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多重耐药不动杆菌16S rRNA甲基化酶和同源性研究
目的 调查2007年7月-2008年5月山西医科大学第二附属医院临床分离的61株多重耐药不动杆菌中介导氨基糖苷类抗生素高水平耐药的16S rRNA甲基化酶基因和Ⅰ类整合子携带耐药基因的分布.方法 利用blaOXA-51基因及16S rRNA-23S rRNA序列进行菌株鉴定,琼脂稀释法测定12种抗菌药物对61株不动杆菌的MIC,PCR筛选6种16S rRNA甲基化酶基因以及整合子基因盒,脉冲场凝胶电泳(PFGE)分析菌株同源性.结果 61株临床分离不动杆菌中55株为鲍曼不动杆菌、3株为3TU不动杆菌、l株13TU不动杆菌、1株醋酸钙不动杆菌、l株溶血不动杆菌.48株不动杆菌对阿米卡星、庆大霉素、妥布霉素均耐药,其中有47株检出armA基因;未检出rmtA、rmtB、rmtC、mad和npmA基因.armA基因阳性的菌株中Ⅰ类整合子阳性27株,分别携带arr-3、accA4、aacCl、catB8、aadA1和dfrA12基因.PFGE条带分析发现47株armA阳性菌株分为5个克隆,其中A、B为主要克隆,分布在我院多个科室中.结论 16S rRNA甲基化酶基因armA在多重耐药不动杆菌中广泛存在,armA基因不位于Ⅰ类整合子中,不动杆菌Ⅰ类整合子携带耐药基因主要介导对氨基糖苷类及氯霉素的耐药性.PFGE结果显示armA基因阳性菌株在我院呈克隆播散,必须采取有效的措施来控制耐药菌的传播.
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质粒介导16S rRNA甲基化酶肺炎克雷伯菌临床分离株的检测及分子流行病学研究
目的 调查165 rRNA甲基化酶在肺炎克雷伯菌临床分离株中的流行情况.方法 收集我院2006年1月至2007年9月从临床标本中分离的肺炎克雷伯菌337株,所有菌株均为非重复株.菌种鉴定采用全自动微生物分析仪,庆大霉素、阿米卡星和妥布霉素的药敏试验采用琼脂稀释法.超广谱B内酰胺酶(ESBLs)检测采用美国临床和实验窒标准协会(CLSI)规定的纸片确证法.使用PCR检测16S rRNA甲基化酶基因、整合酶基因和ESBL基因.接合试验检测质粒的可转移性;脉冲场电泳分析菌株的同源性.结果 337株肺炎克雷伯菌对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星的耐药率分别为19.0%(64/337)、8.3%(28/337)和16.3%(55/337).21株16S rRNA甲基化酶基因阳性,阳性率为6.2%(21/337),其中13株rmtB阳性、3株armA阳性、5株rmtB和atmA同时阳性.所有16S rRNA甲基化酶基因阳性株对庆大霉素、妥布霉素和阿米卡星同时耐药且都为高度耐药(MICs≥256μL),21株甲基化酶基因阳性株有19株产ESBLs,ESBL基因主要为CTX-M-14-like、CTX-M-15-like和SHV-12-like.21株均为Ⅰ类整合酶基因阳性.13株通过接合试验把质粒传递给受体菌E. coliJ53.所有接合子Ⅰ类整合酶基因阳性、blaTEM-1基因阳性、产ESBLs及对庆大霉素、妥布霉素、阿米卡星和复方磺胺甲噁唑耐药,对其他抗菌药物敏感.接合子ESBL基因型与供菌一致.21株16S rRNA甲基化酶基因阳性株经脉冲场凝胶电泳(PFGE)分成14个基因型,主要为A型和Ⅰ型.结论 armA和rmtB型16S rRNA甲基化酶基因已经在肺炎克雷伯菌中播散,既可通过克隆株播散也可通过接合性质粒在不同菌株间播散.
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5-脱氧杂氮胞苷诱导肝癌细胞E-Cadher in表达增强
目的研究5-脱氧杂氮胞苷对肝癌细胞株SMMC-7721中E-Cadherin基因表达的影响及其机制.方法肝癌细胞株SMMC-7721用5-脱氧杂氮胞苷处理、处理前后采用流式细胞仪检测E-Cadherin基因的蛋白表达,观察克隆形成及裸鼠致瘤性的变化.结果经5-脱氧杂氮胞苷处理后肝癌细胞株SMMC-7721中E-Cadherin蛋白表达增加了43.1%,克隆小而少,裸鼠致瘤性降低.结论 E-Cadherin基因蛋白表达增高可能与DNA甲基转移酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷抑制了E-Cadherin启动子区域的高甲基化有关,并在一定程度上恢复了其抑癌功能.
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甲基转移酶3B基因在胰腺癌中的表达
目的 检测胰腺癌组织中甲基转移酶3B(DNMT3B)基因表达,分析其与胰腺癌临床病理参数的关系.方法 应用实时定量PCR和免疫组织化学方法检测42例胰腺癌组织及相应癌旁组织、10例正常胰腺组织中DNMT3B mRNA和蛋白表达.结果 胰腺癌组织、癌旁组织和正常胰腺组织DNM33B mRNA表达量分别为9.4±5.9、1.02±0.71和0,相差非常显著(P<0.05);DNMT3B蛋白表达阳性率分别为83.3%、14.3%和10.0%,相差也非常显著(P<0.01).DNMT3B mRNA表达与I临床分期、肿瘤分化程度和淋巴结转移密切相关(P<0.05或P<0.01);DNMT3B蛋白表达与肿瘤的部位、淋巴结转移有关(P<0.01或P<0.05);DNMT3B mRNA和蛋白表达均与年龄、性别、神经浸润、肿瘤大小、血CEA和CA19-9浓度无关.结论 胰腺癌DNMT3B mRNA和蛋白高表达提示胰腺癌已发生淋巴结转移,预后较差.
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5-氮杂-2'-脱氧胞苷联合曲古抑菌素A对人胃癌细胞的存活率及E-cadherin甲基化的影响
目的 探讨5-氮杂-2’-脱氧胞苷(5-Aza-dC)联合曲古抑菌素A(TSA)对分化程度不同的人胃腺癌细胞株MKN-45、SGC-7901与MGC-803的细胞存活率和抑癌基因E-cadherin启动子区甲基化以及mRNA表达的影响. 方法 培养3个细胞株,实验分为空白对照组、5-Aza-dC组(10μmol/L 5-Aza-dC处理72 h)、TSA组(1μmol/L TSA处理48 h)和联合组(10μmol/L5-Aza-dC处理24 h后,再加入1μmol/L TSA处理48 h).观察三株细胞形态的改变,用台盼蓝染色法检测活细胞数.采用甲基化特异性聚合酶链反应(MSP)和反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测3株细胞的E-cadherin基因启动子区甲基化水平与mRNA表达. 结果 MKN-45细胞中,5-Aza-dC组、TSA组与联合组的细胞存活率分别为(73.03±1.92)％、(64.48±1.28)％和(52.44±1.45)％;SGC-7901细胞分别是(63.33±1.92)％、(52.15±1.44)％和(44.44±1.45)％;MGC-803细胞分别是(57.33±1.61)％、(45.48±1.29)％和(33.11±1.12)％.3株细胞的单药组的细胞存活率均减少,联合组分别比5-Aza-dC和TSA处理组明显下降(均P＜0.05).E-cadherin基因启动子区甲基化水平,5-Aza-dC组、TSA组及联合组的甲基化产物与空白对照组相比较均降低,其中联合组比单药组降低明显.空白对照、5-Aza-dC、TSA及二者联合处理组的E-cadherin的mRNA相对表达量在MKN-45细胞株中分别为0.17±0.01、0.32±0.01、0.29±0.02和0.57±0.02;在SGC-7901细胞株中分别为0.22±0.01、0.46±0.01、0.43±0.01和0.61±0.01;在MGC-803细胞株中分别为0.24±0.02、0.49±0.01、0.44±0.01和0.73±0.01.在单药处理组中比空白对照组升高(P＜0.05),并且二药联合组比单药组升高(P＜0.01). 结论 5-Aza-dC和TSA单独处理均降低分化程度不同的胃癌细胞存活率,使E-cadherin基因的甲基化水平下降,并增加其mRNA表达.3株细胞的联合组的影响效果更明显,两药之间具有协同作用.其中MKN-45的存活率,甲基化水平和mRNA表达的改变均较SGC-7901与MGC-803明显.
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巯嘌呤甲基转移酶基因多态性位点与白血病巯嘌呤耐受性的关系
目的分析巯嘌呤甲基转移酶(thiopurine methyltransferase,TPMT)基因型对急性白血病(AL)患儿巯嘌呤(6-mercaptopurine,6-MP)耐受性的影响,提高患儿对巯嘌呤类药物治疗的有效性和安全性.方法应用以聚合酶链反应(PCR)为基础的2种方法并结合DNA直接测序,检测250例健康成人和280例AL患儿TPMT基因第5外显子G238C、第7外显子G460A和第10外显子A719G的3个多态性位点.详细记录160例患儿6-MP全量治疗时间、减少剂量时间和未治疗时间.结果 280例AL患儿中,10例为TPMT第10外显子A719G杂合变异,变异率为3.6%,未发现纯合变异,变异的等位基因均为TPMT*3C.AL患儿TPMT基因变异的频率和类型与健康成人差异无显著性.在观察的160例患儿中,有28%的患儿未接受6-MP标准剂量、全疗程治疗.其中TPMT野生型者39例,占野生型患儿的26%,杂合型者6例,占杂合型患儿的60% (P=0.03).而且,6/10例TPMT杂合型者和30/150例野生型者减少6-MP的剂量(P=0.009).结论 TPMT基因的多态性位点与AL患儿6-MP的耐受性有关.TPMT杂合型患儿中不耐受6-MP的比例明显高于TPMT野生型者,必须中断治疗或减少剂量以避免较大毒性反应的发生.提示检测TPMT基因型有利于提高巯嘌呤类药物的有效性和安全性.
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5-脱氧杂氮胞苷对人肺腺癌细胞系增殖的影响
目的:探讨DNA甲基化异常与肺腺癌间的相关性及5-脱氧杂氮胞苷对肺癌细胞株增殖的影响及其机制.方法:用5-脱氧杂氮胞苷处理肺腺癌细胞株SPC-A-1,流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡率,Western-blot检测Apaf-1蛋白表达的变化,RT-PCR法比较Apaf-1基因和甲基转移酶mRNA表达量的变化.结果:5-脱氧杂氮胞苷处理36 h后Apaf-1蛋白和mRNA表达增加,而DNA甲基转移酶mRNA表达明显降低;G0/G1期细胞比例增加到(80.2±2.88)%,S期细胞比例降低至(6.4±0.62)%,G2/M期细胞比例增加到 (13.4±0.93)%,凋亡率增加到(13.5±0.97)%. 结论:肺腺癌的发生与DNA甲基化异常有关,甲基化酶抑制剂5-脱氧杂氮胞苷可能通过抑制甲基转移酶抑制抑癌基因启动子区域的高甲基化,恢复其生长调控功能,从而使肺癌细胞株的恶性生物学行为发生逆转.
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DNA甲基转移酶基因干扰对HepG2细胞癌-睾丸抗原再表达的影响
目的 探讨抑制甲基转移酶(DNMT1、DNMT3a和DNMT3b)对肝细胞癌细胞中癌-睾丸抗原表达的影响及相关机制.方法 分别采用针对DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的siRNA(DNMT1+3a+3b),针对DNMT1和DNMT3a的siRNA(DNMT1+3a),针对DNMT1和DNMT3b的siRNA(DNMTl+3b)以及针对DNMT3a和DNMT3b的siRNA(DNMT3a+3b)转染HepG2细胞,并以使用5-杂氮脱氧胞嘧啶(5-Aza-dC)处理的细胞作为阳性对照,采用RT-PCR、实时定量PCR和Western blotting检测细胞中DN-MT及癌-睾丸抗原的表达情况,并采用甲基化特异PCR(MSP)检测部分癌-睾丸抗原基因启动子的甲基化状态.结果 经siRNA干扰后,细胞中DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的表达量均明显降低.癌-睾丸抗原CT10和SSX1在转染DNMT1+3a和DNMT1+3b的细胞中出现再表达,而MAGE1及MAGE3在各siRNA转染细胞中均有表达,且无明显差异.CT10的启动子区发生了去甲基化,但MAGE1启动子区处于非甲基化状态.结论 在HepG2细胞中,干扰DNMT可使癌-睾丸抗原基因的启动子区发生去甲基化,后者可使由甲基化导致的不能表达的癌-睾丸抗原基因发生再表达.
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快速克隆SET家族新成员SET07
目的:本实验基于生物信息学资源,快速克隆获得SET基因家族新成员SET07,并预测其相关生物学性质,为进一步探讨该基因的功能奠定基础.方法:以含有SET结构域的EST片段为基础,电子延伸获得含有SET结构域的新的编码基因,通过RT-PCR技术从胎脾组织中克隆得到该基因的cDNA序列,利用Northern印迹技术证实SET07基因的全长,并利用生物信息学工具预测其相关生物学性质.结果:获得新的SET家族成员,命名为SET07基因,证实该基因全长为3 388 bp.分析发现其开放阅读框架为1 114 bp,编码347个氨基酸,相对分子质量38×10 3,等电点9.57,在羧基端含有SET结构域,与H4-K20甲基转移酶同源.结论:上述结果提示SET07基因可能具有甲基转移酶的功能,在调节细胞生长周期、控制肿瘤的发生发展中发挥重要作用.
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抗人甲基转移酶单克隆抗体的制备及临床应用研究
目的:建立抗人甲基转移酶单克隆抗体细胞株并建立相应的蛋白测定方法.观察脑瘤组织中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)表达水平与亚硝脲药物疗效的关系.方法:采用细胞融合技术建立抗人甲基转移酶单克隆抗体细胞株,采用免疫组织化学染色方法,检测60例脑瘤组织中MGMT表达水平.结果:得到7株稳定分泌抗人甲基转移酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并建立了测定MGMT免疫组化方法.观察的60例脑瘤组织中有27例MGMT阴性,经亚硝脲药物治疗,其中24例好转,3例复发;另3例MGMT可疑阳性的患者,经亚硝脲药物治疗,其中2例好转,1例复发;25例MGMT阳性患者,经亚硝脲药物治疗,5例好转,12例复发,8例死亡;5例MGMT为强阳性患者,使用亚硝脲药物治疗无效,全部死亡.结论:建立的7株稳定分泌抗人甲基转移酶单克隆抗体的杂交瘤细胞株及MGMT蛋白测定方法,为临床开展亚硝脲预见性化疗提供了必要手段.初步结果显示,脑瘤组织中MGMT表达水平与亚硝脲药物疗效及预后有关,是肿瘤细胞对亚硝脲药物产生耐药性的基础.
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m6A修饰RNA结合蛋白YTHDF2的克隆、表达及其活性分析
目的 构建YTH结构域m6A结合蛋白2(YTHDF2)重组表达载体,获得具有结合m6A修饰RNA活性的YTHDF2重组蛋白.方法 以 mRNA 为模板采用 RT-PCR 方法扩增 YTHDF2基因编码区序列,构建 pET-28a-YTHDF2重组表达质粒,在大肠杆菌BL21中诱导表达YTHDF2融合蛋白,利用Ni2+-NTA亲和胶纯化融合蛋白, Ni2+-NTA磁球分析融合蛋白活性.结果与结论 成功构建了 pET-28a-YTHDF2重组表达载体,纯化获得了YTHDF2融合蛋白,该融合蛋白具有结合m6A修饰RNA活性.重组YTHDF2融合蛋白的获得为研究m6A修饰RNA的生物学功能提供了重要工具分子.
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尿多酸肽联合丁酸钠抑制乳腺癌细胞生长的体外实验研究
目的:探讨尿多酸肽(uroacitide,CDAⅡ)与组蛋白去乙酰化酶抑制剂丁酸钠(sodium butyrate, SB)联合应用能否使人乳腺癌细胞MCF7维甲酸β2受体(retinoic acid receptorβ2,RARβ2)基因启动子去甲基化并诱导基因表达;以及联合用药能否协同抑制细胞生长、诱导细胞调亡.方法:培养乳腺癌细胞MCF7,分为CDAⅡ、SB两个单药组和两药联合组.分别用甲基化特异性聚合酶链反应(methylation- specific polymerase chain reaction,MSP)和反转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测RARβ2基因启动子甲基化状态和表达;Hoechst33342/碘化丙啶(propidiumiodide,PI)染色和DNA末端原位标记染色法(terminal deoxynucleotidyl transferase mediated dUTP-biotin nick end labeling,TUNEL)检测调亡;甲基噻唑基四唑(MTT)比色法检测细胞增殖.结果:CDAⅡ或SB单药均不能使RARβ2基因启动子去甲基化,也不能诱导基因表达,联合用药使基因启动子发生部分去甲基化并诱导了基因mRNA的表达;Hoechst33342/PI后,荧光显微镜下可见联合用药组出现明显的凋亡细胞,TUNEL法显示联合用药组细胞凋亡率显著高于两个单药组(39.5% vs 5.2%,8.1%,P＜0.05);MTT比色法显示与单独用药相比,联合用药对肿瘤细胞的生长抑制作用更显著,两药呈现交互作用(F=15, P＜0.05). 结论:CDAⅡ与组蛋白去乙酰化酶抑制剂SB具有协同抑制乳腺癌细胞增殖、诱导细胞凋亡的作用,这可能与两药联合应用能够使RARβ2基因启动子去甲基化并诱导基因表达相关.
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同位素示踪微量法测定白血病细胞DNA-甲基转移酶活性
目的:建立3H标记同位素示踪微量分析法用于白血病细胞MTase活性测定,并评价其准确性、敏感性及可靠性;了解急性白血病患者骨髓细胞MTase活性改变的规律.方法:以Poly[d(I-C)d(I-C)]为甲基受体,3H-SAM为甲基供体,测定骨髓单个核细胞和白血病细胞系的MTase活性.以细胞裂解蛋白作用2 h所得的每分计数值表示酶活性.每次测定设不加Poly[d(I-C)d(I-C)]的阴性对照,以HL-60细胞MTase活性为100%,所测样本值均和其相比,以相对数表示结果.结果:当细胞裂解蛋白质量在0.25～7.5μg之间时,本法线性良好,Y每分计数＝2 864X+142(r＝0.998,P＜0.01).方法灵敏度为2.4×104Bq,批间变异系数11.4%(n＝9),批内变异系数5.9%(n＝4).15例急性白血病MTase活性平均值为(9.1±4.6)%,较11例非恶性血液病对照组[平均(2.1±1.6)%]明显升高.11例缓解期急性白血病MTase活性平均(4.1±2.6)%,和对照组无明显区别.结论:同位素微量分析法测定MTase活性灵敏度高、重复性好.MTase活性增高是急性白血病的高发现象.急性白血病缓解后MTase活性下降.MTase活性测定可能对监测白血病病情变化有一定意义.
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DNA甲基转移酶在原发性肺癌患者血清中的表达及临床意义
目的 观察原发性肺癌患者血清中DNA甲基转移酶(DNMT)1、3a、3b蛋白表达,探讨其临床意义.方法 采用酶联免疫吸附试验(ELISA)法对2012年9月至2013年6月郑州大学第一附属医院呼吸内科136例原发性肺癌患者(肺癌组)和同期郑州市第六人民医院进行健康体检的147名健康人群(对照组)血清中DNMT1、3a、3b蛋白表达进行测定,采用Logistic回归分析蛋白表达与肺癌危险性关系及蛋白的表达与肺癌临床病理特征的关系.结果 肺癌组DNMT1、DNMT3a、3b蛋白表达(15±10、997±76、302±25)均显著高于对照组(13±10、344±93、108±22)(t=3.28、62.51、37.27,P=0.021、0.000、0.000);非条件Logistic回归分析提示DNMT1、3a、3b蛋白高表达均可增加患肺癌的危险性(x2=14.811、26.768、12.057,P=0.000、0.000、0.001),其中DNMT1显著增加患肺癌的危险性(OR=1.545,95％CI:1.238 ～1.928).不同组织学类型和不同临床分期肺癌患者的DNMT1、3a、3b蛋白表达差异均无统计学意义(均P＞0.05).结论 血清中DNMT1、3a、3b蛋白高表达可增加患肺癌的危险性,可能是肺癌发展早期过程中的重要生物学标志.
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氢醌致人支气管上皮细胞DNA甲基化改变中聚ADP-核糖聚合酶1的作用
目的 观察氢醌诱导体外细胞DNA甲基化水平改变,探讨聚ADP-核糖聚合酶l[poly (ADP-ribose)polymerasel,PARPl]在该过程中的作用.方法 以10、20、40、60、80 μmol/L浓度的氢醌分别处理人支气管皮细胞(16HBE)及其PARPl缺陷细胞(16HBE-shPARPl)48 h,对照组加入等体积的PBS溶液.采用高效毛细管电泳检测基因组DNA整体甲基化水平,检测PARPl和DNA甲基转移酶1(DNA methyltransferases 1,DNMT1)mRNA表达的变化.结果 16HBE和16HBE-shPARPl细胞基因组整体甲基化百分比(mCpG％)分别为(4.89％±0.07％)和(9.53％±0.51％).经5-氮杂脱氧胞苷(DAC)处理72 h后,mCpG％值分别下降为(3.07％±0.12％)和(6.34％±0.3％),经单因素方差分析,2种细胞不同处理组mCpG％的差异有统计学意义(F值为61.25和60.36,均P＜0.01).16HBE细胞各氢醌染毒组的PARP1 mRNA相对表达分别为对照组的145.0％、159.0％、169.0％、215.0％和236.0％,差异均有统计学意义(P＜0.01);16HBE-shPARPl细胞,各氢醌染毒组PARPl mRNA相对表达水平分别为对照组的170.0％、223.0％、264.0％、327.0％和320.0％,差异均有统计学意义(P＜0.01).当氢醌染毒剂量达到20、40、60、80μmol/L,16HBE细胞DNMTl mRNA相对表达水平分别为对照组的114.0％、126.0％、136.0％和162.0％,差异有统计学意义(均P＜0.01);当氢醌染毒剂量达10、20、40、60、80 μmol/L,16HBE-shPARPl细胞DNMTl mRNA相对表达水平分别为对照组的141.0％、165.2％、186.9％、202.1％和217.3％,差异有统计学意义(P＜0.01).结论 氢醌能引起16HBE细胞低甲基化,PARPl可通过影响DNMTl的表达及改变DNMT1的活性来调节16HBE细胞DNA甲基化改变.
关键词： 氢醌类 DNA甲基化 聚ADP核糖聚合酶1 甲基转移酶类 -
巯基嘌呤甲基转移酶活性和硫鸟嘌呤核苷酸浓度检测在6-MP个体化化疗中的意义
目的探讨巯基嘌呤甲基转移酶(TPMT)活性、基因型和硫鸟嘌呤核苷酸(TGNs)浓度检测对6-巯基嘌呤(6-MP)化疗个体化的意义.方法用放射性核素标记方法测定红细胞TPMT活性,用特异引物序列-PCR和限制性片段长度多态性-PCR方法检测低活性者的基因型,通过高效液相色谱法(HPLC)检测急性淋巴细胞白血病(ALL)患儿在服用6-MP后红细胞内的TGNs浓度.结果 371名受检者的平均TPMT活性为(16.6±4.5)U/ml pRBCs,其中≤10 U/ml pRBCs的低活性比例为8.1%,男性和女性的平均TPMT活性分别为(16.8±5.0) U/ml pRBCs和(16.5±4.4) U/ml pRBCs,汉族人TPMT活性不存在性别、年龄差异,健康志愿者与白血病患儿之间差异亦无显著性;30名TPMT活性低下者的DNA中包括TPMT*2型5例,TPMT*3A型4例,TPMT*3B型6例,TPMT*3C型10例,另有5例未出现上述基因型;ALL患儿治疗前红细胞TPMT活性与服用6-MP 7～14 d的红细胞内TGNs稳态浓度呈负相关.TGNs浓度与测定后第14天的白细胞计数呈负相关.结论服用6-MP前测定TPMT活性和服药时监测TGNs浓度能够有助于预防抗嘌呤代谢药物的不良反应,指导其化疗个体化,改善疗效.
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尿多酸肽对骨髓增生异常综合征PTEN基因甲基化的影响及相关机制研究
目的 检测骨髓增生异常综合征(MDS)细胞株MUTZ-1及原代细胞PTEN基因的甲基化情况,分析尿多酸肽(CDA-Ⅱ)对其影响及机制,探讨CDA-Ⅱ在MDS靶向治疗中的价值.方法 采用Western blot法和RT-PCR检测MUTZ-1细胞及MDS患者原代细胞DNA甲基转移酶(DNMTs)和PTEN表达情况及CDA-Ⅱ对其的影响；采用甲基化特异性PCR(MSP)检测MUTZ-1细胞及MDS患者原代细胞PTEN甲基化情况及CDA-Ⅱ对其的影响.结果 PTEN在高危MDS和MDS转化的急性髓系白血病(AML)患者细胞中完全甲基化；高危MDS和MDS转化的AML患者细胞高表达DNMTs,以DNMT3b为明显.MUTZ-1细胞经2、4及8mg/ml CDA-Ⅱ处理后PTEN蛋白表达量分别为0.23±0.11、0.54±0.11及0.92±0.13,高于空白对照组的0.02±0.01(P＜0.01)；4 mg/ml CDA-Ⅱ处理12、24及48 h后PTEN蛋白表达量分别为0.15±0.06、0.52±0.12及0.89±0.13,高于空白对照组的0.02±0.01 (P＜0.01).CDA-Ⅱ明显下调MUTZ-1细胞DNMTs(DNMT1、DNMT3a、DNMT3b)表达并导致其PTEN去甲基化,呈浓度依赖性(r=0.999、0.992、0.995,P＜值均0.01)和时间依赖性(r=0.989、0.981、0.985,P值均＜0.05),以对DNMT1作用显著(F=21.256,P＜0.05).结论 PTEN基因在高危MDS患者中存在高度甲基化,靶向PTEN的去甲基化治疗可作为MDS治疗的新策略；CDA-Ⅱ通过抑制DNMTs导致PTEN去甲基化从而诱导MDS细胞凋亡.
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三氧化二砷对MRL/lpr自发性狼疮小鼠抗双链DNA抗体和DNA甲基转移酶及CD11a表达的影响
目的 探讨三氧化二砷(ATO)对MRL/lpr自发性狼疮小鼠抗双链DNA(dsDNA)抗体及DNA甲基转移酶1(DNMT1)和黏附分子淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)的亚基CD11a表达的影响及其可能作用机制.方法 将MRL/lpr狼疮鼠随机分为ATO治疗组、0.9％氯化钠注射液(NS)对照组和环磷酰胺组.另设正常C57/BL小鼠,随机分为ATO治疗组和NS对照组.以上每组各10只,隔日腹腔注射,给药2个月后处死,SYSMEX KX21血常规测定仪测定血常规,酶联免疫吸附试验(EMSA)法测各组小鼠血清抗dsDNA抗体水平；反转录.聚合酶链反应(RT-PCR)检测2组小鼠外周血单个核细胞的DNMT1及CD11a转录水平的表达情况.采用方差分析和配对t检验进行统计学处理.结果 ①MRL/lpr小鼠ATO 治疗组血清抗dsDNA抗体水平(0.89±0.07)和CD11 a(0.43±0.25)均低于NS对照组(1.77±0.28.P＜0.01和0.99±0.31,P＜0.05),DNMT1 (0.32±0.30)高于NS对照组(0.16±0.26,P＜0.05)；②MRL/lpr小鼠ATO治疗组及环磷酰胺治疗组小鼠的血清抗dsDNA抗体水平(分别为0.90±0.07和0.66±0.22)较NS组(1.77±0.28)下降,且ATO治疗组小鼠的血清抗dsDNA抗体水平高于环磷酰胺治疗组(P＜0.05):ATO组DNMT1(0.32±0.30)高于环磷酰胺治疗组(0.16±0.18,P＜0.05),CD11 a(0.43±0.25)低于环磷酰胺治疗组(0.86±0.31,P＜0.05)；③在C57/BL小鼠中.ATO治疗组和NS对照组之间以上指标差异均无统计学意义.结论 ATO 能减少狼疮小鼠体内自身抗体产生,逆转其低甲基化状态；但是对正常小鼠的抗体水平和其甲基化状态并无明显影响.
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肝癌组织中HBV感染与甲基化转移酶表达的关系
目的 检测肝癌患者癌组织、肝癌旁组织、肝硬化相关组织中甲基化转移酶(DNMT)的表达情况,分析HBV感染与DN-MT表达之间的关系.方法 根据是否存在HBV感染,将44例标本分成两组.HBV感染相关组:血液或组织中至少可检测出一种HBV感染相关的标志物；非HBV感染相关组:血液或组织中未检测出HBV感染相关标志物.应用荧光定量PCR(FQ-PCR)检测分期及分化程度不同的肝癌患者癌组织、肝癌旁组织、肝硬化组织中DNMT基因mRNA的表达水平.不同组间DNMTs表达水平的差异采用ANOVA分析；非参数检验方法为Spearman等级相关分析.结果 HBV感染相关组中癌组织的DNMT1、3A和3B mRNA表达水平明显高于非HBV感染相关组(P=0.001、0.006、0.02)；HBV感染相关组中肝硬化组织的DNMT1、3A和3B mRNA表达水平也明显高于非HBV感染相关组(P =0.007、0.008、0.045)；即使在癌旁组织,HBV感染相关组织中DNMT1、3A mRNA表达水平明显高于非HBV感染相关组织(P=0.01、0.04).HBV感染与DNMTs表达相关分析结果显示:HBV感染与DNMT表达相关(P=0.009、0.006、0.03)；HBV感染有关指标中HBsAg、HBeAg、HBV-DNA与DNMT1表达密切相关(P=0.008、0.032、0.006).结论 (1) HBV感染相关组中癌组织及肝硬化组织的DNMT1、3A和3B mRNA表达水平明显高于非HBV感染相关组.(2) HBV感染可能刺激DNMT的表达,尤其是DNMT1、3A和3B,进而促进部分抑癌基因甲基化.
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亚砷酸钠诱导大鼠肝星状细胞的激活及对DNA甲基转移酶1、3a mRNA表达的影响
目的 观察不同剂量亚砷酸钠对大鼠肝星状细胞(HSC-T6)纤维化的影响,及其纤维化后DNA甲基转移酶(DNMT)1、DNMT3a mRNA的表达情况.方法 HSC-T6细胞分别暴露于终浓度为0(对照)、5(低剂量)、15(中剂量)、25(高剂量)μmol/L的亚砷酸钠培养基中培养24、48、72 h.收取细胞和细胞培养上清液.采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞培养上清液中纤维化因子Ⅰ型胶原(COL-1)、Ⅲ型胶原(COL-3)、α平滑肌肌动蛋白(α-SAM)的含量,实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞DNMT1、DNMT3a mRNA的表达.结果 不同染砷时间(24、48、72 h)对HSC-T6细胞COL-1、COL-3、α-SMA含量的影响差异均有统计学意义(F=249.574、328.493、3 157.436,P均＜0.01);不同染砷含量(低、中、高剂量组)对HSC-T6细胞COL-1、COL-3、α-SMA含量的影响差异均有统计学意义(F=3 946.521、1 006.399、13 025.770,P均＜0.01).染砷24、48 h,高剂量组DNMT1 mRNA的表达(4.33±0.24、2.34±0.43)高于对照组(1.00±0.00、1.00±0.00,P均＜0.05);低、中、高剂量组DNMT1 mRNA的表达随染砷时间延长而下降(P均＜0.05).染砷48、72 h,高剂量组DNMT3amRNA的表达(2.23±0.50、5.02±0.23)高于对照组(1.00±0.00、1.00±0.00,P均＜0.05);中、高剂量组,染砷72 h DNMT3a mRNA的表达(3.80±0.14、5.02±0.23)均高于24 h(3.03±0.12、0.42±0.15,P均＜0.05).结论 亚砷酸钠对HSC-T6细胞具有明显的活化和促纤维化作用,肝纤维化后DNMT1、DNMT3a mRNA的表达水平均上调.
