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EZH2基因对卵巢癌的研究现状
EZH2(enhancer of zeste homo log 2)是果蝇zeste基因增强子的人类同源物,属于PcG( Polycomb Group)基因家族的重要成员之一,是一个非常重要的核转录调控因子[1].EZH2基因是近几年新发现的一种转录阻遏抑制因子,它具有促进多种肿瘤转移的活性.EZH2作为后选癌基因,在许多肿瘤组织和细胞中呈现高表达,对肿瘤的发生和进展起着重要作用[2].
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人EZH2基因编码区及3′非翻译区融合蛋白重组慢病毒表达载体构建及其在293T细胞中的表达
目的 构建携带人EZH2基因编码区(coding region,CDS)及3′非翻译区(3′untranslated region,3′UTR)融合红色荧光蛋白(red fluorescent protein,RFP)重组慢病毒表达载体,使mCherry-EZH2融合蛋白在293T细胞中稳定表达.方法 运用In-Fusion定向克隆技术构建人EZH2基因CDS区及3′UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体,测序无误后抽提质粒,转染293T细胞,包装病毒,测定病毒滴度.Western blot检测mCherry-EZH2的表达.结果 测序证实重组慢病毒表达载体基因序列完全正确;病毒颗粒包装成功,滴度为1.59×109 IU/ml;Western blot检测293T细胞中可以表达mCherry-EZH2融合蛋白.结论 成功构建人EZH2基因CDS区及3′UTR融合蛋白重组慢病毒表达载体及病毒,其mCherry-EZH2可以在293T细胞中稳定表达.为进一步分析可能调控EZH2基因CDS区及3′UTR表达的miRNA奠定前期实验基础.
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EZH2基因在膀胱移行细胞癌细胞株和癌组织标本中的表达及意义
目的 探讨EZH2基因在膀胱癌发生及进展中的作用. 方法 应用RT-PCR、蛋白质印迹及免疫细胞化学方法,以前列腺癌细胞株PC-3M作为阳性对照,检测EZH2基因在人膀胱移行细胞癌细胞株T24、EJ、MGH-U1、BIU-87中的表达;采用RT-PCR方法检测45例膀胱移行细胞癌和12例正常膀胱黏膜组织中EZH2基因表达情况.45例膀胱移行细胞癌中表浅性癌(Tis、Ta、T1)31例(68.9%),浸润性癌(T2～T4)14例(31.1%);病理分级G1 13例(28.9%),G2 21例(46.7%),G3 11例(24.4%). 结果 4种膀胱癌细胞株中均有EZH2基因表达.EZH2基因在膀胱移行细胞癌组织中的表达率(82.2%)明显高于正常膀胱黏膜(8.3%,P<0.05),在表浅性膀胱癌中的表达率为74.2%,浸润性膀胱癌中为100.0%,差异无统计学意义(P>0.05).EZH2基因在G1,G2和G3级肿瘤中的表达率分别为61.5%,85.7%和100.0%.随细胞分级程度升高.EZH2表达率有增加趋势,但差异无统计学意义(P>0.05). 结论 EZH2基因可能在膀胱癌的发生及进展中起重要作用,可能成为膀胱癌一个潜在的基因治疗靶点.
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HOTAIR mRNA和EZH2 mRNA在肾细胞癌组织中的表达情况
目的 探讨HOTAIR mRNA和EZH2 mRNA在肾细胞癌组织中的表达情况.方法 选取行手术切除的经病理学检查确诊的肾细胞癌患者的肾细胞癌组织标本61例,同时选取对应的癌旁正常肾组织标本61例为对照;采用逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)检测肾细胞癌组织和癌旁正常肾组织中HOTAIR mRNA和EZH2 mRNA的表达水平.结果 肾细胞癌组织中HOTAIR mRNA和EZH2 mRNA的相对表达量均明显高于癌旁正常肾组织(P﹤0.01);不同临床分期、淋巴结转移情况肾细胞癌患者的肾细胞癌组织中HOTAIR mRNA和EZH2 mRNA的相对表达量比较,差异均有统计学意义(P﹤0.01);肾细胞癌组织中HOTAIR mRNA的相对表达量为(0.76±0.20),EZH2 mRNA的相对表达量为(2.04±0.51),两者呈正相关(r=0.683,P﹤0.01).结论 HOTAIR mRNA和EZH2 mRNA在肾细胞癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常肾组织,检测肾细胞癌患者的HOTAIR、EZH2水平对其肿瘤的恶性程度判断具有一定参考价值.
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靶向EZH2基因的短发夹RNA表达载体的构建及其对人结肠腺癌SW480细胞的增殖抑制作用
目的 构建靶向EZH2基因的短发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探讨抑制EZH2基因表达对结直肠癌细胞增殖的影响.方法 根据EZH2 cDNA序列设计具有短发夹结构的DNA序列,构建重组表达载体,鉴定后转染至SW480细胞.采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot检测EZH2基因的抑制效果,采用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法检测EZH2抑制对SW480细胞增殖的影响.结果 EZH2基因shRNA表达质粒转染48 h后,基因沉默组和阴性对照组细胞中EZH2mRNA的相对表达水平分别为0.339±0.013和1.968±0.072,EZH2蛋白的相对表达水平分别为0.229±0.008和1.168 ±0.053,基因沉默组均明显低于阴性对照组(P＜0.01,P＜0.05).转染后48、72 h,细胞生长抑制率分别为30.7％和25.9％,与空白对照组比较细胞生长受到明显抑制(P＜0.05).结论 靶向EZH2基因的shRNA重组表达载体构建成功,并能显著抑制EZH2基因的表达.沉默EZH2基因能明显抑制结直肠癌细胞的增殖.
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shRNA下调 EZH2基因表达对人结肠癌细胞凋亡、增殖的影响
目的：探讨下调 EZH2基因表达对人结肠癌细胞凋亡、增殖的影响。方法以人结肠癌细胞HCT116为研究材料，设计合成针对EZH2基因mRNA的小干扰 RNA （ si －EZH2）， lipofectamine 2000脂质体转染 si －EZH2下调HCT116细胞株EZH2蛋白表达。蛋白免疫印迹法检测下调后EZH2蛋白表达水平，流式细胞术检测下调 EZH2后细胞凋亡水平，噻唑蓝（ MTT ）法检测HCT116细胞增殖能力变化。结果 si －EZH2可显著下调 EZH2蛋白表达（ P＜0．05）；下调EZH2蛋白表达后细胞凋亡比例增加，结肠癌细胞的增殖能力明显降低（ P＜0．05）。结论 EZH2可能参与了人结肠癌细胞增殖与凋亡过程，有望成为结肠癌药物治疗新靶点。
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EZH2基因在肿瘤发生与发展中的研究进展
EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是近年来新识别的一种人类基因,是果蝇zeste基因增强子的人类同源基因, Polycomb group基因家族的重要成员之一.
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EZH2基因研究进展
EZH2(enhancer of zeste homolog 2)是果蝇zeste基因增强子(E(z))的人类同源物,是PcG(Polycomb Group)基因家族的重要成员之一.在PcG基因家族中,EZH2起着核心作用.PcG和TrxG(trithorax group)基因是广泛保守的防止细胞身份发生改变的细胞记忆系统的重要成分.该系统从胚胎发育初期建立,贯穿整个发育过程,直到成年以后仍在不同程度上发挥重要作用.通过形成不同组分的PcG和TrxG蛋白复合物,调控染色质的"活性"或"无活性"状态,维持与细胞身份相应的基因的转录或抑制[1].作为一种重要的PcG蛋白,EZH2参与染色质结构的形成、基因表达调节以及生长控制,因而具有多潜能性.EZH2在PcG和Trx G蛋白复合物的形成、造血细胞发育分化、X染色体灭活、甚至恶性肿瘤形成等过程中均具有重要作用[2～6].本文拟就EZH2的基因结构表达、生物学功能以及与恶性肿瘤演化之间的关系等方面的研究进展做一简要综述.
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CRISPR/Cas9系统介导的EZH2基因定点敲入Hut78细胞系的构建
目的 利用CRISPR/Cas9系统构建定点敲入EZH2基因的Hut78细胞系.方法 构建EZH2表达载体pMD-18T-EZH2和单向导RNA(sgRNA)表达载体pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA,将两个载体共转染Hut78细胞,通过qPCR检测EZH2 mRNA的表达情况,通过Western Blot检测EZH2和H3K27me3蛋白的表达情况.结果 测序结果 显示,构建的pMD-18T-EZH2和pSpCas9(BB)-2A-Puro-sgRNA表达载体插入序列完全正确.将构建的两个质粒共转染Hut78细胞,qPCR结果 显示EZH2基因在RNA水平上表达显著上调;Western blot结果 显示EZH2和H3K27me3蛋白表达水平显著提高.结论 通过CRISPR/Cas9系统成功构建了定点敲入EZH2基因的Hut78细胞系.
关键词： 甲基化 EZH2基因 CRISPR/Cas9n系统 基因编辑 -
EZH2基因与上皮性卵巢癌相关性的研究
目的 探讨enhancer of zeste homolog 2(EZH2)基因与上皮性卵巢癌的相关性.方法 应用逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)方法检测上皮性卵巢癌患者EZH2 mRNA的表达水平,并应用Bandleader软件对目的 基因及内参照基因图像进行积分吸光度分析,EZH2 mRNA与GAPDH mRNA的积分吸光度的比值代表EZH2 mRNA表达水平,并进行统计学分析.结果 在28例卵巢癌患者中24例(85.7%)EZH2基因为阳性表达,Ⅰ～Ⅱ期7例患者中6例(85.7%)阳性表达;Ⅲ～Ⅳ期21例患者中18例(75.0%)阳性表达.Ⅰ～Ⅱ期与Ⅲ～Ⅳ期患者EZH2 mRNA表达水平间差异有统计学意义(P＜0.05).结论 EZH2基因可能与卵巢癌的分期和进展有关.
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EZH2和DLC1在乳腺癌组织和细胞中的表达及相关性
目的:研究果蝇zeste基因增强子同源物2(enhancer ofzeste homolog 2,EZH2)和肝癌缺失基因1(deleted in liver cancer-1,DLC1)在乳腺癌组织及细胞中的表达水平,并探讨二者之间的相互关系.方法:首先采用免疫组织化学法检测120例乳腺癌组织及63例癌旁正常组织中EZH2和DLC1蛋白的表达情况;随后分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测20例乳腺癌以及癌旁正常组织,以及乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞及正常乳腺上皮细胞HBL100中EZH2和DLC1 mRNA及蛋白的表达水平.通过脂质体法将特异性针对EZH2基因的siRNA转入MDA-MB231细胞,分别采用实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测MDA-MB231细胞中EZH2及DLC1 mRNA和蛋白表达水平的变化.结果:免疫组织化学检测结果提示,EZH2蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率明显高于其在癌旁正常组织中的阳性表达率(P=0.000),DLC1蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率明显低于其在癌旁正常组织中的阳性表达率(P=0.008).乳腺癌组织中EZH2和DLC1蛋白的阳性表达率与肿瘤大小及淋巴结转移密切相关(P值均＜ 0.05).实时荧光定量PCR法和蛋白质印迹法检测结果显示,EZH2 mRNA和蛋白在乳腺癌组织和乳腺癌MCF-7和MDA-MB231细胞中的表达水平均明显高于癌旁正常组织和正常乳腺上皮细胞HBL100 (P值均＜0.01),而DLC1 mRNA和蛋白的表达水平均明显低于癌旁正常组织和正常乳腺上皮细胞HBL100 (P值均＜0.01).沉默MDA-MB231细胞中EZH2基因表达后,DLC1 mRNA及蛋白的表达水平均明显上调(P值均＜ 0.05).结论:EZH2与DLC1在乳腺癌中的表达呈负相关,抑制EZH2的表达可以恢复DLC1的表达,提示EZH2可能通过抑制DLC1的表达促进肿瘤的发生和发展.
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单核苷酸多态性与胃癌易感性的相关性
目的 探讨单核苷酸多态性与胃癌易感性的相关性.方法 应用基因测序仪对120例胃癌患者与112例健康对照者的血样EZH2rs734004、r734005、rs2072407、rs6464926及rs12670401多态性进行测序,再应用组织芯片技术与免疫组化检测80例同一来源胃癌组织与24例癌旁正常胃黏膜组织EZH2蛋白的表达情况.结果 rs12670401小等位基因C与rs6464926小等位基因T增加,其胃癌发生风险较大(OR＞1),而其余三种多态性则会降低胃癌发生风险.经Codominant模型、Dominant模型及Recessive模型分析,rs12670401CC与rs6464926TT构成比显著高于对照组,可增加胃癌的发生风险(OR＞1),胃癌患者中杂合基因rs2072407TC、rs734005TC及rs734004CG构成比均显著低于对照组,可降低胃癌的发生风险(OR＜1).结论 EZH2基因单核苷酸多态性与胃癌易感性存在较为紧密的关系,且不同SNP等位基因对胃癌发生具有不同影响.
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EZH2在舌鳞状细胞癌中的表达及其临床意义
目的:探讨EZH2蛋白在舌鳞状细胞癌组织中的表达及其与临床病理的关系.方法:应用免疫组织化学染色法检测EZH2蛋白在52例舌鳞癌组织和12例正常舌组织标本中的表达.结合患者临床病理和随访资料,应用SPSS17.0软件分析EZH2的表达与相关临床病理参数以及患者总生存率之间的关系.结果:EZH2在舌鳞癌组织中呈高表达,与在正常组织中的表达有显著统计学差异(P＜ 0.001).EZH2蛋白表达与肿瘤病理学分级(P=0.033)、颈淋巴结转移(P=0.036)和局部浸润性(P=0.012)有关,而与患者的性别、年龄、肿瘤大小、临床分期无关(P＞0.05).Kaplan-Meier法分析患者的总体生存情况发现EZH2高表达组患者的总体生存率明显低于EZH2低表达组患者(P=0.028,Log-rank检验).结论:EZH2在舌鳞状细胞癌组织中呈高表达,其表达水平与肿瘤病理学分级、颈淋巴结转移、局部浸润性及患者预后有关.
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EZH2在肝细胞性肝癌中的表达及其对HepG2增殖作用的研究
目的 探讨EZH2在肝细胞性肝癌中的表达及其对肝癌细胞株HepG2增殖活性的影响.方法 采用Western-blot和RT-PCR方法分析EZH2与28例肝细胞性肝癌临床病理因素的关系;构建EZH2 RNAi表达载体,观察其对HepG2增殖活性的影响.结果 在28例肝细胞性肝癌标本中,EZH2在转录与蛋白水平,癌与癌旁之间差异均有显著性(mRNA 1.17±0.50 vs 0.50±0.14,P＜0.01;Protein 1.35±0.65 vs 0.38±0.20,P＜0.01);EZH2与临床病理特征分析中,EZH2在肿瘤直径＞5 cm组的表达显著高于直径≤5 cm组(1.71±0.68 vs 0.93±0.25,P＜0.001),而EZH2的表达与门静脉栓塞有无之间、肿瘤分化高、中、低之间则差异无显著性.成功构建EZH2 RNAi表达载体pSilencer 2.1-U6(+),pSilencer 2.1-U6(+)转染显著阻滞了HepG2细胞的增殖,并诱导HepG2阻滞于G2/M期.结论 EZH2在肝细胞性肝癌表达上调,提示EZH2在肝细胞性肝癌的发展中起重要作用.
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脱乙酰化酶抑制剂与去甲基化制剂联合作用对K562的细胞凋亡及EZH2基因表达的影响
目的:探讨DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-CdR)和组蛋白去乙酰基抑制剂辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)联合作用下对白血病细胞株K562中的EZH2基因表达及其对细胞凋亡的影响.方法:通过流式细胞术分析细胞凋亡;利用Western blot检测EZH2的表达水平.结果:对照组、单用5-Aza-CdR(10-7mol/L)或SAHA(10-6mol/L)及两药联合的凋亡率分别是8.2%、13.4%、10.1%和44.7%;两药联合时EZH2的表达水平明显低于单用5-Aza-CdR(10-7mol/L)或SAHA(10-6mol/L).结论:5-Aza-CdR与SAHA协同可抑制K562细胞中EZH2基因的表达,促进细胞的凋亡.
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Bmi1、EZH2在食管鳞癌中的表达及其临床价值
目的 探讨Bmi1与EZH2共同高表达对食管鳞癌的影响.方法 回顾性分析82例食管鳞癌患者的临床资料,考察Bmi1与EZH2在食管鳞癌组织中的表达情况及其对食管鳞癌患者生存率的影响,并进一步分析Bmi1与EZH2的表达情况对食管鳞癌的影响是否存在关联性.结果 肿瘤组织Bmi1与EZH2的IS得分均明显高于癌旁组织(P<0.05);Bmi1高表达组患者2~5年及5年生存率较Bmi1低表达组低(P<0.05),EZH2高表达组患者各时间段生存率与低表达组比较差异无统计学意义(P>0.05);Bmi1与EZH2共同高表达组与其他组的食管鳞癌患者的P16表达情况差异无统计学意义(P>0.05).结论 Bmi1与EZH2与食管鳞癌的发生和发展有密切联系,且影响食管鳞癌患者的预后,Bmi1与EZH2共同高表达是食管鳞癌发生的独立危险因素.
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RNA干扰抑制EZH2基因表达对子宫内膜癌细胞上皮-间质转化的影响
目的:利用RNA干扰技术靶向沉默EZH2基因,检测其对子宫内膜癌细胞增殖、迁移能力及上皮-间质转化(EMT)的影响.方法:实时荧光定量PCR、Western blot检测EZH2在子宫内膜细胞ESC及子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达差异.利用化学技术合成小分子siRNA转染子宫内膜癌细胞,靶向抑制EZH2基因表达.CCK-8、Transwell小室检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2增殖、迁移能力变化.Western blot检测干扰前后子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中EMT相关蛋白E-cadher-in、α-catenin、N-cadherin和Vimentin的表达变化.结果:(1)EZH2在子宫内膜癌细胞株ECC-1、RL95-2中的表达明显高于子宫内膜细胞ESC(P<0.01).(2)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞增殖、迁移能力降低(P<0.01).(3)RNA干扰抑制EZH2基因表达后,ECC-1、RL95-2细胞中上皮标志物E-cadherin和α-catenin的蛋白表达水平上调(P<0.05),间质标志物N-cadherin和Vimentin的蛋白表达水平下调(P<0.01).结论:EZH2在子宫内膜癌细胞中高表达,siRNA靶向沉默EZH2基因可抑制子宫内膜癌细胞的增殖、迁移和上皮-间质转化.
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靶向EZH2的shRNA表达对SW480细胞的抑制作用及5-Fu对其影响的研究
目的：研究EZH2特异性shRNA对人结肠癌细胞株SW480细胞的抑制作用和化疗药物5-FU对其干预作用的影响。方法体外将EZH2特异性shRNA表达载体转染SW480细胞，RT-PCR和Western blotting检测细胞EZH2 mRNA及蛋白的表达，MTT法检测细胞增殖活性；将靶向EZH2的shRNA表达的SW480细胞接种于裸鼠，5-FU对其进行干预，RT-PCR检测瘤组织EZH2 mRNA的表达。结果与阴性对照组相比，基因沉默组EZH2 mRNA表达明显降低（P＜0．01），EZH2蛋白表达明显降低（P＜0．05）；与空白对照组相比，基因沉默组细胞生长受到明显抑制（P＜0．05）；接种于裸鼠后，与正常组相比，5-FU基因沉默组与基因沉默组瘤组织体积、质量、EZH2 mRNA的表达均明显降低（P＜0．01），与基因沉默组相比，5-FU基因沉默组 EZH2 mRNA的表达明显降低（P＜0．05）。结论靶向EZH2的shRNA表达在体外及体内均可显著抑制SW480细胞EZH2 mRNA和蛋白表达及细胞生长；5-FU能显著抑制体内EZH2基因沉默的SW480细胞EZH2 mRNA的表达。
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抑制EZH2基因表达的shRNA载体的构建及其作用
目的 构建zeste基因增强子同源物2(EZr2)靶向的小发夹RNA(shRNA)重组表达载体,探讨抑制EZH2基因表达后其在结直肠癌细胞中的作用.方法 根据EZH2cDNA序列设计具有短发夹结构的两条DNA序列,与载体pGFP-V-RS构建重组表达载体,鉴定后转染至SW480细胞.将其随机分为阴性对照组和基因沉默组,RT-PCR和蛋白质印迹法检测抑制效果,MTT法检测细胞增殖情况.结果 成功构建了抑制EZH2基因表达的干扰质粒.阴性对照组EZH2 mRNA的表达是基因沉默组的5.8倍(P＜0.01),基因沉默组EZH2的蛋白明显低于阴性对照组(P＜0.05).与阴性对照组相比,基因沉默组细胞生长受到明显抑制(P＜0.05).结论 EZH2靶向shRNA重组表达载体构建成功,并能显著抑制EZH2基因的表达,为进一步研究EZH2基因在肿瘤中的作用机制提供了基础.
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长链非编码RNA CCAT2对肝癌细胞增殖和侵袭迁移能力的影响及其机制探讨
目的 观察长链非编码RNA CCAT2(lncRNA CCAT2)对肝细胞癌(HCC)细胞增殖和侵袭迁移能力的影响,并探讨其机制.方法 将对数生长期的HCC细胞HepG2随机分为A、B、C组,采用Lipofectamine 3000分别瞬时转染对照质粒、小干扰RNA质粒(si-CCAT2)、si-CCAT2+多梳蛋白EZH2过表达质粒.采用Real-time PCR法检测细胞中的lncRNA CCAT2、EZH2 mRNA,Western blotting法检测细胞中的EZH2蛋白,MTT法观察培养24、48、72、96 h细胞增殖能力(OD490),细胞划痕及Transwell实验分别观察细胞的迁移、侵袭能力.结果 与A组比较,B组细胞中lncRNA CCAT2和EZH2的mRNA和蛋白表达水平均下降(P均<0.05);与B组比较,C组胞中EZH2的mRNA和蛋白表达水平均增加(P均<0.05).与A组同时点比较,B组细胞增殖的OD490值降低(P均<0.05);与B组同时点比较,C组细胞增殖的OD490值升高(P均<0.05).与A组比较,B组细胞划痕愈合百分比、穿膜细胞数均下降(P均<0.05);与B组比较,C组细胞划痕愈合百分比、穿膜细胞数均增加(P均<0.05).结论 lncRNA CCAT2可通过上调EZH2的表达促进HCC细胞的增殖、侵袭和迁移,进而促进HCC的发生发展.
