛋白,感染前及感染90 min以后检测结果均为阴性.结论 invA基因是致病性问号钩体所特有的基因.invA基因具有宿主细胞接触式表达及瞬时表达的特点,与问号钩体侵入宿主细胞密切相关.
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问号钩端螺旋体血清群LipL41基因型分析及其表达产物的免疫学鉴定
目的确定我国15群15株问号钩端螺旋体(简称钩体)参考标准株和2群2株双曲钩体国际标准株携带LipL41基因情况,构建该基因的原核表达系统,鉴定表达产物的免疫原性. 方法常规酚-氯仿法提取上述17株钩体基因组DNA,高保真PCR扩增全长LipL41基因片段,T-A克隆后测序分型.构建LipL41基因原核表达系统,SDS-PAGE检测重组目的蛋白(rLipL41)表达情况.分别用钩体属特异性TR/patocⅠ抗原、rLipL41兔抗血清的Western blot鉴定其免疫反应性和抗原性.分别用显微镜凝集试验(MAT)、钩体黏附J774A.1细胞模型检测兔抗rLipL41血清的交叉凝集效价和黏附阻断作用. 结果 15株问号钩体均有LipL41基因,并可分为LipL41/1和LipL41/2两种基因型,2株双曲钩体则否.11个LipL41/1基因和4个LipL41/2基因克隆之间的核苷酸和氨基酸序列相似性分别为88.61%～88.67%和93.24%～97.18%.所构建的原核表达系统rLipL41/1和rLipL41/2的表达量分别占钩体总蛋白的30%和40%.rLipL41/1和rLipL41/2均能与TR/patocⅠ抗血清发生结合反应,免疫家兔能产生抗体.rLipL41/1和rLipL41/2兔抗血清对上述15株问号钩体MAT效价为1∶8～1∶128、1∶16～1∶256稀释时均能有效地阻断钩体对细胞的黏附. 结论我国主要的15群问号钩体代表株均有LipL41/1或LipL41/2基因.所构建原核表达系统能高效表达rLipL41/1和rLipL41/2.rLipL41/1和rLipL41/2是具有良好抗原性和免疫反应性、广泛存在于不同血清群问号钩体表面的蛋白抗原.
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不同毒力的问号钩端螺旋体对Vero及J774A.1细胞的黏附和内化
目的探讨问号钩端螺旋体对传代细胞黏附和内化的能力及其差异. 方法实验中采用非洲绿猴肾成纤维细胞(Vero)和小鼠单核巨噬样细胞(J774A.1)细胞株.采用透射电镜、扫描电镜和Fontana镀银染色法,观察问号钩端螺旋体强毒株黄疸出血群赖型56601、弱毒株波摩那群波摩那型56608黏附细胞及内化能力及其差异,采用腐生性的双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型PatocⅠ株作为对照. 结果问号钩端螺旋体黄疸出血群赖型56601株和波摩那群波摩那型56608株均能以一端或两端黏附于Vero及J774A.1细胞.钩体56601株和56608株对J774A.1的黏附率分别为49%和46.9%,对Vero细胞黏附率分别为24.2%和22.9%.钩体56601株和56608株可侵入上述2株细胞,在胞质内形成典型的吞噬泡.钩体56601株还可侵入宿主细胞核内,56608株则否.双曲钩端螺旋体三宝垄群patoc型PatocⅠ株不能黏附和侵入细胞. 结论两株受试的不同毒力问号钩体株均能黏附细胞,并以内化方式侵入细胞.细胞株的差异可明显影响钩体黏附和内化能力.问号钩体毒力的强弱可能与黏附能力无关,而与其侵入胞核的能力密切相关.
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问号钩端螺旋体经线粒体相关信号通路诱导巨噬细胞凋亡的研究
目的 确定线粒体相关信号转导途径在问号钩端螺旋体(简称钩体)诱导小鼠单核-巨噬细胞凋亡过程中的作用.方法 建立问号钩体黄疸出血群赖株诱导小鼠单核-巨噬样细胞株J774A.1凋亡模型.采用透射电镜观察感染细胞线粒体病变情况,JC-1染色法检测感染细胞线粒体膜电位变化,荧光探针DCFH-DA检测感染细胞内活性氧(ROS)水平.采用试剂盒检测感染细胞caspase-8和caspage-9活性变化.流式细胞术检测感染细胞凋亡情况以及cagpage阻断剂阻断凋亡的效果.采用Western blot检测线粒体内和胞质中的细胞色素c(cytc)以及凋亡诱导因子(Air)、核酸内切酶G(EndoG)和Smac水平.应用免疫荧光染色法检测AIF和EndoG从细胞质至核内的转位.结果 问号钩体赖株可诱导J774A.1细胞凋亡.感染细胞的线粒体有明显病变,线粒体膜电位降低且胞内活性氧水平升高.感染细胞caspage-8活化,caspase-9则否,但caspase阻断剂不能完全阻断细胞凋亡.感染细胞AIF和EndoG从线粒体释放至胞质并转位至细胞核内.未检测到感染细胞胞质内CytC水平升高及Smac的释放.结论 线粒体可通过非caspase途径的AIF和EndoG参与问号钩体诱导单核一巨噬细胞凋亡的过程.
关键词： 问号钩端螺旋体 细胞凋亡 线粒体 非caspage依赖凋亡途径 -
问号钩端螺旋体铁离子调节蛋白A的免疫原性及保守性研究
目的 克隆表达和鉴定问号钩端螺旋体(L.interrogans,简称钩体)黄疸出血群赖型赖株中铁离子调节蛋白A(IRPA),研究IRPA的免疫原性和在不同钩体菌种中的保守性,探讨其在致病和疫苗研究中的意义.方法 生物信息学软件分析预测IRPA的特征.构建原核表达质粒pQE31-IRPA,经IPTG诱导后用SDS-PAGE及Western blot鉴定表达情况.用表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,Western blot检测其免疫原性和在不同血清型钩体中的保守性.ELISA和Western blot检测钩体全菌兔抗血清中的IRPA抗体.结果 生物信息学预测结果显示,IRPA是可能位于外膜的脂蛋白,在钩体内有多个蛋白可能与之相互作用.成功克隆表达了重组质粒pQE31-IRPA,重组蛋白能刺激BALB/c小鼠产生抗体(效价为1:32 000),并能与相应抗体反应,具有良好的免疫原性.在15株不同血清型的问号钩体及1株双曲钩体(L.biflex)中均可检测到重组蛋白的表达,并在钩体全菌兔抗血清中检测到其抗体.结论 IRPA具有良好的免疫原性和保守性,为进一步研究其在钩体病中的作用机制及其作为候选基因疫苗的研究奠定了基础.
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问号钩端螺旋体属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21抗原表位预测及鉴定
目的 筛选问号钩端螺旋体(简称钩体)属特异性外膜蛋白OmpL1和LipL21有效T和B细胞联合抗原表位,为研制多抗原肽(multiple antigenic peptide,MAP)疫苗提供基础.方法 采用生物信息学方法预测OmpL1和LipL21分子中T和B细胞联合抗原表位.采用PCR扩增候选联合抗原表位片段并分别构建其噬菌体展示系统.分别以rOmpL1或rLipL21、黄疸出血群赖株、钩体患者抗血清为一抗,采用Western blot检测各抗血清与目的表位的免疫反应性及其强度.结果 通过抗原表位预测,选择了高分值的4个OmpLl和2个LipL21联合表位.经扩增获得了预期的各抗原表位片段,各目的表位序列均准确插入噬菌体PⅢ蛋白N端并有效表达.各抗血清均能识别上述6个联合表位.其中LipL21的97～112和176-184表位对任一抗血清均显示相似强度的杂交条带.综合4个OmpL1表位对3种抗血清的不同Western blot结果及其实际意义,杂交信号从强到弱依次为173～191、87～98、297～320和59～78表位.结论 所研究的6个联合表位均分别为LipL21和OmpL1的有效抗原表位,其中LipL21的97～112、176～184和OmpL1的87～98、173～191表位可应用于钩体MAP疫苗研制.
