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硝酸盐还原酶试验检测结核分支杆菌耐药性的研究
随着化疗药物的临床应用,全球耐多药结核病形势日趋严峻,给结核病的防治带来很大的困难.
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高效液相色谱法同时测定蔬菜中的硝酸盐和亚硝酸盐
蔬菜中富含硝酸盐,亚硝酸盐在新鲜蔬菜中含量很低,但是在运输、储存、加工过程中由于硝酸盐还原酶和微生物的作用,硝酸盐可被还原为亚硝酸盐.众所周知,长期食入过量含有亚硝酸盐和硝酸盐的食物会引起食物中毒甚至致癌.
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28种蔬菜中亚硝酸盐含量随贮存时间的变化
蔬菜富含硝酸盐,许多蔬菜能从土壤中富集更多的硝酸盐.蔬菜中的硝酸盐在硝酸盐还原酶的作用下可转变为亚硝酸盐,凡有利于某些还原菌生长和繁殖的各种因素(如温度、湿度、pH值等)都可促进硝酸盐还原为亚硝酸盐.亚硝酸盐摄入过多会对人体健康产生危害.而蔬菜是人们必不可少的生活必需品,测定生熟蔬菜中亚硝酸盐含量随贮存时间的变化,控制亚硝酸盐摄入量,预防亚硝酸盐对人体潜在的危害,对保护人们的健康和生命安全有重要意义.
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硝酸盐还原酶一步法测定血清中硝酸盐浓度
为建立简便快速的一氧化氮(NO)间接测定方法,根据硝酸盐还原酶还原硝酸盐(NO3-)至亚硝酸盐(NO2-)的过程中,所消耗的还原型辅酶Ⅱ(NADPH)的量与NO-3浓度呈正比的原理,用340nm处NADPH吸光度的下降值,推算出NO-3的量.所建体系的反应时间为90min,NADPH浓度为6mmol/L,硝酸盐还原酶浓度为500U/L.NaNO3在0 u-mol/L～200umol/L范围内,与NADPH吸光度的变化量具有良好的线性关系,r=0.993.批内变异系数(CV)=4.4%,批间CV=10.5%;回收率为92.36%.20例25～55岁的正常人血清中NO-3浓度为52.42±19.76umol/L.用此法测定血清中NO3-浓度简便快速、特异性高、干扰因素少,不需昂贵仪器,适合实验室常规测量及临床推广使用.
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶基因5'上游序列的克隆与序列分析
目的:克隆杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)基因5'上游序列,并对其进行测序和序列分析.方法:提取杜氏盐藻基因组DNA,经过BamH I、EcoR I、Hind Ⅲ、Pst I、Sal Ⅰ及Xbal Ⅰ限制性内切酶分别酶切后,再与相应接头连接,分别构建盐藻步行基因组文库BL、EL、HL、PL、SL和XL.采用巢式(LA)-PCR方法,从上述步行基因组文库中扩增杜氏盐藻NR基因5'上游序列,克隆至pMD18-T,对酶切鉴定正确的克隆进行测序.结果:从HL里扩出约1 200 bp特异性片断,回收此片段并进行T载体克隆,对阳性克隆测序.该序列的3'端与已知NR基因cDNA 5'端序列完全一致.该序列含有多个与转录调控有关的保守序列(如CAAT-box和GAGA-box),含有与EBP、EFII、NF-E1、LV 等转录因子以及广谱激活剂Oct-1结合位点相似的核苷酸序列.结论:采用LA-PCR基因组步行方法,从已知cDNA 周围未知启动子或其他调控区域中克隆得到的NR基因的5'上游区序列,可能是一种新的杜氏盐藻启动子区序列.
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶缺陷型突变株的筛选与鉴定
目的:制备杜氏盐藻氯酸盐抗性突变株库并从中筛选出硝酸盐还原酶(NR)缺陷型突变株,测定其NRcDNA全长序列,分析其突变位点.方法:①用乙基亚硝基脲(ENU)对杜氏盐藻进行诱变,得到突变株库.然后用氯酸盐抗性筛选方法获得氯酸盐抗性藻株,经复筛和不同氮源生长试验,获得了氯酸盐抗性突变株库.再用96孔板法进行单藻培养,获得氯酸盐抗性突变株单藻群.用磺胺比色法测定各个单藻群的NR活性,挑选出NR活性完全丧失的突变株.然后用氯酸盐抗性实验和不同氮源生长实验验证其NR突变的稳定性.②根据已知的盐藻NR全长序列,设计3对PCR引物,提取突变株盐藻细胞mRNA,反转录成cDNA,分3段扩增其NR cDNA的全长序列,产物与T载体连接后转化至大肠杆菌JM109中,经筛选后测序,测序结果与野生型盐藻NR eDNA序列比较,分析其突变位点.结果:序列分析表明,3株突变株共有11处相同的突变,其中的3处点突变引起了氨基酸性质的改变.它们均在近3'端有一段相同的移码突变,造成19个氨基酸的完全改变.此外,2株还分别由于在1 235和1 639的位点突变而产生了一个终止密码子.结论:筛选出了3株杜氏盐藻NR完全缺陷型突变株.
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶缺陷型突变藻株的分离和初步鉴定
目的:分离制备杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)缺陷型突变藻株并进行初步鉴定.方法:①杜氏盐藻经乙基亚硝基脲(ENU)诱变后,利用氯酸盐抗性筛选方法获得氯酸盐抗性藻株,经复筛和不同氮源生长实验,获得NR缺陷型突变藻株.②用磺胺比色法测定酶反应生成的亚硝酸盐(NO2-)的浓度,从而计算出盐藻NR活性.比较突变藻株与野生型杜氏盐藻NR活性,作出初步鉴定.结果与结论:共获得30株NR缺陷型突变藻株,共有6株NR活性显著降低.杜氏盐藻NR缺陷型突变藻株成功建立.
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段的克隆与分析
目的:获得杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段.方法:根据Dunaliella tertiolecta、衣藻、团藻等生物硝酸盐还原酶(nitrate reductase,NR)高度保守序列EGWWFKP、WNVMGMM设计一对简并引物,以含硝酸盐培养基培养的的盐藻cDNA为模板,进行PCR扩增,产物克隆至T载体后转化大肠杆菌JM109,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列,并与Dunaliella tertiolecta、团藻、衣藻、小球藻等进行同源性分析.结果:在盐藻中所获得的cDNA片段,核苷酸长度为381 bp,编码127个氨基酸.推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较:Dunaliella tertiolecta为88.2%同源,团藻为78%,衣藻为67%,小球藻为59%.结论:所克隆的序列为盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段.
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杜氏盐藻硝酸盐还原酶5'端cDNA片段的快速扩增
目的:根据已扩增的杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA的部分序列,利用5'RACE的方法扩增其5'上游未知片段.方法:根据盐藻硝酸盐还原酶cDNA已知的部分序列,设计一条磷酸化反转录引物、2对特异性反向PCR引物.提取盐藻细胞mRNA,利用5'RACE的方法反转录成cDNA,然后利用PCR方法扩增5'上游序列,产物与T载体连接后转化至大肠杆菌JM109中,经筛选后测序,将测序结果推导成氨基酸序列进行同源性分析.结果:在盐藻中所获得的cDNA片段,核苷酸长度为431 bp,编码143个氨基酸.推导的氨基酸序列与下列物种的硝酸盐还原酶进行同源性比较:Dunaliellatertiolecta为83%,衣藻为68%,团藻为66%,小球藻为64%.结论:所克隆的序列为杜氏盐藻硝酸盐还原酶cDNA片段.
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实时荧光定量聚合酶链反应检测杜氏盐藻突变株中硝酸盐还原酶基因的表达
目的 分析获得的2株杜氏盐藻硝酸盐还原酶(NR)突变藻株(M1和M2)中NR基因的表达情况.方法 应用实时荧光定量聚合酶链反应(qPCR)方法,以管家基因β-actin作为内参,进行相对定量检测比较NR基因的表达变化.结果 盐藻突变藻株NR基因相对表达量明显低于野生型杜氏盐藻.所分离的杜氏盐藻NR突变藻株中确实存在NR基因的突变.结论 本研究为终利用NR基因作为选择标记,建立杜氏盐藻专用筛选标记奠定了实验基础.
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固体硝酸盐还原酶用于结核分枝杆菌药敏试验的可行性研究
目的 探讨固体硝酸盐还原酶试剂用于结核分枝杆菌药物敏感性试验的可行性.方法 以标准绝对浓度法为参考方法,对79株不同耐药模式的结核菌进行固体硝酸盐还原酶药敏试验,并对两种试验结果进行kappa检验.结果 三种一线抗结核药物的敏感性和特异性分别为:利福平:94.6%和97.6%;异烟肼:97.7%和88.2%;链霉素:97.2%和95.3%.经kappa检验,k系数分别为0.92,0.87,0.92.74.7%的菌株在7天就获得药敏试验结果,10天为98.7%,14天达100%.结论 固体硝酸盐还原酶试剂配制简单,保存时间长,用于结核分枝杆菌药敏试验,省时且经济适用.
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显微分光光度法测定氮氧化物
在还原底物NADPH及硝酸盐还原酶的催化下，显微分光光度法测定细胞及其培养液的氮氧化物含量，得到满意结果：Sander灵敏度为3.8×10-6 μmol/cm2，变异系数 CV 3.96%(n=8)，标准添加回收率100.0%±4.96%，浓度(C)与吸光值(A)的线性范围为0.15～1.00 μmol/L，其回归方程为C=-0.018+1.099A(r=0.9958，P＜0.01)，在合适的还原条件下，酶促的还原效率95.9%。本法适用于生物样品中微量氮氧化物的分析。
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显微分光光度法测定氮氧化物
在还原物质NADPH及硝酸盐还原酶的催化下,显微分光光度法测定细胞及其培养液的氮氧化物含量,得到满意结果:Sander灵敏度为3.8×10-6μmoL/cm2,变动系数(CV%)3.96(n=8),标准添加回收率(100.1±4.96)%,浓度(C)与吸光值(A)的线性范围为0.15～1.00μmoL/L,其回归方程为C=-0.018+1.099A(γ=0.9958,P<0.01),在合适的还原条件下,酶促的还原效率为95.9%.本法适用于生物样品中微量氮氧化物的分析.
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噬菌体变色法检测结核分支杆菌的临床研究
目的 初步建立一种结核分支杆菌快速检测方法 .方法 取两支无菌培养管,一支加入结核分支杆菌标准株(H37Rv)或者处理后的痰标本液;另一支加入蒸馏水作对照.两支试管均加入噬菌体D29,37℃培养90min,用硫酸亚铁铵杀死结核分支杆菌菌体外的噬菌体,柠檬酸三钠和氯化钙混和液中和硫酸亚铁铵.加入耻垢分支杆菌和硝酸钾,37℃培养6h,加入显色剂显色.同时应用噬菌体显色法和改良罗氏培养法检测20份临床标本,观察两种方法 的检测效果.结果 该方法灵敏度和特异性都为100%;临床标本的本法和罗氏检测表明两方法结果具有一致性(P＞0.01).结论 噬菌体变色法可作为结核分支杆菌的快速检测方法 .
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噬菌体变色法检测结核分枝杆菌
目的 建立一种结核分枝杆菌快速检测方法.方法 痰标本常规处理,离心集菌,取100μ1于试管中,另一支加入标准株H37Rv结核分枝杆菌作阳性对照.两支试管分别加入噬菌体D29,37℃培养,用硫酸亚铁铵杀死结核分枝杆菌茼体外的噬菌体,柠檬酸三钠和氯化钙混和液中和硫酸亚铁铵.加入耻垢分枝杆菌和硝酸钾,37℃培养过夜,加入显色剂显色.同时用罗氏培养方法对照检测.结果 临床标本的噬菌体变色法和罗氏培养法表明两方法结果具有一致性(P＞0.05).结论 噬菌体变色法可作为结核分枝杆菌的快速检测方法之一.
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液体培养基比色法快速检测结核分枝杆菌耐药性
目的探讨液体培养基比色法在结核分枝杆菌(MTB)耐药性快速测定中的应用价值.方法将MTB分别接种于含药和不含药的液体培养基中,37℃培养6d,然后加入NaNO3试剂,37℃培养1d,进行硝酸盐还原检测试验.根据液体培养基颜色变化情况,判断药敏结果.将检测结果与Bactec-960测定结果比较,分析硝酸盐还原酶比色法检测MTB耐药性的敏感性、特异性和准确性.结果以Bactec-960检测结果为判断标准,液体培养基比色法检测链霉素、异烟肼、利福平和乙胺丁醇耐药性结果与Bactec-960的符合率分别为100.0%、96.9%、98.1%和97.5%.结论液体培养基比色法检测MTB耐药性具有很高的敏感性和特异性,且需时较短、操作简便、结果准确、不需特殊仪器设备,可作为MTB耐药性的快速筛选方法.
关键词： 结核分枝杆菌 药敏试验 硝酸盐还原酶 Bactec-960 -
微量元素钼与人体健康
生命所必需的微量元素金属元素绝大部分是第一过渡系元素,钼是唯一的第二过渡系元素.钼在人体内的重要生物功能是组成金属酶--钼酶.目前已知的钼酶都是氧化还原酶,所以缺钼引起这些钼酶的活性降低,使人体生理功能发生障碍.如:缺钼会使黄嘌呤氧化酶活性降低,易造成尿酸钠盐在人体内沉积,易患痛风和肾结石,缺钼会使硝酸盐还原酶活性降低,强致癌物亚硝酸胺在体内积聚,易患癌症.所以探究微量元素钼与人体健康的关系也是二十一世纪生命科学的重要内容之一.
