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质谱仪在乳腺癌生物标记物研究中的应用
乳腺癌是一种威胁女性健康的常见恶性肿瘤,目前临床上主要依据组织病理学要素对乳腺癌进行病情预测和治疗.以生物标记物的发现和确认为核心的临床蛋白质组学研究逐渐成为了乳腺癌研究的主流方向,这大大提升了临床对乳腺癌分子机理的认识,并推动了对乳腺癌的临床诊断及预后.本文主要对质谱仪在乳腺癌生物标记物研究中的应用进展进行综述.首先介绍了基于质谱的蛋白质组学的基本概念,然后具体阐述了质谱技术中的一些新研究进展以及相关技术在乳腺癌生物标记物研究中的应用,并且还分析了一些利用质谱技术寻找到的潜在乳腺癌生物标记物及其应用前景,后对质谱技术应用于该领域的局限性以及未来发展趋势进行了展望.
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稳定性同位素稀释技术结合气相色谱-离子阱质谱法检测葡萄酒中的氨基甲酸乙酯
目的 建立葡萄酒中氨基甲酸乙酯(EC)的测定方法.方法 使用气相色谱-离子阱质谱法和稳定性同位素稀释技术,采用硅藻土Extrelut NT进行基质固相分散萃取净化,二氯甲烷洗脱,选择离子储存方式SIS测定.结果 方法的线性范围在10～1000 μg/kg,检出限为2μg/kg,定量限为6 μg/kg.3个不同加标水平葡萄酒中氨基甲酸乙酯的平均回收率为88.5%～112.8%,RSD为5.8%～9.5%(n=5).结论 本方法准确可靠,可用于葡萄酒中氨基甲酸乙酯的测定.
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液相色谱-线性离子阱质谱法检测草鱼中孔雀石绿、结晶紫及其代谢产物
目的 建立鱼中的孔雀石绿(MG)、结晶紫(GV)及其代谢物无色孔雀石绿(LMG)、无色结晶紫(LGV)的测定方法. 方法 使用液相色谱线性离子阱串联质谱技术和同位素稀释技术,McIlvaine缓冲液和乙腈提取,OASIS MCX SPE柱净化,洗脱液在选择反应检测模式(SRM)下测定. 结果 方法的检出限CCα为0.03～0.05μg/kg,定量限CCβ为0.05～0.09 μg/kg.5个不同加标水平鱼样中4种目标化合物的平均回收率为84.7%～105.1%,RSD为1.3%～14.9%(n=5). 结论 本方法定量准确可靠,可用于鱼样品中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物的测定.
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聚合酶链反应斑点杂交技术在临床乙型肝炎病毒检测中的应用
利用半抗原地高辛配基(digixigenin)制备非同位素标记探针技术,分别标记乙型肝炎病毒全基因探针(DIG-HBVDNA)及乙型肝炎病毒PCR产物C区探针[DIG-HBV(C/preC)],经斑点杂交检测血清HBVDNA及血清聚合酶链反应(PCR)产物,与PCR平行检测122份血清标本.
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生物电阻抗法与双标水稀释法在人体成分测定中的应用比较
目的 用双标水稀释法验证目前在我国广泛应用的体成分测定方法--生物电阻抗法的准确性.方法 从白求恩军医学院某中队150名学员中根据体质指数(BMI)等指标筛选出16名学员作为受试对象,试验期为14 d,试验期间学员集中管理,统一食宿.试验第1天受试者服用双标水,收集服用前及服用后2 h、4 h、6 h、8 h及第2至第14天的尿液,用质谱分析的方法,得到受试者2H、18O的消除曲线,从而获得受试者的体成分数据.与此同时,从试验第1天开始,每天晚餐后3 h用生物电阻抗仪对每位受试者进行体成分的测定.后,将2种方法获得的体成分数据加以比对.结果 经统计学分析,生物电阻抗法与双标水稀释法获得的体成分参数值差异无统计学意义,而且高度相关,两种方法测得的总体水、瘦体重、体脂及体脂百分比的相关系数分别为0.556,0.556,0.817,0.606,具有统计学意义.结论 应用生物电阻抗法测定中国人体成分具有较高的准确性.
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抗ProGRP(31-98) scFv的131I标记及生物分布研究
目的 研究抗胃泌素释放前体(ProGRP(31-98)单链抗体(scFv)的131I标记方法,并对其标记后的稳定性、免疫活性及生物分布进行分析.方法 采用氯胺T法碘化标记制备131I-anti-ProGRP(31-98)scFv,凝胶柱层析法分离纯化标记产物,利用纸层析法测定标记物的标记率、放化纯度和稳定性,采用细胞结合分析法比较131I-anti-ProGRP(31-98)scFv对小细胞肺癌细胞株NCI-H446和肺腺癌细胞株A549的免疫结合率.将131I-ProGRP(31-98)scFv注射入动物体内,研究其在实验动物体内的分布情况.结果 131I-anti-ProGRP(31-98)标记率为(93.35±0.67)％,标记产物纯化后即刻放化纯度为(98.49±1.21)％.131I-anti-ProGRP(31-98)scFv对人小细胞肺癌NCI-H446和肺腺癌A549细胞株的免疫结合率分别为(85.36±1.45)％和(21.02±2.16)％,且差异有统计学意义(P＜0.05).131I-anti-ProGRP(31-98)scFv在实验动物体内主要通过肾脏和肝脏代谢,血液清除快.结论 131I-anti-ProGRP(31-98) scFv的标记率高,且有良好的稳定性和免疫活性,在实验动物体内主要通过肝脏和肾脏代谢,血液清除快.
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全自动酶联免疫法与RIA对FT3、FT4、TSH检测的比较分析
血清中FT3、FT4和TSH浓度是了解甲状腺机能的重要指标,对各种甲状腺疾病的诊断、鉴别诊断以及疗效判定均有非常重要的意义.临床上采用RIA及IRMA检测FT3、FT4、TSH已十分普及,随着标记免疫学技术的飞速发展,包括酶联免疫分析、各类化学发光免疫分析及时间分辨荧光免疫分析在内的非同位素标记免疫分析技术不断推广并用于临床,其高度的自动化程度、高度的灵敏性及重复性等优势受到临床好评.本文应用ES-300全自动酶联免疫分析法测定了118份血清FT3、FT4和TSH浓度,同时与RIA及IRMA加以比较,报道如下.
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标记免疫分析技术进展
1959年Berson和Yalow报道放射免疫分析测定血浆胰岛素,由此开创了放射免疫分析(RIA)技术检测微量物质的新纪元,四十余年RIA已成为成熟的技术,在临床检测和科学研究中产生重要影响.我国自二十世纪六十年代起的三十余年,经历了几个发展阶段取得了瞩目的进展和广泛应用.近十余年,应用相关的放射免疫原理,以非同位素物质替代放射性核素标记抗原或抗体,相继出现了一些新的非同位素标记免疫分析技术如酶、化学发光、酶放大和荧光免疫分析等技术,与放射免疫分析技术一起统称为标记免疫分析技术.现就标记免疫分析技术的现状和发展作如下综述.
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Hes5敲除小鼠室下带细胞分化的蛋白组学研究
目的 阐明Hes5通过调节哪些蛋白的表达而抑制神经细胞的分化.方法 利用蛋白组学同位素标记相对和绝对定量技术(iTRAQ技术)观察Hes5敲除生后8d小鼠室下带蛋白表达的变化,并用Western blotting技术对表达上调和下调的蛋白进行验证.结果 在Hes5敲除生后8d小鼠室下带发现19种蛋白有重要的变化.与对照组野生型小鼠相比,其中10种蛋白的表达是上调的,变化的倍率在1.20～1.32之间.9种蛋白的表达是下调的,变化的倍率在0.77～0.83之间.上调的蛋白主要与促进神经细胞的生长,细胞的迁移,黏附和信号的转导有关,而下调的蛋白主要是抑制细胞的生长和维持细胞骨架的蛋白.Westem blotting验证蛋白表达的变化与iTRAQ结果一致.结论 Hess可能通过影响与细胞生长、迁移以及细胞骨架等有关的多种蛋白的表达来影响细胞的分化.
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同位素标记联合二维液相色谱串联质谱技术筛选T淋巴细胞急性白血病特异标记物
目的:筛选并鉴定T淋巴细胞白血病(T-ALL)的可能标记物.方法:分别收集并纯化初治儿童B淋巴细胞白血病(B-ALL)与T-ALL血清各20份.应用同位素标记联合二维液相色谱串联质谱(iTRAQ-2DLC-MS/MS)和生物信息分析软件(IPA)筛查T-ALL特异性分子标志物.采用ELISA双抗夹心法分别检测上述40例样本中血清可溶性L-选择素(sL-selectin)表达水平,进一步验证2DLC-MS/MS技术的准确性,并计算其统计学意义.结果:有定量信息的非冗余蛋白468个,T-ALL组血清差异蛋白共有38个,其中显著上调蛋白质31个,下调蛋白质7个;T-ALL中sL-selectin表达明显上调,并得到ELISA检测结果证实.结论:T-ALL与B-ALL比较存在相对特异的血清差异蛋白,sL-selectin可作为T-ALL新的肿瘤分子标志物及潜在的治疗靶点.
关键词： T淋巴细胞白血病 蛋白质组 同位素标记 二维液相色谱串联质谱 靶向治疗 -
99mTc-K237的制备及其在小鼠体内分布和显像
目的 探索99mTc标记多肽K237的方法 ,研究标记物的稳定性及其在小鼠体内的分布.方法 采用99mTc直接标记多肽K237.正常小鼠尾静脉注射99mTc-K237后不同时间处死,取血液及主要脏器,测定其每克组织百分注射剂量率(%ID/g).经尾静脉将99mTc-K237注入荷人肺癌A549裸鼠,于注射后不同时间显像.结果 99mTc-K237的标记率和放化纯均＞95%,其与人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的高特异性结合率为40.36%.99mTc-K237在生理盐水和正常人血清中放置24 h后,其放化纯分别为(89.1±1.4)%和(88.3±1.1)% (t=1.56,P＞0.05).静脉注射99mTc-K237后24 h内,小鼠血液放射性清除迅速,放射性主要聚集在肾脏并经其清除,其他组织器官的放射性随时间逐渐降低.99mTc-K237荷人肺癌A549裸鼠显像示肿瘤组织摄取高,肿瘤与对侧正常组织放射性计数比值(T/NT)高可达3.97±0.31.结论 99mTc-K237易于制备,具有较理想且符合实际的动物体内动力学表现.
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聚酰胺-胺树状聚合物靶向修饰及放射性核素标记研究进展
纳米分子在体内具有药物载体的特性,与生物靶向分子结合,可实现药物的靶向传递;与放射性核素的结合,可实现在体内靶向分布与靶向聚集的可视化,从而达到对特定病变的显像或治疗作用.本文对近年来新型树状纳米分子聚乙酰胺-胺(PAMAM)的靶向分子修饰及核素标记的研究进展进行综述.
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99Tcm-MDP SPECT/CT融合显像诊断骨纤维异常增殖症
目的 探讨99Tcm-MDP SPECT/CT融合显像诊断骨纤维异常增殖症(FD)的临床应用价值.方法 回顾性分析13例FD患者的临床和99Tcm-MDP SPECT/CT融合显像资料,其中11例经病理证实为FD,2例经随访确诊.所有患者均有原发肿瘤病史.结果 13例FD均为单发,位于颅面骨10例,位于肋骨、坐骨及胫骨骨干各1例.全身骨显像定性诊断准确率为38.46％(5/13),SPECT/CT断层融合显像定性诊断准确率为69.23％ (9/13);92.31％ (12/13)的患者全身骨显像表现为中-高代谢;CT征象中,磨玻璃密度影(GGO)和骨质膨胀分别占84.62％ (11/13)和76.92％ (10/13),溶骨性破坏、硬化边分别占53.85％(7/13)、30.77％(4/13),13例均未见骨皮质破坏.结论 99Tcm-MDP SPECT/CT断层融合显像可综合提供功能和解剖学信息,有助于FD的诊断.骨显像中-高代谢及GGO和骨质膨胀的CT征象常提示FD.
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99m Tc标记的MAG3-葡萄糖的制备与生物学评价
目的 制备99mTc-MAG3-葡萄糖(99m Tc-MAG3 -Glu)并研究其肿瘤定位性能,以探讨其应用于肿瘤显像的可能性.方法 β3-N-巯基乙酰基-甘氨酰-甘氨酰-甘氨酰-葡萄糖(MAG3 -Glu)经化学合成并用99mTc标记,对标记物在荷肉瘤S180的小鼠体内的生物分布与显像进行研究,并与18F-FDG的生物分布进行对比.结果 99mTc对MAG3-Glu的标记率大于90％.注射后lh、3h和5 h99mTc-MAG3-Glu在肿瘤中的摄取率分别为(2.45±0.25)、(2.23±0.53)和(2.00±0.89) ％ID/g,注射后5h肿瘤与除肝、肾、肺外的正常组织的T/NT值均高于1.7,其中肿瘤/血液、肿瘤/肌肉和肿瘤/脑分别为1.71、5.71与28.57.静脉注射3h后,肿瘤即可显影,随时间延长,肿瘤与正常组织对比度略有增高.与18F-FDG相比,99mTc-MAG3-Glu在肿瘤中的摄取率以及肿瘤与大多数组织的T/NT值较低,但肿瘤与肌肉、心脏、脾和脑的T/NT值高于18F-FDG,尤其是肿瘤与脑的T/NT值显著高于18F-FDG.结论 99mTc-MAG3-Glu在肿瘤中具有较高的摄取率和较长的滞留时间,有可能应用于肿瘤显像,其肿瘤与脑的摄取比值很高,在脑瘤以及大脑附近的肿瘤显像中较18F-FDG更具优势.
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ID-LC-MS检测血清载脂蛋白A-I和B载脂蛋白的多肽释放研究
目的 研究质谱技术检测载脂蛋白A-I和载脂蛋白B的多肽释放情况,为准确定量蛋白提供依据.方法 方法学研究.确定载脂蛋白A-I和B的目标肽段.以目标肽段为检测对象,用同位素稀释液相色谱串联质谱法测定5份市售人血清样本中的载脂蛋白A-I和B,浓度范围分别为0.90～2.54 g/L和0.54～1.39 g/L.计算不同时间点的多个肽段释放量和速率,并绘制散点图.计算不同样本间,肽段释放量的相关系数R2.结果 多数肽段在4 h内即达释放峰值.Apo A-Ⅰ的肽段VQ、DY和VS,以及Apo B的肽段TE和FP生成速度相对较慢.达到峰值后,TEV/SIL-TEV、AK/SIL-AK和VQ/SIL-VQ的比值相对稳定.对于Apo A-I,不同肽段之间的相关性较高,R2在0.904～0.999之间;对于Apo B,部分肽段之间的相关性较低,如TG-SV的R2=0.543(3 h).结论 Apo A-I和Apo B不同肽段的酶解释放情况不同,合适的选择代表性肽段和酶解条件将有助于准确定量目标蛋白.
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同位素稀释电感耦合等离子体质谱法测定血清钾
目的 建立同位素稀释电感耦合等离子体质谱法(ID-ICP-MS)测定血清钾的分析方法.方法 方法学建立研究.收集2010年朝阳医院检验科体检血清,制备成不同钾浓度的冰冻混合人血清.血清样品处理前加入待测元素39K的富集同位素41K,1％硝酸将血清准确稀释100倍,选择和优化ICP-MS分析条件后,测定其同位素比值,用内插法计算待测血清39K的浓度.3个不同浓度水平的血清各测定3批,评价该方法的精密度,美国国家标准与技术研究所(NIST)血清标准物质SRM909b-Ⅰ、Ⅱ评价正确度,两份血清加入不同浓度钾标物评价回收率,计算不确定度.结果 血清钾测定的总变异系数CV为0.14％～0.11％；NIST血清标准物质SRM909b水平Ⅰ、Ⅱ的总CV为0.39％～0.32％,相对偏差分别为+0.12％、+0.49％.两份血清钾测定回收率为99.68％ ～100.12％.结论 成功建立的血清钾同位素稀释电感耦合等离子体质谱法精密度高、准确性好,是准确定量测定无机元素的理想方法.
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同位素稀释液相色谱串联质谱法测定血清葡萄糖
目的 建立一种使用同位素稀释液相色谱串联质谱法(ID-LC/MS/MS)测定血清葡萄糖的候选参考方法.方法 以[~(13)C_6]葡萄糖为内标,用重量法准确地与血清混合,除去蛋白后在碱性条件下与1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮反应,用LC/MS/MS测定葡萄糖和内标衍生产物,以包括法定量.结果 血清葡萄糖测定的批内、批间和总变异系数的平均值分别为0.36%(范围0.28%-0.42%)、0.47%(范围0.20%-0.67%)和0.61%(范围0.42%-0.76%).加样回收试验的回收率范围为99.0%-100.9%.分析参考物质SRM 965a,测定结果与认定值的平均偏差为-0.20%(范围-0.39%-+0.11%).结论 建立了ID-LC/MS/MS法测定血清葡萄糖的方法,方法准确、精密、简便,可望作为血清葡萄糖测定的参考方法.
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血清尿素测定基质效应研究
目的 评价2007年全国室间质量评价(EQA)临床化学项目材料和13种市售制备物血清尿素测定在7种脲紫外速率法测定系统上的基质效应,并考察这些测定系统的校准偏差.方法 按美国临床和实验室标准协会(CLSI)EP 14-A2试验方案,同位素稀释气相色谱质谱法作比对方法,7种尿素酶常规方法为待评方法,用比对方法和待评方法同时测定25份新鲜冰冻人血清和EQA材料及市售制备物.考察常规方法和比对方法测定EQA材料(或市售制备物)结果间的数量关系与它们测定新鲜冰冻人血清样品数量关系的一致程度,评价样品的基质效应.考察新鲜冰冻人血清样品常规方法和比对方法结果的差异,评价测定系统的校准偏差.结果 8种EQA材料和3种市售制备物对参加评价的所有测定系统无基质效应,1种市售制备物对所有系统都表现基质效应,其他样品视系统的不同而表现出不同的情况.7种测定系统中的6种都存在不同程度的校准偏差:同直线Y=X相比,系统A的斜率、截距偏差均小于5%,不存在明显校准偏差.系统B、C、D、F、G的斜率偏差小于5%,截距偏差大于5%,存在一定的校准偏差.系统E的斜率和截距偏差均大于5%,表现为存在校准偏差.结论 样品的基质效应和测定系统的校准偏差影响血清尿素测定的准确性和可比性.应充分重视基质效应和校准偏差对临床检验量值溯源的影响.
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同位素稀释液相色谱串联质谱法测定血清总甘油
目的 建立同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清总甘油的方法.方法 以[13C3]-甘油作内标,用氢氧化钾异丙醇溶液水解血清甘油酯为游离甘油,将游离甘油转化为苯甲酸酯,用同位素稀释液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)分离检测,用标准曲线法定量.结果 甘油/内标峰面积比与甘油浓度(0.565～4.517 mmol/L)线性相关系数大于0.999 9;测定不同浓度血清总甘油批内变异系数(CV)平均为0.52%(范围0.21%～2.62%),总CV平均为1.15%(范围0.62%～2.00%);分析国际和国家标准物质,测定值与认证值的偏倚小于1%(-0.20%～1.06%).结论 建立同位素稀释液相色谱串联质谱测定血清总甘油方法,方法特异、精密、准确,可望用作血清总甘油测定参考方法.
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同位素稀释液相色谱串联质谱法测定血清肌酐
目的 建立一种使用同位素稀释液相色谱串联质谱法(ID-LC/MS/MS)测定血清肌酐的候选参考方法.方法 以[2H3]肌酐为内标,用无水乙醇沉淀血清中的蛋白质,用氯仿纯化上清液,用液相色谱串联质谱分离测定,以包括法定量.结果 血清肌酐测定的批内、批间和总变异系数的平均值分别为0.57%(范围0.52%～0.61%)、0.43%(范围0.11%～0.59%)和0.73%(范围0.62%～0.83%).加样回收试验的回收率范围为99.09%～101.13%.分析两种参考物质SRM909b和SRM 967b,测定结果与认定值的偏差小于0.4%.结论 建立了ID-LC/MS/MS法测定血清肌酐的方法,方法准确、精密、简便,可望作为血清肌酐测定的参考方法.
