有机碳源及无机碳源对杜氏盐藻生产的影响

杜氏盐藻(Dunaliella salina)是单细胞、无细胞壁的绿藻类浮游生物,一般生长于海水、成水湖及盐池中,可耐高盐度(20～300).本文就有机及无机碳源对杜氏盐藻生产方式造成的影响进行研究,探索有机碳源和无机碳源对培养杜氏盐藻的影响,并试图从其中寻找培养的合适的碳源.

杜氏盐藻叶绿体chlL基因的克隆

目的克隆和鉴定杜氏盐藻叶绿体chlL基因.方法根据衣藻、小球藻等绿藻叶绿体chlL基因序列,利用软件分析找出其高度保守区,据此设计引物,PCR扩增杜氏盐藻叶绿体chlL基因序列.结果序列分析表明所克隆的序列691bp与四种绿藻--莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)、普通小球藻(Chlorella vulgaris)、绿肾藻(Nephroselmis olivacea)和Mesostigma viride的DNA序列同源性分别为75.6%、76.7%、71.8%、76.7%;而所编码蛋白的氨基酸序列同源性分别为89.1%、89.1%、85.2%、90.9%.结论所克隆的序列证实是杜氏盐藻的叶绿体chlL基因.

杜氏盐藻叶绿体表达载体p64C-ANG-AAD的构建

目的构建表达载体在杜氏盐藻叶绿体中表达重组人血管抑素(Angiostatin,ANG).方法利用基因工程技术将构建完整的人ANG基因插入到叶绿体启动子atpA5和终止子rbcL3′间,组成atpA-ANG-rbcL表达盒,将此表达盒与aadA表达盒串接后,插入含叶绿体同源片段的质粒载体p64上,构建成血管抑素盐藻叶绿体表达载体p64C-ANG-AAD.结果酶切鉴定结果表明,2.2kb的ANG表达盒和1.9kb的aadA表达盒已按照预期顺序插入到质粒p64C上叶绿体chlL基因间.结论叶绿体表达载体p64C-ANG-AAD可以应用于杜氏盐藻的叶绿体转化,表达重组人血管抑素.

内蒙古吉兰泰杜氏盐藻营养成分的研究

杜氏盐藻对不同价态铁的吸收机制研究

目的 通过向培养液中添加不同浓度的硫酸亚铁和三氯化铁,研究其对盐藻生长的影响,及盐藻对不同价态铁的吸收机制.方法 紫外分光光度计检测其对盐藻生长的影响,原子吸收检测盐藻胞外溶解态、吸附态和胞内吸收态铁的富集规律,并用红外光谱检测盐藻富集前后红外吸收的变化.结果 当硫酸亚铁的浓度为12.5 μmol·L-1、三氯化铁的浓度为25 μmol·L-1时,盐藻生长较旺盛.随着培养周期的延长,胞外溶解态铁逐渐降低,膜吸附态和胞内吸收态铁呈现增长趋势,整个培养周期,铁的总量保持不变.另外,铁离子的添加并未对盐藻细胞分子官能团产生伤害.结论 当硫酸亚铁浓度为12.5 μmol·L-1时,盐藻具有好的生长状态,Fe2+是盐藻的主要吸收形式,盐藻对铁的吸收是1个循序渐进的过程.

杜氏盐藻对氯酸盐的敏感性及氯酸盐抗性株的分离

目的 考察杜氏盐藻对氯酸盐的敏感性及其在分离盐藻氯酸盐抗性株中的作用.方法 测定了不同浓度的氯酸钾和氯酸钠对杜氏盐藻的抑制作用,并利用确定浓度的氯酸盐从盐藻化学诱变库中分离氯酸盐抗性株.结果 杜氏盐藻对氯酸钾的敏感浓度(细胞致死浓度,下同)为100 mmol/L,对氯酸钠的敏感浓度为200 mmol/L.利用200 mmol/L氯酸钠作为筛选剂,从化学诱变库中筛选了3株氯酸盐抗性突变株.结论 盐藻对氯酸盐中度敏感,可以利用氯酸盐抗性分离杜氏盐藻硝酸盐还原酶突变株,从而建立盐藻筛选标记体系,为利用转基因盐藻生产抗癌药物血管抑素奠定基础.

杜氏盐藻基因组文库的构建

目的构建杜氏盐藻基因组文库,旨在进一步分离和研究杜氏盐藻基因的结构和功能.方法采用改进的SDS裂解法提取杜氏盐藻基因组DNA,通过限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切,用T4 DNA连接酶将目的片段与噬菌体EMBL3载体臂进行连接后转染大肠杆菌LE392.结果体外包装构建了杜氏盐藻基因组文库,得到重组子数为2.2×104,经测定文库滴度为2.2×105pfu/mL.结论构建了杜氏盐藻基因组文库,为进一步筛选盐藻重要基因及其序列分析奠定基础.

基于RNA-seq的杜氏盐藻全转录组测序与分析

目的:利用RNA-seq技术对杜氏盐藻细胞的全部转录本进行测序、功能分析.方法:提取杜氏盐藻总RNA,反转录得cDNA,在Illumina平台上进行测序,经拼接、组装、聚类后获得全部unigene,并将所得unigene与数据库比对,对其进行功能注释和分类.结果与结论:共得到197 295个unigene,将获得的unigene与NR、SWISS-PROT、CDD、KEGG和TREMBI数据库进行比对,有89 800个unigene获得注释.其中95 767个unigene映射到GO的不同功能节点;5 710个unigene获得COG注释,并分为22个功能分类;9 497个unigene获得了KEGG注释,映射到282条信号通路.所得杜氏盐藻的转录组信息为今后相关研究与应用提供了丰富的资源和线索.

光照强度及盐浓度对杜氏盐藻生长及β-胡萝卜素积累的影响

目的:探讨光照强度和盐浓度对杜氏盐藻生长和细胞内β-胡萝卜素积累的影响.方法:检测正常培养条件下杜氏盐藻生长情况和β-胡萝卜素变化,不同浓度(0.5、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mol/L) NaCl培养后细胞内β-胡萝卜素的积累情况.采用高光(5 000～6 000 Lux)、高盐(3.5 mol/L NaCl)及高光高盐条件对培养至对数生长末期的杜氏盐藻进行β-胡萝卜素积累的诱导.结果:正常条件下杜氏盐藻培养2周后进入稳定期,细胞内β-胡萝卜素含量呈先下降后上升趋势,第9天达到大值,随后出现小幅度波动;杜氏盐藻细胞内β-胡萝卜素含量随NaCl 浓度升高而升高,二者呈正相关(r =0.969,P＜0.001).与正常条件相比,高光、高盐单独作用均能够提高细胞内β-胡萝卜素含量,而高光高盐联合作用有利于杜氏盐藻细胞β-胡萝卜素的积累.结论:高光高盐联合作用可作为杜氏盐藻细胞内β-胡萝卜素的佳诱导条件.

杜氏盐藻环盒子1相互作用蛋白的酵母双杂交法筛选

目的:构建杜氏盐藻环盒子1(RBX1)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-RBX1,筛选与RBX1相互作用的蛋白.方法:采用PCR技术扩增杜氏盐藻RBX1的开放阅读框,测序分析后插入酵母表达质粒,构建诱饵载体pG-BKT7-RBX1.将酶切鉴定正确的诱饵载体用PEG/LiAc法分别转化到酵母菌Y187和AH109中,通过表型筛选检测RBX1对酵母菌有无自激活和毒性作用.转化诱饵质粒的Y187与文库菌AH109杂交,待三叶草形状的合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选阳性克隆并测序.结果:成功构建了pGBKT7-RBX1,它对Y187和AH109两种酵母菌既无自激活又无毒性作用.杂交后筛选得到两个阳性克隆,阳性克隆1与莱茵衣藻和拟南芥中氧化还原酶铁硫蛋白亚基的同源性为38％和39％,阳性克隆2与莱茵衣藻中转化抑制剂蛋白的同源性为57％.结论:诱饵载体pGBKT7-RBX1可用于酵母双杂交.成功筛选得到两个阳性克隆,可能是与RBX1相互作用的蛋白.

杜氏盐藻过氧化物酶1酵母双杂交诱饵质粒的构建

目的：构建杜氏盐藻过氧化物酶1（ DsPrdx1）的酵母双杂交诱饵质粒并检测其对酵母细胞有无自激活及毒害作用。方法：PCR扩增DsPrdx1的开放阅读框，将扩增出的基因片段插入酵母表达质粒pGBKT7中构建诱饵质粒。经酶切鉴定正确后，用PEG/LiAc法将构建的诱饵质粒分别转化到酵母菌株Y187和AH109中，检测诱饵蛋白对酵母菌有无自激活和毒性作用。结果与结论：构建的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-Prdx1对Y187和AH109既无自激活又无毒害作用，可用于酵母双杂交系统。

含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体表达载体的构建

目的：构建含翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。方法：采用RTP-CR 的方法，获得含有人canstatin 的cDNA片段以及分别在5’UTR下游和3’UTR上游添加了翻译增强序列（ UUAACUUUA）的人canstatin cDNA 片段，将得到的目的片段分别连接到PMD18-T载体上，利用该载体将目的片段连接到荧光素酶基因Lux Ct表达盒中并进行酶切鉴定。结果：RT-PCR分别得到约700 bp的cDNA片段并克隆到PMD18-T载体上。用PaeR7Ⅰ、SphⅠ双酶切 Lux Ct质粒，得到2100 bp和10000 bp 的2条片段。然后，将大片段回收后分别与上一步得到的cDNA片段进行连接，酶切鉴定结果显示含有翻译增强序列的人canstatin 片段成功插入到Lux Ct质粒中。结论：成功构建了含有翻译增强序列的人canstatin杜氏盐藻叶绿体重组表达载体。

杜氏盐藻糖原合成酶激酶3cDNA片段的克隆及其在鞭毛再生中的功能

目的:克隆杜氏盐藻糖原合成酶激酶3(GSK3)基因序列并探讨它在鞭毛再生中的作用.方法:根据杜氏盐藻转录组测序得到的GSK3的2个片段设计上下游引物,提取盐藻总RNA进行 RT-PCR,以此为模板扩增2个片段之间的序列.采用3RACE方法扩增杜氏盐藻GSK3基因3端序列,通过杜氏盐藻消减杂交模板扩增得到5端序列.采用pH休克法去除杜氏盐藻鞭毛,通过实时荧光定量PCR观察鞭毛再生过程中GSK3基因在转录水平上的变化.结果:获得一段长为2 116 bp的GSK3 cDNA片段,其中包含737 bp的3UTR和1 158 bp的开放阅读框.实时荧光定量PCR结果表明,GSK3的mRNA转录水平在鞭毛再生过程中明显升高.结论:杜氏盐藻GSK3基因与鞭毛再生密切相关.

杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白88在鞭毛组装过程中的功能分析及其原核表达

目的:克隆杜氏盐藻鞭毛内运输蛋白(IFT)88的cDNA全长并分析其部分功能.方法:根据盐藻转录组测序片段,分别设计其3端内、外侧引物及5端内、外侧引物,PCR扩增其全长.提取盐藻再生过程中不同时间段的总RNA,逆转录后进行实时荧光定量PCR,检测IFT88 mRNA的表达情况.随后利用ORF finder预测并扩增其开放阅读框,连接到pET28a载体上,转化大肠杆菌BL21(DE3),并在1 mmol/L IPTG、37 ℃的条件下诱导4 h,提取总蛋白,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测IFT88蛋白表达情况.结果:克隆拼接后共得到开放阅读框2 400 bp,编码799个氨基酸.BLAST显示该氨基酸序列与多个物种的IFT88有较高同源性.SDS-PAGE结果显示,与未诱导组相比,诱导组在90 000左右有一条明显的条带.在鞭毛再生过程中,杜氏盐藻IFT88 mRNA的表达量在去鞭毛后30 min左右时高,随后快速下降.结论:扩增得到杜氏盐藻IFT88 cDNA序列且IFT88可能参与盐藻鞭毛组装.

与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的新蛋白的酵母双杂交筛选

目的:用酵母双杂交的方法筛选与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基(FLA8)C端相互作用的蛋白.方法:设计特异性引物(上下游分别引入EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点),扩增FLA8 C端(433个氨基酸)cDNA,与穿梭载体pGBKT7连接以构建诱饵表达载体,然后转化酵母菌株Y187和AH109,Western blot法检测诱饵蛋白在转化酵母菌株内的表达.通过自激活实验和毒性实验检测诱饵表达载体是否适合利用酵母双杂交的方法筛选相互作用蛋白.转化诱饵质粒的酵母菌株Y187与AH109(文库菌)杂交,待三叶形合子形成后用营养缺陷型培养基和α-半乳糖苷酶活性实验筛选阳性克隆,并对阳性克隆进行测序.结果:成功构建了pGBKT7-FLA8-C双杂交诱饵载体;经检测该载体的表达产物对Y187和AH109均无自激活和毒性作用,可用于酵母双杂交实验;杂交后筛选得到2个阳性克隆,测序结果显示为鞭毛结合蛋白107(FAP107)和含蛋白结合结构域的预测蛋白.结论:成功筛选得到了与杜氏盐藻驱动蛋白Ⅱ动力亚基C端相互作用的蛋白,分别为FAP107和预测蛋白.

杜氏盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN1622-CAT的构建

目的:构建杜氏盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN 1622-氯霉素乙酰转移酶(CAT).方法:以光非依赖性的原叶绿素酸酯还原酶chlN基因为同源片段,以CAT抗性基因为选择标记,构建盐藻叶绿体转化载体pUC-chlN 1622-CAT,并通过电击法转入野生型盐藻细胞,筛选转化藻株.结果:在氯霉素浓度为300 mg/L的选择压力下,野生型盐藻10 d左右死亡,转化藻仍正常生长,得到表达氯霉素抗性的盐藻转化株.结论:以chlN基因作为同源片段构建盐藻叶绿体转化载体是可行的.

杜氏盐藻基因FLA8原核表达载体的构建和表达

目的:构建杜氏盐藻FLA8原核表达载体.方法:用RT-PCR方法扩增杜氏盐藻FLA8基因的开放阅读框,通过预先添加的酶切位点切割后按正确的顺序插入到经相同酶切割后的原核表达载体pET28a(+)中,转化到大肠杆菌DE3中测序正确后进行原核表达.结果:成功地将FLA8的开放阅读框插入到表达载体中,FLA8在大肠杆菌中的表达主要以包涵体的形式存在,蛋白质的相对分子质量为87 000.结论:杜氏盐藻FLA8基因原核表达载体构建成功.

杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶在真核细胞中的表达

目的:分别构建杜氏盐藻葡萄糖-6-磷酸异构酶(DsGPI)绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体.方法:PCR扩增得到上、下游分别添加EcoRⅠ和BamHⅠ酶切位点的DsGPI基因,双酶切后与绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-C1连接,得到重组载体pEGFP-C1-DsGPI,转染狗肾细胞MDCK,观察绿色荧光蛋白在细胞中的定位;同理将上、下游分别添加BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点的DsGPI基因与真核表达载体pcDNA3.1(+)连接,得到pcDNA3.1-DsGPI,转染食管癌EC9706细胞,分别应用RT-PCR法和Western blot法检测DsGPI mRNA和蛋白的表达.结果:DsGPI在MDCK细胞中定位于细胞核,在EC9706细胞中被有效表达.结论:成功构建了DsGPI的绿色荧光蛋白表达载体和真核表达载体.

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶酵母双杂交诱饵载体的构建及自激活和毒性检测

目的:构建杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHH)的酵母双杂交诱饵载体pGBKT7-SAHH,并检测其对酵母细胞的毒性和自激活作用.方法:应用RT-PCR扩增杜氏盐藻的SAHH cDNA,测序分析后与酵母双杂交诱饵载体pGBKT7连接,构建诱饵载体pGBKT7-SAHH.用PEG/LiAc法将诱饵载体转入AH109和Y187酵母中,通过表型筛选检测诱饵蛋白对酵母有无毒性和自激活作用.结果:成功构建了诱饵载体pGBKT7-SAHH并成功转化到酵母细胞AH109和Y187中,表达的融合蛋白对宿主酵母细胞无毒性.在AH109和Y187酵母细胞中诱饵载体均未激活报告基因HIS3和ADE2,但是激活了报告基因MEL1.结论:诱饵载体pGBKT7-SAHH可用酵母双杂交方法筛选与SAHH相互作用的蛋白.

杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶基因的克隆及功能分析

目的：探讨杜氏盐藻S腺苷高半胱氨酸水解酶(SAHase)基因在鞭毛再生中的作用。方法：通过设计简并引物及RACE法克隆了杜氏盐藻SAHase基因全长，使用pH休克法对杜氏盐藻进行鞭毛去除及再生，通过实时荧光定量PCR研究在转录水平上SAHase基因的变化。结果：所克隆的杜氏盐藻SAHase基因cDNA全长1 926 bp，包含ORF 1 458 bp、3’UTR 61 bp和5’UTR 407 bp。实时荧光定量PCR结果显示，在鞭毛再生的过程中，SAHasemRNA转录量升高，其水平在3 h时达到了未处理组的3倍左右。结论：杜氏盐藻的SAHase基因与鞭毛再生有关。