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自身淬灭荧光定量PCR检测慢性粒细胞白血病bcr/abl mRNA
目的 利用自身淬灭探针技术建立一种能检测慢性粒细胞白血病(CML)bcr/abl融合基因mRNA的实时荧光定量PCR方法,为CML的诊断、疗效观察以及微量残留白血病(MRD)的监测提供有效手段.方法 用逆转录PCR方法(RT-PCR)扩增K562细胞的bcr/abl融合基因,A-T克隆法构建定量标准模板;设计自身淬灭荧光引物(探针),建立自身淬灭荧光定量逆转录PCR方法(FQRT-PCR),并对该方法的线性检测范围、灵敏度、重复性、稳定性进行检测;然后检测临床白血病患者骨髓标本bcr/abl mRNA.结果 建立的FQ-RT-PCR方法可检测10 copies/μl的bcr/abl重组质粒,并能从105个正常细胞中检出1个白血病细胞,该方法的批内、批间变异系数(CV)分别为2.1%、6.1%,线性检测范围为102～109 copies/μl.25例CML患者bcr/abl融合基因mRNA表达量中位数为4.50×104[(0.45～89.00)×104]copies/μg RNA,其中11例慢性期初诊患者bcr/abl mRNA表达量中位数为5.45×104[(2.95～19.30)×104]copies/μg RNA,6例急变期患者bcr/abl mRNA表达量中位数为13.00×104[(4.10～89.00)×104]copies/μg RNA,8例慢性期治疗后复查患者bcr/ablmRNA表达量中位数为2.35×104[(0.45～5.12)×104]copies/μg RNA,CML急变期患者bcr/abl融合基因表达水平与慢性期患者之间差异有统计学意义(q=3.41,P＜0.05).PCR产物经电泳分析,其中21例CML患者为b3a2型,4例CML患者为b2a2型;3例急性淋巴细胞白血病(ALL)患者中,1例有bcr/abl mRNA表达,为b2a2型.结论 所建立的基于自身淬灭探针技术的实时荧光定量PCR检测方法灵敏、特异、重复性好,结果用拷贝数表示,准确可靠,利于标准统一.可广泛用于CML的诊断、疗效观察以及MRD的监测.
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自身淬灭探针荧光定量PCR检测BK多瘤病毒方法的建立与评价
目的 利用自身淬灭探针技术建立一种敏感、特异、快速、价廉的BK多瘤病毒(BKV)荧光定量PCR检测方法.方法 构建重组质粒pGEM-11Zf-BK作为标准品,自行设计自身淬灭探针,优化定量PCR体系,并进行方法学评价及初步临床应用.结果 成功构建了重组质粒pGEM-11Zf-BK,建立自身淬灭探针荧光定量PCR方法,其线性检测范围为103～109拷贝/ml2;灵敏度为1000拷贝/ml;重复性:高拷贝样品的天间CV为3.06%,批内CV为1.49%,批问CV为3.27%;低拷贝样品的天间CV为2.55%,批内CV为0.65%,批间CV为3.36%,特异性为100.00 oA;用该方法检测52例肾移植受者的血、尿标本,结果发现肾移植受者血、尿BKV DNA的阳性率明显高于健康对照者,分别为15.38%、32.69%,尿BKV DNA的载量明显高于血BKV DNA的载量(P＜0.05).结论 首次建立了以自身淬灭探针技术为平台的BKV荧光定量PCR检测方法,该方法灵敏、特异,快速;该研究对应用自身淬灭探针技术开发其他病原体检测试剂有一定的参考价值.
关键词： BK多瘤病毒 自身淬灭探针 荧光定量聚合酶链反应 -
新型荧光定量PCR检测孕妇生殖道解脲脲原体方法的建立
目的 探讨建立自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测解脲脲原体(Uu)的可行性及价值.方法 根据Uu UreA基因序列设计合成引物和自身淬灭引物,采用基因克隆技术,将UreA基因片段插入到载体pMD18-T,以此作为标准品.优化PCR条件,建立以自身淬灭引物技术为平台的实时荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)方法,并对所建立的方法进行初步方法学评价.结果 成功构建了重组质粒pMD18-T-UreA;建立了以自身淬灭探针技术为基础的实时荧光定量PCR方法,其线性检测范围为101～109copies/μl;灵敏度为10copies/μl;重复性实验批内CV为2.35%,批间CV为3.68%,天间CV为4.92%;特异性好;通过初步临床应用发现,所建立的FQ-PCR方法与经典的培养方法相比,不仅能实时监测反应进程、绝对定量和快速检测,且检出率显著高于培养方法.结论 自身淬灭探针荧光定量PCR方法检测Uu具有快捷、敏感、廉价等优点,可在临床诊断中应用.
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自身淬灭荧光技术定量检测临床分离的淋病奈瑟菌DNA
目的 探讨自身淬灭荧光定量聚合酶链反应(FQ-PCR)检测临床分离的淋病奈瑟菌DNA的临床应用价值.方法 以建立的淋病奈瑟菌自身淬灭FQ-PCR方法为基础,对59例疑为淋病奈瑟菌感染患者的标本进行检测,并与分离培养法进行分析比较.结果 自身淬灭FQ-PCR标准品浓度为102～107 拷贝/μL时,方法能够保持良好的线性关系,标准曲线为:Y=-0.273 X+10.781, 相关系数为0.9895.自身淬灭FQ-PCR阳性检出率为64.41%,高于培养法52.54%(χ2=5.14,P＜0.05);两者特异性均为100%.结论 自身淬灭FQ-PCR用于临床分离的淋病奈瑟菌DNA检测,敏感性、特异性均高,对淋病的诊断有较高价值,实现了 PCR扩增、荧光探针杂交及检测一体化,简便省时.
关键词： 淋病奈瑟菌 自身淬灭探针 荧光定量聚合酶链反应 实验室技术与方法 -
结核分枝杆菌自身淬灭探针荧光定量PCR检测方法的建立
目的 利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的结核分枝杆菌荧光定量PCR检测方法.方法 构建重组质粒PET-32a(+)-16s rRNA作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系,并进行方法学评价及临床应用.结果 所建立方法的线性检测范围为102～109copies/μL.灵敏度为lcopy/μL,特异性为100%.高拷贝样品的天间CV为2.65%、批內CV为1.86%,低拷贝样品的天间CV为2.12%、批內CV为0.78%.该方法比培养方法更快速、灵敏.结论 以自身淬灭探针技术为平台的结核分枝杆菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对结核病的早期快速诊断有较高价值.
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自身淬灭探针荧光定量PCR检测淋病奈瑟菌
目的 利用自身淬灭探针技术建立敏感、特异、快速、价廉且能广泛应用的淋病奈瑟菌荧光定量PCR检测方法.方法 构建重组质粒pGEM-11Zf-CPPB作为标准品,自行设计自身淬灭探针,建立、优化定量PCR体系,并进行方法学评价及临床应用.结果 所建立方法的线性检测范围为101～109拷贝/μL,灵敏度为10拷贝/μL,特异性为100%.天间变异系数(CV)为2.38%,批内CV为1.32%,批间CV为2.75%.该方法比培养方法更快速、灵敏.结论 以自身淬灭探针技术为平台的淋病奈瑟菌荧光定量PCR方法灵敏度高、特异性好,对淋病的早期快速诊断有较高价值.
