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对几种结核分支杆菌检测方法的初步探讨
结核病是一种较严重的传染病,目前的疫情呈上升趋势,但在结核病早期实验诊断上,传统方法存在一定局限性.近年来,一些针对分支杆菌检测的新方法陆续报道.本文对聚合酶链反应(PCR)法、噬菌体裂解法、斑点杂交一发光自显影法,三种结核分支杆菌检测方法的应用进行评价.
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PCR法制备地高辛标记DNA探针斑点杂交检测副溶血性弧菌tlh基因
目的 建立检测副溶血性弧菌种特异性tlh基因的斑点杂交方法.方法 采用PCR法制备地高辛标记DNA探针,建立斑点杂交条件.杂交反应条件优化如下:杂交温度65℃,杂交时间9～12 h,探针使用浓度100～125 pg/ml.结果 地高辛标记tlh基因探针长度为450 bp,标记产量为50 μg/ml.探针具有较高的灵敏度和特异性,可重复使用4次.结论 本方法具有快速、简便、高效的特点,适用于副溶血性弧菌菌株的鉴定.
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人脑肿瘤猴病毒40的感染状况及来源研究
目的 探讨人脑肿瘤猴病毒40(SV40)的感染状况及来源.方法 采用聚合酶链反应(PCR)和斑点杂交方法,检测人脑肿瘤组织516份,健康人外周血80份,精液50份,人胚胎组织100份,正常人脑组织30份以及SHG44和BT32 5两株人脑胶质瘤细胞系中SV40的DNA序列.结果 人脑肿瘤组织SV40 DNA阳性率为36.4%(188/516);健康人外周血16.3%(13/80);精液22.0%(11/50);人胚胎组织8.0%(8/100);正常人脑组织6.7%(2/30).SHG44及BT325两株细胞中也分别检测出SV40的DNA序列.人脑肿瘤组织、健康人外周血及精液与健康人脑组织及人胚胎组织阳性率相比,差异有显著性(P＜0.05).结论 ①人脑肿瘤有较高的SV40感染率;②SV40与人脑肿瘤的发生有密切关系;③SV40可能通过水平和垂直两种途径在人群中传播.
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聚合酶链反应斑点杂交技术在临床乙型肝炎病毒检测中的应用
利用半抗原地高辛配基(digixigenin)制备非同位素标记探针技术,分别标记乙型肝炎病毒全基因探针(DIG-HBVDNA)及乙型肝炎病毒PCR产物C区探针[DIG-HBV(C/preC)],经斑点杂交检测血清HBVDNA及血清聚合酶链反应(PCR)产物,与PCR平行检测122份血清标本.
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藏药紫金标抗HSV-1的作用机理研究
目的: 探讨紫金标抗单纯疱疹Ⅰ型病毒(HSV-1)的作用及机理,为进一步开发该药提供理论依据.方法:采用不同剂量的紫金标作用于适量HSV-1感染的Vero细胞,以50%组织细胞感染量(TCID50),细胞病变效应(CPE), MTT法和核酸分子杂交作为评价指标.结果: MTT法测得紫金标的50%抑制浓度(IC50)为29.46 mg·L-1, 50%中毒浓度(TC50) 为1 077 mg·L-1,治疗指数(TI)为36.56,结果表明紫金标有明显抑制HSV-1的作用,其作用强度和有效时间与药物浓度成正比.紫金标无直接灭活HSV-1的作用,也不能影响病毒的释放;但可干扰HSV-1对宿主细胞的吸附.不同浓度的紫金标能明显抑制HSV-1gD基因复制和Mrna表达.结论:紫金标具有显著的抗HSV-1的作用,能抑制HSV-1对宿主细胞的吸附以及抑制HSV-1gD基因复制与转录.
关键词： 紫金标 单纯疱疹病毒I型 MTT法 斑点杂交 Northern杂交 -
北京腹泻儿童中G9-Ⅵ轮状病毒再次出现并呈优势流行
1994年从北京腹泻儿童中鉴定的国内首例G9型A组轮状病毒(Group A Rotavirus,RVA)株T203属于G9-Ⅵ(VP7基因进化树支Ⅵ),而之后国内流行的G9型RVAs主要属于全球广泛流行的G9-Ⅲ(VP7基因进化树支Ⅲ).本研究于2010年通过基因测序从北京腹泻儿童中再次鉴定了一例RVA G9-Ⅵ.为了解北京儿童中G9-Ⅵ再次流行的情况,本研究对国内外人G9型RVAs的VP7基因进行多序列比对分析,在G9-Ⅲ和G9-Ⅵ病毒各自VP7基因序列比较保守、彼此间变异集中的区域设计杂交探针,经PCR合成地高辛标记的cDNA探针,建立区分G9-Ⅲ和G9 Ⅵ的斑点杂交方法;结合本实验室前期建立的RVA常见G和P基因型杂交鉴定方法,对2011-2012年门诊腹泻就诊患儿中RVAs的流行进行调查.结果显示G9型检出率高(43.5％,57/131),其次是G3 (30.5％)、G1 (12.2％)和G2 (11.5％),未发现G4型.P分型结果显示P[8]为主要基因型(85.2％),其次P[4]型(14.8％),未发现P[6]型.对57例G9型RVAs全部进行G9-Ⅲ和G9-Ⅵ杂交鉴定.结果显示:G9-Ⅵ占96.5％,取代G9-Ⅲ (3.5％)成为优势流行的G9型病毒.从VP7基因进化树图上看到,本研究鉴定的北京人RVA G9-Ⅵ同国内外近期多地出现的人RVA G9-Ⅵ进化关系密切,并且和加拿大的猪RVA株F7P4进化距离近.国内外新近重新出现的人G9 Ⅵ RVAs是否在进化过程中获得了比以往广泛流行的RVA G9-Ⅲ更强的传播能力或致病力,值得进一步研究.
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cDNA微阵列结合抑制性差减杂交研究对虾白斑综合征病毒部分表达基因
通过抑制性差减杂交技术建立了包含对虾白斑综合征病毒表达性基因的差减文库,并用cDNA微阵列技术进行了鉴定,得到255个正向克隆.对其中的184个正向阳性克隆进行了测序,测序结果通过BLAST与GenBank中序列进行比对,共得到WSSV(white spot syndrome virus,WSSV)基因30个.此次首次鉴定了5个,其中WSV184具有调控蛋白的结构特征(Cys2/Cys2型锌指),WSV321和WSV322含跨膜结构,且存在可能的糖基化位点.有3个被其它研究推断无polyA结构的阅读框所处的mRNA应有polyA结构.进一步用Dot Northern blot对克隆号PCI118(含WSSV阅读框WSV321和WSV322)进行鉴定,表明确实存在该基因的转录.进而根据已报道的WSSV基因序列设计两条引物,用快速扩增cDNA末端技术,扩增WSV321和WSV322两个阅读框所处的cD-NA的5′端片段和3′端片段,分析得到其全长共1 109bp,与已报道的WSSV全基因序列(AF332093)的相关序列完全相同.该mRNA存在polyA,并有加尾信号AATAAA;两个阅读框都没有自己的TATA盒,但都有病毒RNA聚合酶Ⅱ的结合位点-CCAAT盒;它们编码的蛋白质分别有117和227个氨基酸,都存在可能的糖基化位点,其中WSV321一个,WSV322两个.
关键词： 对虾白斑综合征病毒 表达基因 斑点杂交 快速扩增cDNA末端 -
PCR方法制备地高辛标记DNA探针检测中国对虾非包涵体型杆状病毒
对虾白斑症杆状病毒(white spot baculovirus,WSBV)在过去6年内已使包括中国大陆在内的整个亚洲地区对虾养殖业严重滑坡.1992年中国大陆养殖对虾产量为20万吨,居世界首位,自1993年受中国对虾非包涵体型杆状病毒(Panaeus chinensis non-occluded baculovirus,PcNOBV)侵袭暴发虾病以来,年产量仅六、七万吨,造成巨大经济损失.对虾属无脊椎动物,缺乏特异性免疫系统,养殖水体环境的恶化及养殖密度的加大,促进了对虾病毒性流行病的发生和传播.目前有效的防治方法仍然是避免使用带毒亲虾、虾苗及鲜活饵料,尽早发现和消灭传染源.因此,迫切需要建立一种敏感、特异并且适用于基层实验室的检测方法.
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马立克病毒基因缺失疫苗与商品化疫苗的分子鉴别方法
为了对马立克病毒(MDV)meq基因缺失疫苗株SC9-1与商品化MD疫苗CVI988/Rispens株、814株和HVTFC-126株进行分子鉴别,本研究根据疫苗株SC9-1与其它MD疫苗株的基因组差异,分别针对Ⅰ型MDV meq基因以及SC9-1基因组中的禽网状内皮组织增殖症病毒-长末端重复序列(REV-LTR)插入片段,设计三对PCR扩增引物,同时合成针对meq基因和REV-LTR片段的地高辛标记探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法区分SC9-l株与其他疫苗株.结果表明,使用针对meq基因的引物F1/R1进行PCR扩增,SC9-1株、CVI988/Rispens株、814株分别扩增出184bp、1 297bp、1 297bp目的片段,HVT FC-126株没有条带;使用针对meq基因的引物F2/R2进行PCR扩增,CVI988/Rispens株、814株均扩增出746bp目的片段,SC9-1株、HVT FC-126株均没有条带;使用针对REV-LTR片段设计的引物F3/R3进行PCR扩增,SC9-1株扩增出512bp目的片段,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均没有条带.同时,使用针对meq基因的探针进行斑点杂交,CVI988/Rispens株、814株均显示阳性结果,SC9-1株、HVT FC-126株均为阴性;使用针对REV-LTR的探针进行斑点杂交,SC9-1株显示阳性结果,CVI988/Rispens株、814株、HVT FC-126株均为阴性.因此,利用本研究设计的特异性PCR引物以及探针,通过PCR扩增和斑点杂交方法可有效区分SC9-1与其他商品化MD疫苗.
关键词： 马立克病毒(MDV) SC9-1 商品化疫苗 PCR扩增 斑点杂交 -
组织相容性复合体DQ异二聚体与I型糖尿病的相关性
I型糖尿病是一种多基因遗传的慢性自身免疫性疾病，组织相容性复合体(HLA)构成其遗传因素的60%，是I型糖尿病的主效基因。研究资料表明：HLA-Ⅱ类基因区DQA1基因编码的DQα链第52位和DQB1基因编码的DQβ链第57位氨基酸残基的性质是I型糖尿病易感性的决定因子；由于DQα链和DQβ链形成的异二聚体与I型糖尿病存在着易感相关性，而且这种相关性存在一定的人种差异。中国人无此方面的研究报道，因此本课题应用聚合酶链反应和斑点杂交技术对研究对象的HLA基因进行分型并对中国人HLA-DQ异二聚体与I型糖尿病的易感相关性进行了研究。 本课题选取54例I型糖尿病患儿为实验组，患儿均符合WHO I型糖尿病诊断标准，且均为汉族人。选取40例健康成年献血员为正常对照组。首先从研究对象的外周静脉血中提取基因组DNA，用聚合酶链反应(PCR)技术特异性扩增HLA-DQA1，DQB1基因的第二外显子区，然后用地高辛标记的序列特异性寡核苷酸探针进行斑点杂交从而对HLA基因进行分型。DQA1，DQB1引物的扩增产物分别为229bps和214bps。本课题选用的9种探针分别为：DQA1*7504、5503、5502、4102，DQB1*3702、5707、5703、7005、2301。 本课题研究结果表明(表1)：DQA1*0501/DQB1*0201二聚体(病人组50%相对于正常对照组的20%)和DQA1*0301/DQB1*0201二聚体(病人组44.4%相对于正常对照的10%)在病人中的频率显著增加：DQA1*0103/DQB1*0601(P/P)二聚体在对照中的频率显著增加(病人组1.85%相对于正常对照的22.5%)；其余二聚体在病人及对照中的频率分布无显著性差异。 DQα/β异二聚体是指由HLA-DQA1/DQB1基因组合编码的产物组合而成的Ⅱ类分子。DQA1*0501-DQB1*0201基因组合位于DR3单倍型上，本研究中，该基因组合与I型糖尿病易感性显著正相关。DQA1*0301-DQB1*0201基因组合常出现于中国人的DR3/DR4和DR3/DR9杂合子中，本研究中，该基因组合对I型糖尿病构成显著的易感性，与白人，日本人结果一致。DQA1*0103-DQB1*0601基因组合位于DR2或DR8单倍型上，在日本人及本次研究的中国北方人中，该基因组合均对I型糖尿病构成显著的保护性。
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人酪氨酸羟化酶RNA探针制备的研究
目的制备地高辛标记的人酪氨酸羟化酶(hTH2)cRNA探针. 方法用分子克隆技术重组质粒pGEMTH2.用体外转录法制备地高辛标记hTH2cRNA探针,经限制性内切酶分析,显示重组质粒含有酪氨酸羟化酶基因片段,且插入位点正确.使用斑点杂交证实我们制备的探针是敏感而可靠的. 结果杂交阳性部位呈紫蓝色,深浅与稀释度成正比. 结论 Dig标记的hTH2cRNA探针有较好的敏感性和可靠性,可用于基因治疗帕金森病动物模型基因表达的研究.
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川崎病患者淋巴细胞P53基因的检测及临床意义
为探讨急性期川崎病(KD)患者外周血淋巴细胞凋亡延迟的机理,我们采用斑点杂交(Dot-blot)和流式细胞仪(FCM)分别检测KD患者淋巴细胞P53基因mRNA及蛋白质表达水平.
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抗污染PCR与斑点杂交检测血清HBVDNA的比较
目的探讨含dUTP/尿嘧啶DNA糖基化酶的PCR扩增(dUTP/UDG-PCR,抗污染PCR)和斑点杂交检测血清HBVDNA的敏感性和特异性.方法慢性病毒性肝炎患者178例,应用尿嘧啶DNA糖基化酶的PCR扩增及斑点杂交方法分别检测其血清HBV DNA.结果经抗污染PCR检测出HBV DNA阳性标本69份,阳性率为37.86%;经斑点杂交检测出HBV DNA阳性标本54份,阳性率为30.34%.两者比较差异没有显著性(x2=2.79,P>0.05),但可以看出抗污染PCR检测HBV DNA的阳性率高于斑点杂交.两种方法同时检出阳性标本52份,同时检出阴性标本107份,抗污染PCR与斑点杂交检测血清HBV DNA的符合率为89.32%(159/178)结论抗污染PCR的特异性高,其敏感性高于斑点杂交.
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卵巢切除大鼠骨组织白细胞介素-6的基因表达和细胞定位
目的观察卵巢切除大鼠骨组织白细胞介素-6(IL-6)的基因表达及细胞定位.方法大鼠的双侧卵巢被切除2个月后,通过RNA斑点杂交直接测骨组织IL-6 mRNA的表达,通过原位杂交判断产生IL-6的细胞并进行细胞定位.结果卵巢切除大鼠骨组织IL-6 mRNA表达明显升高,为对照大鼠的2.4倍(P＜0.01).骨衬里细胞、成骨细胞和骨细胞具有较强的IL-6 mRNA杂交信号.结论骨组织成骨细胞系表达IL-6 mRNA,卵巢切除导致IL-6 mRNA的表达升高.IL-6在卵巢切除大鼠骨丢失中可能起重要作用.
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牙科手机传播乙型肝炎可能性的动物实验研究
目的 用鸭乙型肝炎病毒(DHBV)血清污染牙科手机,观察污染剂量在斑点杂交方法检不出的情况下,是否具有对动物的感染性.方法 用强阳性鸭肝炎病毒污染的牙科手机,将手机洗脱液一部分运用斑点杂交法对残留病毒DHBV-DNA进行检测作为体外实验;另一部分转染1d龄北京鸭,10d后取血检测DHBV-DNA复制情况作为体内实验.结果 体外实验检测结果均呈现阴性,OD值大为0.422,而体内实验的检测结果发现所有鸭子体内均有不同程度的DHBV-DNA复制,OD值大达到0.861.结论 即使DHBV污染的牙科手机在斑点杂交检测为阴性结果的情况下,也不能排除传播肝炎病毒的可能.
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肾细胞癌组织中b-FGF的表达意义和肿瘤微血管密度研究
探讨碱性成纤维细胞生长因子(b-FGF)在肾癌中表达的意义和其在肾癌微血管形成中的作用及与肾癌生物学特性的关系.采用斑点杂交技术测定20例肾癌患者癌组织、癌旁和正常肾组织b-FGF表达情况; 用免疫组化技术测定35例肾癌患者癌组织、癌旁和正常肾组织b-FGF表达和肿瘤微血管密度(MVD).结果显示,肾癌组织中b-FGF表达明显高于癌旁和周围正常肾组织(P<0.01).b-FGF表达升高与肿瘤分期、分级密切相关;肾细胞癌组织中MVD与b-FGF表达呈明显正相关.提示b-FGF是肾细胞癌组织中重要的血管生长因子之一,b-FGF表达和MVD与肾细胞癌的预后有关.
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裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应及其分子机制初探
目的:以60Co γ射线为参比射线,研究裂变中子诱导小鼠胸腺细胞凋亡的时间效应,并初步探讨其分子机制.方法:用形态学观察、DNA电泳、流式细胞仪(FCM)分析及二苯胺(DPA)法检测细胞凋亡;用斑点杂交方法检测p53与bcl-2的基因表达.结果:小鼠经裂变中子2.5 Gy照射后2～24 h,在各时间点上均检测到胸腺细胞DNA梯状条带,利用光镜与电镜观察到具有典型凋亡特征的胸腺细胞;以DPA法、FCM分析与形态观察计数测定的结果,绘制时间效应曲线,发现胸腺细胞凋亡比例随着照射时间的延长而增加,在6 h前上升较快,8～10 h达到峰值,12 h后开始下降,24 h较4～12 h明显降低(P<0.05),但略高于正常水平.γ射线5.0 Gy照射后,胸腺细胞凋亡比例随时间的变化规律与之相似,但在6 h之前增加较缓;此外,在照后24 h检测不到DNA梯状条带.裂变中子2.5 Gy照射后,小鼠胸腺细胞p53基因表达水平在2、4、12、24 h均比未照射组有显著增加(P<0.05 或 P<0.01);bcl-2基因表达水平均比未照射组明显降低(P<0.01).结论:裂变中子2.5 Gy照射小鼠可诱导其胸腺细胞凋亡,且与γ射线5.0 Gy照射有类似的时相性,但裂变中子诱导的胸腺细胞凋亡比γ射线增加快、持续时间长,表明裂变中子对小鼠免疫系统损伤较重,损伤修复较慢.斑点杂交结果初步表明,裂变中子诱导的小鼠胸腺细胞凋亡亦受p53与bcl-2基因的调控.
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无细胞短棒状杆菌纳米制剂抗鸭乙型肝炎病毒作用研究
目的 探讨无细胞短棒状杆菌纳米制剂(NCPP)抗鸭乙型肝炎病毒(duck hepatitis B virus,DHBV)的活性.方法 麻鸭胫静脉注射抗鸭乙型肝炎病毒阳性血清,建立乙型病毒性肝炎动物模型.无细胞短棒状杆菌纳米制剂给药分高(每羽0.9mg·qod-)、中(每羽0.3 mg·qod-1)、低(每羽0.1 mg·qod-1)3个剂量组,造模后7d肌肉注射,共6次;阳性对照用拉米夫定灌胃(50 mg·kg-1·d-1),共11次;同时设禽α-干扰素对照,口腔滴注(每羽1 000u· qod 1),共6次.分别以斑点杂交法检测给药前,第6天、第12天,停药后第3d鸭血清中抗鸭乙型肝炎病毒-DNA的含量,以病理学检测停药3d后的鸭肝组织.结果 无细胞短棒状杆菌纳米制剂各剂量组与拉米夫定组在各采血时间点的血清抗鸭乙型肝炎病毒-DNA水平与相应的模型组相比均有显著性下降(P＜0.001);中、低剂量组的抑制率均在60％以上,高于拉米夫定在停药3d后的抑制率(58％);禽α-干扰素组对血清中抗鸭乙型肝炎病毒的载量无明显抑制.肝脏病理结果显示,无细胞短棒状杆菌纳米制剂各剂量组肝细胞水肿、脂肪变性及炎性细胞浸润等变化均较模型组有不同程度的改善,以无细胞短棒状杆菌纳米制剂小剂量组对炎性浸润的改善较显著.结论 无细胞短棒状杆菌纳米制剂表现出对鸭乙型肝炎病毒明显的抑制作用,且有利于改善炎症浸润状态.
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应用寡核苷酸探针阵列法快速鉴定临床分离株中的分支杆菌
目的:建立一种简便、快速、灵敏、特异的分支杆菌菌种鉴定方法.方法:通过16S rRNA聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)-单链构象多态性(single-stranded conformation polymorphism,SSCP)分析鉴定253株分支杆菌临床分离株;应用16S rRNA PCR-寡核苷酸探针与待测菌株生物素标记的16S rRNA基因PCR产物进行反向斑点杂交.结果:分析28种分支杆菌标准菌株和9种非分支杆菌菌株,结果显示寡核苷酸探针是特异的.253株分支杆菌临床分离株,198株为结核分支杆菌复合群,55株为非结核分支杆菌.经寡核苷酸探针阵列法分析,198株结核分支杆菌分离株鉴定为结核分支杆菌复合群,36株鉴定为非结核分支杆菌,分别与相对应的特异探针杂交,另19株与分析探针杂交阴性.结论:16S rRNA PCR-寡核苷酸探针阵列法灵敏度高、特异性强、简便、快速,可用于鉴定临床分离株分支杆菌菌种.
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用生物素标记核酸探针检测鼠金黄色葡萄球菌的研究
利用聚合酶链反应技术从金黄色葡萄球菌基因组DNA中扩增出678bp耐热核酸酶nuc基因特异性片段,经生物素标记后作为核酸斑点杂交试验的探针,对实验动物的金黄色葡萄球菌及其临床样品进行了检测.结果显示,标记探针与金黄色葡萄球菌DNA呈杂交阳性,而与链球菌、大肠埃希氏菌和巴氏杆菌DNA呈杂交阴性,斑点杂交的检测灵敏度为1pg基因组DNA.用斑点杂交试验和PCR对240份临床样品进行了检测,检出率为2.9%(7/240),符合率为100%.这些试验结果表明,研究制备的核酸探针及建立的斑点杂交试验具有较高的特异性和敏感性,可用于实验动物金黄色葡萄球菌的快速检测.
