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聚合酶链反应斑点杂交技术在临床乙型肝炎病毒检测中的应用
利用半抗原地高辛配基(digixigenin)制备非同位素标记探针技术,分别标记乙型肝炎病毒全基因探针(DIG-HBVDNA)及乙型肝炎病毒PCR产物C区探针[DIG-HBV(C/preC)],经斑点杂交检测血清HBVDNA及血清聚合酶链反应(PCR)产物,与PCR平行检测122份血清标本.
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DNA印迹法和实时定量PCR法在端粒长度测定中的应用比较
目的:分析并比较测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法在细胞衰老实际研究中的性能.方法:从不同代数(population doublings,PDs)的正常人成纤维细胞(2BS)中提取基因组DNA作为测试样本；对测量端粒长度的DNA印迹法和实时定量PCR法进行优化,以点杂交的方式分析地高辛配基标记检测系统的特异性和灵敏度；分别用两种方法反复测定同一样本的平行样或不同样本并分析比较两种方法测量端粒的分辨率和精确度.结果:实际测量端粒时,地高辛配基标记检测系统虽可检测出小于1 μg的基因组DNA,但优样本量为4～5 μg；DNA印迹法的分辨率约为150 bp,实时定量PCR法的分辨率约为300～400 bp,前者可分辨代龄相差少至2 PDs的2BS细胞端粒长度的差异,而后者只能分辨代龄相差5 PDs以上的端粒差异；实时定量PCR法重复测量误差超过10％,远大于DNA印迹法的2.5％ (P ＜0.001).结论:地高辛配基标记的DNA印迹检测系统完全适用于测量端粒长度,且性能优于实时定量PCR法,但后者方便快捷,可高通量处理样本,所以在细胞衰老研究中,应根据具体情况合理选择相应方法.
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空间学习记忆增强海马B-50 mRNA的表达(简报)
B-50(GAP-43)蛋白是一种神经生长相关蛋白,对于神经发育、外周神经损伤后再生及突触可塑性等过程有重要意义.本组曾报道损伤大鼠尾壳核后B-50 mRNA呈高表达.为探讨生理条件下经过学习记忆练习后与学习记忆相关脑区中B-50 mRNA的表达是否有变化,本实验将雌性成年Wistar大鼠分为实验组、假训组和安静对照组,实验组和假训组训练前禁水,按本组建立的方法,于Y迷宫中对实验组进行饮水奖励空间变换作业训练,假训组亦放入相同的迷宫内任其自由活动,但禁水.每日训练结束后只给动物自由饮水半小时.对照组不禁水亦不置入迷宫内.当实验组的正确反应率达80%以上并保持1周时,将3组动物同时断头取前脑作成15μm厚的冰冻切片,以地高辛配基标记的B-50 cDNA探针(大鼠B-50 cDNA为荷兰RudolfMagnus研究所Verhaagen博士惠赠)进行原位杂交,检测B-50 mRNA的表达情况.
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地高辛标记探针原位杂交在人巨细胞病毒感染鼠脑神经元研究中的应用
目的建立一种适用于检测人巨细胞病毒(HCMV)感染新生乳鼠大脑皮质神经元原代培养物中病毒DNA的原位杂交法.方法制备和培养新生乳鼠大脑皮质神经元并进行病毒感染;在感染后的第3,5天及第1～4周连续取样用地高辛标记的HCMV即刻早期抗原(MIE)和晚期抗原(LA)寡核苷酸特异性探针分别进行核酸原位杂交,检测受染神经元内相应病毒核酸及分布.结果 MIE寡核苷酸探针可在HCMV感染后第4～7天检出神经元核内HCMV DNA;而LA寡核苷酸探针则可稳定地检出感染后第7～28天细胞培养物中的相应病毒核酸;并显示:HCMV DNA杂交阳性信号在感染的早期主要分布在核内,呈灶性;而在感染的晚期,杂交阳性信号均匀分布于受染神经元的核内及胞浆内.结论地高辛标记的HCMV DNA MIE和LA寡核苷酸探针在病毒感染机制研究以及临床诊断等方面,具有广泛的应用前景.
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以地高辛标记探针检测瘦素基因的表达
【目的】 以地高辛（DIG）标记探针检测汉族肥胖者瘦素（ leptin）基因的表达。【方法】 以DIG用随机引物法标记瘦素cDNA片段，以此探针，采用 斑点杂交方法检测11例汉族正常体重者(体重指数，MBI为21.0 kg/m2±1.5 kg/m2)和 12例汉族肥胖者(MBI为28.5 kg/m2±2.3 kg/m2)腹部皮下脂肪组织瘦素 mRNA的表达 水平。【结果】 DIG leptin cDNA探针可检出5 pg的pUC-leptin DNA，与pUC19 DNA无杂交 信号。肥胖组腹部皮下脂肪组织瘦素mRNA相对含量明显高于对照组（312.8±108.9 vs 175.9±81.5，P<0.05）；且与BMI呈正相关（r=0.56，P<0.05）。 【结论】 肥胖者脂肪组织瘦素mRNA水平明显增高，且与BMI呈正相关。
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地高辛标记的原位杂交法检测神经肽Y表达的条件优化
目的:优化用地高辛标记的原位杂交法检测小鼠海马结构中神经肽Y的表达.方法:用体外转录法获得地高辛标记的神经肽Y的反义和正义RNA探针.用kainic acid诱导小鼠脑组织中神经肽Y表达,2 h后牺牲小鼠,制备12μm厚的海马组织切片.然后比较不同pH值(7.5～9.5)的固定剂,不同的固定时间,不同的杂交前预处理,以及不同预杂交及杂交液对杂交信号的影响.结果:从pH 7.5～9.5,不同碱性固定液对杂交信号没有明显影响.30 min的固定时间足以获得满意的杂交结果.用蛋白酶K部分消化切片或用TritonX-100打孔反而降低了杂交信号.40 mg/L Salmon sperm DNA或250 mg/L bakers yeast RNA可获得与Denhardt's杂交液相同的杂交信号.结论:通过优化,我们获得了一种简便而又有效的地高辛标记的原位杂交法,用于检测神经肽Y表达.
