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硫氧还蛋白和氧化/还原因子的融合荧光蛋白载体的构建及在293T细胞中的分布
目的 构建硫氧还蛋白和氧化/还原因子的融合荧光蛋白真核表达载体,并在293T细胞中得到表达和定位.方法 以RT-PCR方法从PC12细胞中克隆氧化/还原因子(APE/ref-1)的cDNA,然后亚克隆构建APE/ref-1-GFP融合真核表达载体.以PCR方法将质粒pQE30-TRX上的硫氧还蛋白cDNA亚克隆到pDsred1-1质粒上,然后将硫氧还蛋白-DsRed融合基因序列亚克隆到pCMV5质粒上,构建硫氧还蛋白-DsRed融合真核表达载体.通过磷酸钙转染293T细胞,以荧光显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位.结果 成功构建了硫氧还蛋白-DsRed和APE/ref-1-GFP融合表达载体,并在293T细胞中得到表达,APE/ref-1-GFP融合蛋白定位在293T细胞核内;硫氧还蛋白-DsRed融合蛋白定位在293T细胞质和细胞核内.结论 为进一步研究硫氧还蛋白和APE/ref-1之间的动态相互作用奠定基础.
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不同红色荧光蛋白在酵母细胞中的表达效果分析
目的 比较不同红色荧光蛋白基因在酵母细胞中的表达效果.方法 利用分子生物学方法,构建了4种红色荧光蛋白(DsRed)基因酵母报告载体,分别是pGPD-DsRed、pGPD-DsRed-express-2、pGPD-yDsRed和pGPD-yDsRed-express-2,后两者含有酵母细胞偏好性的密码子,将4种DsRed酵母报告载体转入W303-1A酵母细胞,利用倒置荧光显微镜观察DsRed的表达,并用多功能酶标仪测酵母细胞的发光强度.结果 各红色荧光发光强度明显不同,其中DsRed-express-2发光强,其次是yDsRed-express-2,yDsRed发光强度弱.结论 在酵母细胞中红色荧光蛋白的强度与密码子偏好性无关;定量红色荧光蛋白表达强度好选用DsRed-express-2报告基因.
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人EZH2基因编码区及3′非翻译区融合蛋白重组慢病毒表达载体构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建携带人EZH2基因编码区(coding region,CDS)及3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)融合红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)重组慢病毒表达载体,使mCherry-EZH2融合蛋白在293T细胞中稳定表达.方法 运用In-Fusion定向克隆技术构建人EZH2基因CDS区及3′UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体,测序无误后抽提质粒,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.Western blot检测mCherry-EZH2的表达.结果 测序证实重组慢病毒表达载体基因序列完全正确;病毒颗粒包装成功,滴度为1.59×109 IU/ml;Western blot检测293T细胞中可以表达mCherry-EZH2融合蛋白.结论 成功构建人EZH2基因CDS区及3′UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体及病毒,其mCherry-EZH2可以在293T细胞中稳定表达.为进一步分析可能调控EZH2基因CDS区及3′UTR表达的miRNA奠定前期实验基础.
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小鼠膀胱癌红色荧光移植瘤模型建立及荧光影像学特点分析
目的 研究红色荧光蛋白(DsRed)标记小鼠膀胱癌生长转移的分子荧光影像学特征.方法 采用脂质体2000介导基因转染法将chickenβ-actin-DsRed-Neo载体转染到小鼠膀胱癌BTT739细胞株;G418筛选后获得稳定表达DsRed的单克隆细胞(BTT739-DsRed);615小鼠24只随机分3组,后肢皮下注射细胞悬液,第1、2组注射BTT739-DsRed细胞,第3组注射BTT739细胞,建立移植瘤模型.MAESTRO活体成像仪设定激发光波长560～580 nm,发射光波长590～610 nm,曝光时间5000 ms,连续观察4周,第2组每周处死小鼠并剖开成像,记录肿瘤生长转移的荧光影像,测定肿瘤大小及荧光信号值.统计分析肿瘤大小与荧光信号值,全身成像与剖开成像之间的关系.结果 第1周观测到发红色荧光的肿瘤,第2周观测到肿瘤中央局部荧光缺失,病理证实为肿瘤坏死组织及少量结缔组织,第4周观测到局部淋巴结转移,未见远处转移.第1组连续4周肿瘤荧光信号值依次为(89±18)、(122±55)、(133±69)、(715±343)counts;肿瘤大小依次为(13±4)、(45±22)、(83±29)、(253±67)mm2;第2组全身成像4周肿瘤大小依次为(12±3)、(50±23)、(90±29)、(290±74)mm2,剖开成像依次为(12±5)、(72±30)、(141±43)、(524±237)mm2;肿瘤大小与荧光信号强度呈线性正相关(r=0.74,t=3.97,P<0.05),全身成像与剖开成像肿瘤大小呈线性正相关(r=0.97,t=10.00,P<0.05),全身成像测得的肿瘤大小为剖开后成像的(70.85±17.13)%. 结论小鼠膀胱癌红色荧光移植瘤模型可以直观、连续、敏感地观察肿瘤的生长和转移,随着肿瘤增大,荧光范围也增大,肿瘤发生坏死后荧光消失,肿瘤发生转移后红色荧光表达亦随之转移.
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红色荧光蛋白标记的胰腺癌裸鼠原位移植瘤转移模型的建立
目的 建立稳定、高表达红色荧光蛋白(RFP)标记的胰腺癌裸鼠原位移植瘤自发转移模型.方法 将稳定、高表达RFP的人胰腺癌细胞株SW1990-RFP注射至裸鼠皮下,建立人胰腺癌裸鼠皮下移植瘤模型.通过外科手术原位移植裸鼠皮下荧光肿瘤组织小块,建立人胰腺癌裸鼠原位移植瘤自发转移模型.应用整体荧光成像系统评价人胰腺癌裸鼠原位移植瘤模型肿瘤转移及微转移的发生情况.结果 成功建立12只人胰腺癌裸鼠原位移植瘤自发转移模型,建模成功率为100%.应用整体荧光成像系统可以实时监测原发肿瘤的牛长状况以及在肿瘤生长早期即可检测到各脏器微小转移的发生.结论 本实验所建立的RFP标记的胰腺癌裸鼠原位移植瘤自发转移模型稳定、可靠,可以在体外无创性动态观察肿瘤的发生、发展,具较强的灵敏性及特异性.
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慢病毒介导的AQP8稳定表达对子宫颈癌SiHa细胞迁移能力的影响
水通道蛋白(aquaporins,AQP)是一个疏水的、小而完整的膜蛋白家族,广泛表达于动植物体内,相对分子质量约为30 000,迄今为止,哺乳动物体内共发现有13个AQP成员(AQP0～12)[1].研究提示,AQP作为一个关键因素直接参与人类恶性肿瘤的发生过程[2],与正常人绒毛滋养层细胞相比,AQP8在绒毛膜癌(绒癌)细胞系JAR细胞中表达异常上调,可能是导致绒癌发生的原因之一[3].肿瘤细胞的迁移是肿瘤浸润和转移的关键步骤.目前已报道至少有12种肿瘤细胞在人或鼠体内表达AQP.本研究使用红色荧光蛋白(RFP)标记的重组慢病毒载体将AQP8转染入宫颈癌细胞系SiHa细胞,建立稳定表达AQP8的SiHa细胞系,探讨AQP8对SiHa细胞体外迁移能力的影响.
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绿、红双色荧光蛋白在活体肿瘤细胞成像中的应用
荧光蛋白成像技术的诞生为细胞生物体内研究提供了新的机遇.该技术已经在很多领域得到广泛应用,其自身也在不断发展.近年来,多色荧光蛋白标记成像技术受到重视,尤其是绿色和红色荧光蛋白,已在很多研究工作中被采用,对该方面的研究进行综述.
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变形链球菌recA基因启动子荧光蛋白表达载体的构建
目的 构建由recA基因启动子启动的红色荧光蛋白穿梭表达载体,研究变形链球菌recA基因表达的特点,以期为不同致龋环境中变形链球菌致龋毒力因子基因的表达提供参照.方法 以变形链球菌(UA159)基因组DNA为模板,扩增recA基因启动子,采用双酶切反应连接入载体pDsRed2-N1,构建原核表达载体pRred;通过酶切重组人穿梭载体pDL276,构建红色荧光蛋白表达载体pLRred.结果 经酶切鉴定目的质粒片段插入无误,同时重组载体pLRred转化菌荧光观测结果提示,重组载体pLRred构建成功.结论 本项研究中构建的recA基因启动子红色荧光蛋白同源重组克隆载体正确,可应用于recA基因表达的研究,同时可为研究变形链球菌致龋基因的表达提供内参照.
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pDsRed1-N1基因核转染兔原代骨髓基质细胞的实验研究
目的探讨以近发展起来的核转染技术直接将编码红色荧光蛋白DNA质粒转染到兔原代骨髓基质细胞细胞核内进行基因修饰的可行性.方法从兔股骨抽取骨髓,密度梯度离心法获取原代骨髓基质细胞.以NucleofectorTM技术转染pDsRed1-N1(DsRed组),以同期培养未转染的细胞作为对照组.测定细胞的活力、贴壁率、生长曲线以及转染的效率.结果在转染后48h成功发现DsRed的表达.两组细胞具有相似的形态学变化、贴壁率以及生长曲线.DsRed的表达逐渐增强,至第10天达到高峰(54.2%),观察1个月未发现表达减弱.结论 pDsRed1-N1基因核转染对兔原代骨髓基质细胞的体外增殖无明显影响; DsRed可以作为兔骨髓基质细胞有效的基因表达标记; NucleofectorTM技术是一种简易而高效的转染兔原代骨髓基质细胞的方法.
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His-TAT-mCherry融合蛋白的跨膜转导及其在细胞内的定位
目的 构建在原核中表达的人类免疫缺陷病毒转录活化因子(HIV-TAT)红色荧光蛋白(mCherry)融合表达载体,荧光显微镜观察HW-TAT的跨膜转导及其在细胞内的定位,为进一步研究HW-TAT的跨膜转导机制及其定位提供重要工具. 方法 采用基因重组技术构建含HIV-TAT以及红色荧光蛋白的质粒pET14b-His-TAT-mCherry,对阳性克隆进行PCR、酶切和测序鉴定,将该质粒转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞,使其在体外表达,并进行纯化、除菌.将纯化的His-TAT-mCherry融合蛋白与Hela细胞共同孵育,荧光显微镜下观察. 结果 PCR、双酶切和DNA测序证明所构建质粒正确;表达纯化出了高纯度的His-TAT-mCher-ry融合蛋白.荧光显微镜下见Hela细胞中红色荧光蛋白主要分布在胞质中,细胞膜上也有一定分布. 结论 成功构建了pET14b-His-TAT-mCherry原核表达质粒,纯化了高纯度的His-TAT-mCherry融合蛋白,该蛋白在哺乳动物细胞中有跨膜转导活性,为研究HIV-TAT的跨膜转导机制提供了一个重要的工具.
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红色荧光蛋白的研究进展
红色荧光蛋白(drFP583)是人们从珊瑚虫Discosoma genus中克隆的一种与绿色荧光蛋白(GFP)同源的荧光蛋白,在紫外光的照射下可发射红色荧光,有着广泛的应用前景;但它自身的缺点如寡聚化、成熟缓慢等限制了它的进一步应用.因此,人们对它进行了一系列修饰和改进,得到了寡聚化程度低(甚至单体)和成熟速率快的突变体,Clontech公司已将一种突变体商业化,命名为DsRed.本文就DsRed的理化性质、各种突变体及应用方面的研究进展进行综述.
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α平滑肌肌动蛋白红色荧光蛋白报告基因载体的构建及其在细胞中的表达
目的 构建α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)启动子驱动的红色荧光蛋白报告基因载体,为研究细胞内α-SMA的基因表达调控提供重要工具.方法 克隆并构建含α-SMA启动子区的红色荧光报告质粒pDsRed-SMAp;用脂质体瞬时转染上皮细胞A549,观察α-SMA启动子对转化生长因子(TGF-β1)刺激的反应.结果 酶切和DNA测序证明所构建的红色荧光蛋白报告基因载体是pDsRed-SMAp重组载体；该表达载体在上皮细胞静息状态下表达水平很低,经TGF-β1刺激后,在荧光显微镜下可看到高亮度的红色荧光.结论 成功构建了α-SMA启动子驱动的红色荧光蛋白报告质粒pDsRed-SMAp,对生理相关刺激有很好的反应,可有效地用于α-SMA基因表达调控机制的研究.
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造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠的筛选
目的 对五种荧光转基因小鼠造血干细胞中的荧光标记细胞进行分析,筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠,为造血干细胞分化机制体内示踪研究提供理想的动物模型.方法 采用活体荧光影像系统对两种红色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1和CAG-DsRed-2) ZLFILAS和三种绿色荧光转基因小鼠品系C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1、CAG-EGFP-2和CAG-EGFP-3)ZLFILAS的荧光标记进行比较;采用流式细胞术检测各转基因小鼠的骨髓lin(-)c-kit(+)Sea-1+(LSK)造血干细胞荧光标记细胞比率,根据标记比率筛选造血干细胞全标记红色和绿色荧光转基因小鼠.结果 活体荧光影像分析表明转基因小鼠均系统性表达红色或绿色荧光.流式细胞术检测表明LSK造血干细胞中高度表达红色和绿色荧光,其中,C57BL/6J-TgN(CAG-DsRed-1)ZLFILAS和C57BL/6J-TgN(CAG-EGFP-1)ZLFILAS的造血干细胞全部为荧光标记细胞.结论 筛选获得在造血干细胞中全标记的红色和绿色荧光转基因小鼠,可为造血干细胞体内研究提供有效示踪工具.
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慢病毒载体法制备红色荧光蛋白转基因小鼠
目的 利用慢病毒介导的转基因方法制备红色荧光蛋白(mRFP)转基因小鼠,并建立转基因小鼠的技术平台.方法 将携带mRFP基因的慢病毒注入ICR鼠单细胞受精卵卵周隙以感染受精卵,胚胎移植进假孕母鼠以获得仔代鼠,然后应用小动物活体成像仪、体视荧光显微镜和PCR等鉴定并获得mRFP转基因鼠.结果 移植卵周隙注射有慢病毒的胚胎40枚给2只假孕母鼠,共获得仔鼠6只;利用体视荧光显微镜检测mRFP表达,在蛋白水平证实6只F0代中,2只 (R3和 R4) 鼠耳高表达mRFP,其余的弱表达mRFP(R1、R2和R5)或荧光强度(R6)与野生型ICR鼠无明显差别,而DNA水平检测证实,6只F0代中,5只(R1、R2、R3、R4和 R5)基因组中整合有外源转基因hUb-mRFP,预示基因型鉴定结果很好验证了体视荧光显微镜鉴定结果.此外,mRFP转基因首建鼠基因组中整合的mRFP基因可稳定遗传和表达.结论 建立了慢病毒法快速制备转基因小鼠的技术平台,这为针对不同基因建立相应转基因小鼠以实现恒定或条件性的转基因过表达或RNA干涉 (RNAi),并进而在体内解析相应基因功能和建立人类疾病模型等奠定了坚实基础.
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人结直肠癌细胞HCT116红色和绿色荧光标记肿瘤模型的建立
目的 筛选表达绿色荧光蛋白和红色荧光蛋白基因的人的单克隆结直肠癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长建立一种新的肿瘤动物模型.方法 以脂质体2000介导chicken β-actin-GFP-neo和chicken β-actin-DsRed-neo转染人结直肠癌细胞HCT-116,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达红色和绿色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养.BALB/CA-nu裸鼠皮下接种1×106个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况.结果 获得了稳定表达GFP、DsRed的人结肠癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长过程,肿瘤的发光随着观察时间的延长而增加.结论 红色和绿色荧光蛋白能够在人结直肠癌细胞HCT-116中长期稳定表达,用红色和绿色荧光蛋白标记的人结直肠癌细胞HCT-116建立的裸鼠肿瘤模型为进一步研究结肠肿瘤和相应的药物筛选提供了一种简便、可行的新方法 .
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SW1990和Capan-2红色荧光标记胰腺癌移植肿瘤模型的建立和比较
目的 建立稳定表达红色荧光蛋白基因的人胰腺癌细胞系,为体内监测肿瘤的早期生长及抗肿瘤药物的药效评价建立一种新的肿瘤动物模型.方法以Lipofectamine 2000介导chicken β-actin-RFP-NEO转染人胰腺癌细胞SW1990和Capan-2,经梯度浓度G418筛选获得稳定表达红色荧光蛋白的细胞克隆并扩大培养.BALB/cA-nu裸鼠皮下接种1×106个发光细胞使其成瘤,活体荧光成像系统观察肿瘤的生长情况.结果 获得了稳定表达RFP的两种不同的人胰腺癌细胞株,将其接种到裸鼠体内可成瘤,利用活体成像系统观察了肿瘤的生长动态过程,并且SW1990肿瘤细胞的生长速度较Capan-2细胞快.结论 用红色荧光蛋白标记的人胰腺癌细胞建立的裸鼠肿瘤模型为胰腺癌的研究和相关药物筛选提供了可进行荧光影像活体、动态分析的动物模型.
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荧光蛋白在肿瘤分子影像研究中的应用
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是在水母中发现的新型报告分子,该蛋白及其衍生物能在多种生物体内表达并发出荧光,是目前在生物学中研究和开发应用得广泛的蛋白质之一.尤其是在肿瘤的研究中,荧光蛋白的分子影像可为深入揭示肿瘤发生发展的病理过程的机制,以及对其治疗进行实时、动态、细致、无创、靶向性的探测和跟踪提供有效手段.
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荧光标记技术在肿瘤模型研究中的应用
目的 利用绿色荧光小鼠和红色荧光蛋白标记肿瘤细胞,建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,并建立活体荧光成像和荧光显微镜成像在整体和细胞水平直接观察肿瘤的技术.方法 将小鼠B16黑色素瘤细胞接种到绿色荧光蛋白转基因小鼠皮下,建立GFP小鼠肿瘤模型.以红色荧光蛋白作为标记基因导入小鼠黑色素瘤细胞B16细胞,建立稳定表达红色荧光蛋白的细胞株.将表达红色荧光蛋白B16细胞接种到绿色荧光转基因小鼠皮下,建立双荧光小鼠肿瘤模型.用荧光显微镜和活体荧光成像系统检测小鼠肿瘤的发生发展.结果 分别建立了GFP小鼠肿瘤模型和双色荧光小鼠肿瘤模型.利用活体荧光影像仪可以观察双色荧光小鼠模型中受体绿色荧光组织和红色荧光移植肿瘤相互融合.利用荧光显微镜,可以观察到肿瘤内绿色荧光标记的来源于受体小鼠的血管和免疫细胞.经香菇多糖刺激的GFP小鼠肿瘤模型的移植瘤组织中,来源于受体小鼠绿色荧光标记的免疫细胞明显多于经生理盐水刺激的对照小鼠.结论 利用绿色荧光小鼠和红色荧光RFP标记肿瘤细胞建立荧光标记的小鼠肿瘤模型,采用活体荧光成像仪和荧光显微镜可在整体和细胞水平直接观察肿瘤的生长以及肿瘤与宿主的相互作用.
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红色荧光蛋白和荧光素酶双表达稳定肺癌细胞系的建立
目的 构建能稳定表达红色荧光蛋白(RFP)和萤火虫荧光素酶(Fluc)的人肺癌细胞系,为建立活体成像的人肺癌裸鼠移植瘤模型及治疗研究奠定基础.方法 构建含Fluc和RFP基因的慢病毒载体pHBLV-Fluc-RFP,转染293T细胞进行病毒包装,用获得病毒液感染人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,再用嘌呤霉素筛选获得稳定细胞株,后分别采用荧光显微镜和实时定量PCR检测稳定感染细胞中RFP和Fluc的表达.结果 成功构建了pHBLV-Fluc-RFP慢病毒载体,获得了稳定表达Fluc和RFP的A549、H1975和K562细胞.荧光显微镜下可观测到3种稳定感染细胞中均有红色荧光.实时定量PCR检测结果显示,3种稳定感染细胞中Fluc基因的相对表达量远远高于对应的野生型细胞,差异均具有统计学意义(均P＜0.05).结论 获得的RFP和Fluc双表达人肺癌细胞系A549、H1975和人B细胞淋巴瘤细胞系K562,为人肺癌细胞免疫缺陷小鼠模型的活体成像提供了新荧光配色细胞模型.
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神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统的价值
背景:神经干细胞作为近年来神经科学研究的热点,在神经系统损伤治疗方面具有广阔的应用前景,但如何获取大量纯化且特征均一的终末神经细胞是这一领域的难点.利用细胞内荧光报告系统示踪神经干细胞分化的过程,并获得纯化的单一类型终末神经细胞为这一难点的解决提供了可行的方案.目的:探讨携带星形胶质细胞特异标志物GFAP基因的启动子驱动的荧光报告系统在神经干细胞神经分化示踪中的价值.方法:原代分离小鼠胚胎的脑部皮质,经机械消化和吹打后悬浮培养,免疫荧光染色检测其特异标志物Nestin的表达以确定神经干细胞.再将携带pLV/Final-neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的慢病毒感染小鼠神经干细胞,遗传霉素G418筛选14 d后获得纯化神经干细胞,然后诱导其向星形胶质细胞分化,显微镜观察细胞红色荧光(dTomato)的变化.诱导第13天采用细胞免疫荧光技术对表达红色荧光的细胞行GFAP抗体复染.结果与结论:①原代分离获得的小鼠神经干细胞呈Nestin表达阳性;②慢病毒感染并筛选14 d后得到具有G418抗性的纯化神经干细胞;③该细胞经神经诱导分化后,显微镜下观察到红色荧光大量表达,且GFAP复染与红色荧光具有非常高的一致性;④实验成功地获得了体外表达neo-GFAP(promoter)-dTomato载体的小鼠神经干细胞,该细胞可以体外示踪GFAP基因的特异表达,为神经干细胞的定向神经分化机制、细胞移植及组织工程产品开发等研究提供了有力的工具.
