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Survivin基因在乳腺癌中的研究进展
Survivin是1997年耶鲁大学Altieri实验室利用效应细胞蛋白酶受体(effector cell protease receptor-1,EPR-1)cDNA筛选人基因组文库获得的凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP).
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构建用于相关基因筛选的微囊藻产毒株基因组文库
目的构建含有微囊藻毒素(MC)表达相关基因的基因组文库,用于分离MC相关基因或鉴别MC表达藻株. 方法使用MC产毒藻株NIES-90,获取基因组DNA,酶切制备片段,克隆到质粒pUC18中,转化JM109构成基因组文库.结果建成容量覆盖蓝绿藻基因组10倍以上,插入片段介于200～700 bp的NIES-90基因组文库,其中获得至少一段序列具有NIES-90特异性,可能为MC相关基因.结论构建文库成功,可用于后续MC特异性基因研究.
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鳜鱼传染性脾肾坏死病毒基因组文库和物理图谱的建立
鳜鱼(Si n ipterca chuats i)是我国名优淡水养殖品种.自1994年以来,广东地区养殖的鳜鱼发生传染性脾肾坏死病毒(infectious spleen and kidneynecrosis virus,ISKNV)流行,导致养殖鳜鱼大批死亡,造成了严重的经济损失[1,2 ].该病毒感染鳜鱼脾、肾、肝脏、鳃、脑、性腺、心脏和消化道等组织器官,脾和肾是其主要感染器官,而肝脏、鳃、脑、性腺、心庄和消化道不是其主要感染器官,在光镜下偶见受感染细胞[3].ISKNV致病性强,浸泡感染和注射感染ISKNV,在25℃～34℃范围内,受感染鳜鱼在7～12天内死亡率为100%.
关键词： 鳜鱼传染性脾肾坏死病毒 基因组文库 物理图谱 -
光纤微珠芯片技术及其在医药研究领域中的应用
基因芯片技术是近年来与人类基因组研究同步发展起来的新技术,在基因表达谱测定、突变检测、多态性分析、基因组文库建立及杂交测序等多方面具有较高的应用价值,为现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具[1].在经历了微点样芯片、光原位合成芯片两代基因芯片产品之后,目前美国Illumina公司己研制出新一代基因芯片产品--光纤微珠芯片.光纤微珠芯片是利用独特的微珠阵列(BeadArray)技术生产的芯片,具有高密度、高重复性、高灵敏度、低上样量、定制灵活等特点,克服了传统芯片的多个技术瓶颈,不仅检测筛选速度很高,也显著降低了研究成本[2].本文对光纤微珠芯片的工作原理、主要类型以及在医药研究领域中的应用等作一简介.
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微阵列技术及其在消化系疾病研究中的应用进展
微阵列技术是近年来兴起的一项前沿生物技术,他利用分子杂交的原理,将生物学中许多不连续的分析过程,移植到固相的递质芯片上,进行样品的多方位分析,首次提供了高通量或平行监测基因表达变化和功能的新方法.已广泛应用于基因表达分析、新基因发现及功能研究、基因组文库作图、基因突变及多肽性分析、疾病诊断、药物筛选、基因测序等领域.利用基因微阵列研究消化系统疾病将会有助于从整体水平上认识疾病发生中相应的分子事件,更深刻地了解消化系肿瘤与疾病的基因变化路径和机制.本文综述了微列阵技术原理及近年来在消化系疾病研究中的应用.
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cDNA微阵列和抑制消减杂交技术筛选胃癌下调功能基因组的研究
目的筛选胃癌下调基因组,发现新的胃癌下调基因.方法采用cDNA微阵列技术,检测5例胃癌与相对应正常胃粘膜间mRNA表达差异基因,筛选胃癌下调基因组.采用抑制消减杂交技术,建立5人份正常胃粘膜mRNA抑制消减杂交胃癌mRNA的差异表达文库,用聚合酶链反应及差异表达克隆菌转膜反向杂交判定其肖减效率.随机挑选阳性克隆测序,寻找胃癌下调新基因,并经逆转录-聚合酶链反应证实.结果筛选到60个胃癌下调基因,其中包括抑癌基因,凋亡相关基因,DNA复制、转录、翻译相关基因,细胞周期相关基因,细胞迁移相关基因等.克隆到两个胃癌下调的新基因片段.结论得到60个胃癌下调基因,它们共同作用与胃癌的发生、发展、转移密切相关.成功建立了用于筛选胃癌下调新基因的抑制消减杂交cDNA文库,发现了两个新的胃癌下调基因片段.
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奇异变形菌基因组文库的构建及标识序列的发现
目的:构建用于筛选奇异变形菌的特异序列的基因组文库,并从中筛选变形杆菌特异的标识序列.方法:提取奇异变形菌的基因组DNA,用Sau3AI部分酶切,回收酶切产物,然后与BamHⅠ酶切的pUC19质粒连接,转化JM109,构建奇异变形菌的基因组文库.随机挑取抗性克隆,用位于质粒上的引物进行扩增,确定插入片段的大小及分布情况.DNA测序确定部分克隆中插入的序列,根据序列设计引物,分析这些序列在奇异变形菌临床分离株中的分布,验证序列的特异性.结果:成功构建了奇异变形菌的基因组文库,库容量达到1.1×105 CFU.阳性克隆的比例为95%,插入片段大小主要分布在200~500 bp的范围.对其中14个克隆进行了序列测定,其中5个片段与已知序列有一定的同源性,另外9个与已知序列没有同源性,特异性分析发现了几个较好的标识序列.结论:成功构建了奇异变形菌的基因组文库,利用该文库发现了奇异变形菌特异的序列.
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骨形态发生蛋白及其在骨科治疗中的应用
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein ,BMP)是一种从DBM中分离提纯的一类具有高效骨诱导活性的疏水性酸性糖蛋白.现已发现BMP-1～16,其中BMP-1～9已经获得了相应的cDNA克隆.Celeste1990年从人体的胎盘和胚脑基因组文库中获取了BMP-7的cDNA[1].BMP-7又被称为成骨蛋白-1(OP-1),属于β转移生长因子(transforming growth factor β,TGF-β)超家族成员,与同家族中BMP-5、BMP-6被归属于同一个亚类.
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基因芯片技术及其在体育科研中的应用展望
基因芯片是指应用原位合成或微量点样等方法,将大量cDNA片段、肽核苷酸或寡核苷酸探针有序地固化于支持物(如玻璃片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等)的表面,组成密集二维分子排列,然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交,通过激光共聚焦扫描或电荷偶联摄影像机等特定仪器对杂交信号的强度扫描分析,从而获得大量的基因序列或表达信息[1].基因芯片的突出特点在于高度并行性、多样性、微型化和自动化.高度的并行性不仅可以大大提高实验的进程,并且有利于基因芯片技术所展示图谱的快速对照和阅读;多样性是指单个芯片中可以进行样品的多方面分析,从而提高分析的精确性,避免因不同的实验条件产生的误差;微型化是当前芯片发展的趋势,其优势是减少试剂用量和减少反应体积,从而提高样品浓度和反应速率.高度自动化可以降低制造芯片的成本和保证芯片的制造质量不易波动.另外,与计算机相连的图像分析系统使研究结果更客观、准确.同时由于生物信息学的迅速发展,为基因芯片的研究提供了物质基础[2].目前,该技术已应用于基因表达分析、新基因发现、基因突变及多态性分析、基因组文库作图、疾病诊断和预测、药物筛选、基因测序、个体化医疗等.此技术为"后基因组计划"时期基因功能的研究及现代医学科学及医学诊断学的发展提供了强有力的工具[1,3].
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肿瘤抑制基因survivin的研究进展
survivin是存活蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员.1997年由Ambrosini等[1]应用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell proteasa receptor-1,EPR-1)的cDNA通过杂交方法在人类基因组文库中筛选并鉴定出来.survivin广泛表达于人的胚胎组织和几乎所有人类常见恶性肿瘤组织,而在正常成人组织和终末分化的组织内检测不到.
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构建骨肉瘤OS-9607细胞cDNA文库及其质量分析
背景:骨肉瘤OS-9607细胞是一种从人骨肉瘤组织中培养出的细胞株.构建该细胞系cDNA文库,以便从中克隆目的基因.目的:通过SMART技术(一种以RNA转录时5'末端转换机制为原理的技术)构建骨肉瘤OS-9607细胞cDNA文库并进行质量分析.设计:验证性的实验研究.单位:解放军第二军医大学长海医院骨科.材料:实验于2005-05在解放军第二军医大学长海医院骨科完成.骨肉瘤OS-9607细胞在CO2培养箱中培养.细胞先用DM处理30 min,然后在标准培养基中恢复24 h.骨肉瘤OS-9607细胞的全部RNA可通过RNAease试剂盒分离.全部RNA的数量及完整性通过紫外线光谱分析器和溴乙锭染色的琼脂糖凝胶电泳检测.方法:从人骨肉瘤OS-9607细胞中提取全部RNA并分离出mRNA,通过原位聚合酶链反应和长距离聚合酶链反应技术获得OS-9607细胞的cDNA,后将cDNA与去磷酸化的λ噬菌体连接.重组物是用SMARTcDNA文库试剂盒构建的.插入的cDNA长短和文库的多样性通过聚合酶链反应检测.主要观察指标:总RNA的数量和完整性,未扩增文库和扩增文库的滴度及重组指数,分析文库中cDNA长度.结果:①总RNA的浓度测得其吸光谱位于260～280 nm,其吸光度大约为1.9A,可清晰的显示其为28S rRNA和18S rRNA,其亮度比值为2∶1(28S/18S).②在试管内与λ噬菌体连接并转染宿主细菌后,未扩增文库的滴定度达到2.2×107pfu/mL,而扩增文库达到4.5×1010 pfu/mL;重组指数分析,在一个培养基中蓝色斑点有8个,无色斑点达到160个,重组指数为99.5%.③获得的cDNA文库由1.6×106个重组噬菌体组成,重组物中平均外源插入物达到1.5kb.结论:本研究获得的骨肉瘤OS-9607细胞cDNA文库质量优良,为今后骨肉瘤OS-9607细胞方面的相关研究及骨肉瘤相关基因的筛选奠定了坚实的基础.
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生存素基因及在白血病研究中的应用
Survivin是1997年耶鲁大学Altieri实验室利用EPR-1cDNA筛选人类基因组文库获得的IAP[1].它是迄今为止已经鉴定的八个IAPs家族成员(X-IAP、c-IAP-1、c-IAP-2、NAIP、ILP-2、ML-IAP/Livin、apollon、survivin)中分子量(16.5 kD)小和有基础与临床意义因而备受关注的明星分子[2,3].本文就生存素的结构及生物学特点、生存素的功能、生存素与细胞凋亡及分裂的关系、生存素在不同白血病细胞中的表达及在白血病治疗中的应用作一综述.
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柔红霉素生物合成基因簇的克隆及其基因打靶研究
本研究通过构建柔红霉素产生菌天蓝淡红链霉菌Streptomyces coeruleorubidus DM的基因组文库,获得2 230个重组克隆.利用菌落原位杂交和PCR筛选获得黏粒Cosmid 8-22,其插入片段大小为41 431 bp,含36个完整的开放阅读框,基本包含了完整的柔红霉素生物合成基因簇.利用黏粒Cosmid 8-22成功构建了基因打靶系统,同时敲除部分dauW和完整的dnrX基因.HPLC结果显示,敲除突变株的柔红霉素产量较出发菌提高了3～4倍.
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存活素及其对脑缺血后脑损害的保护作用及促血管再生作用
存活素是1997年Ambrosini等[1 ]利用效应细胞蛋白酶受体-1 (EPR-1)的cDNA,从人类基因组文库中筛选克隆出的一个新基因,是抗凋亡蛋白(IAP)家族中的一员.其组织分布具有明显的细胞选择性,表达于胚胎和发育的胎儿组织及绝大多数恶性肿瘤组织中,在终末分化的成人组织中未见表达(除胸腺、生殖腺外),因而存活素在肿瘤的研究中成为热点.然而,近有研究[2]发现,大脑脉络丛室管膜细胞、神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞中也有存活素的表达,在脑缺血后参与抑制神经细胞凋亡和促进血管新生.现对存活素的分子结构与生物学功能,以及其在缺血性脑血管疾病中的作用作一综述.
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嗜麦芽寡养单胞菌D2株基因组文库的构建及部分克隆的分析
目的 自双齿围沙蚕消化道内分离出的嗜麦芽寡养单胞菌D2株经前期研究发现其具有明显胞外分泌可溶性纤溶酶、蛋白酶等活性.文中构建嗜麦芽寡养单胞菌D2株基因组文库,了解其基因背景. 方法 用Sau3AⅠ酶切D2株基因组DNA,回收0.2～2kb的DNA片段,连接至pMD18-T质粒载体,转化大肠杆菌JM109,在含有Amp的LB平板上筛选重组子,酶切鉴定后建库保存;随机挑取15个酶切鉴定正确的阳性克隆测序,在网络数据库中进行BLASTX分析. 结果 共得到转化子约1124个,符合建库要求;经测序证实获得了D2株碱性磷酸酶、AMP-依赖性合成酶、荧光素样单加氧酶等蛋白的结构基因序列. 结论 成功构建了嗜麦芽寡养单胞菌D2株的基因组文库,为进一步了解该菌的背景及筛选其功能基因奠定基础.
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磁珠法半自动提取全血基因组DNA条件的优化
目的:探讨磁珠法提取基因组DNA的影响因素,建立快速、高效、批量提取全血基因组DNA的优化方案.方法:使用磁珠法核酸自动提取系统从全血中提取基因组DNA,紫外分光光度计测定DNA浓度和纯度.采用正交试验设计分析裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个因素的主效应和全血量与裂解时间、磁珠量,裂解时间与磁珠量的二阶交互作用对所提取DNA浓度和纯度的影响.结果:裂解时间、全血量、磁珠量和乙醇浓度4个主效应对DNA浓度的影响均存在统计学差异(P＜0.05),当裂解时间为15 min,全血量为100μl,磁珠量为80μl,乙醇浓度为80％时,DNA平均浓度高.磁珠量、裂解时间和全血量的交互作用对DNA OD260/OD280的比值有影响(P=0.008和P=0.013).当磁珠量为40μl,裂解时间为15 min,全血量为100μ1时,OD260/OD280的比值较好.磁珠量和乙醇浓度影响DNA OD260/OD230的比值(P=0.017和P＜0.05),磁珠量为40μl,乙醇浓度为80％时,OD260/OD230的比值更好.结论:当DNA得率优先考虑时,可以选择裂解时间15 min、全血量100μl、磁珠量80μl、乙醇浓度80％的提取条件；而对DNA纯度要求较高时,可以将磁珠量改为40μl,以获得优DNA提取效果.
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利用适配子筛选结核杆菌H37Rv毒力基因方法探讨
目的 建立结核杆菌H37Rv的基因组文库,利用特异性结合H37Rv的适配子,筛选出H37Rv的毒力基因.方法 H37Rv经溶菌酶、蛋白酶K破菌后,提取结核杆菌基因组,用Sau3AI酶切后,连入pET28a,转入大肠杆菌BL21表达,提取蛋白,非变性蛋白电泳后,转入PVDF膜,用生物素标记的适配子与蛋白杂交,SABC试剂显色,将能与适配子反应的克隆子测序,与结核杆菌基因组序列比对,找出可疑的毒力基因.结果 建立了含有711个克隆子的H37Rv基因组表达文库,通过比较分析,找出两个可疑基因:aroF与PPK.结论 本研究利用适配子筛选出了2个结核杆菌H37Rv的毒力基因,建立了一种从结核杆菌基因组文库中筛选H37Rv毒力基因的方法.
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杜氏盐藻基因组文库的构建
目的构建杜氏盐藻基因组文库,旨在进一步分离和研究杜氏盐藻基因的结构和功能.方法采用改进的SDS裂解法提取杜氏盐藻基因组DNA,通过限制性内切酶Sau3AI进行部分酶切,用T4 DNA连接酶将目的片段与噬菌体EMBL3载体臂进行连接后转染大肠杆菌LE392.结果体外包装构建了杜氏盐藻基因组文库,得到重组子数为2.2×104,经测定文库滴度为2.2×105pfu/mL.结论构建了杜氏盐藻基因组文库,为进一步筛选盐藻重要基因及其序列分析奠定基础.
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新疆O139群霍乱弧菌93006菌株基因组文库的构建
目的:构建我国新疆分离O139群霍乱弧菌菌株(93006菌株)的基因组文库,为研究我国O139群霍乱弧菌的来源及其基因组特征提供资料.方法:制备霍乱弧菌高相对分子质量的基因组DNA,用Sau3AI酶将基因组DNA部分酶切成平均大小为32～40kb的片段,将部分酶切并经碱性磷酸酶(CIAP)处理的DNA片段与经XbaI、CIAP、BamHI处理的粘粒载体SuperCos1的载体臂相连接,连接产物经体外包装并转染大肠杆菌XL-Blue1 MR,经氨苄抗性筛选得到阳性克隆,构建霍乱弧菌的基因组文库.结果:该文库共获得了1 200个单克隆,平均插入片段的大小为32kb,空载率为0.05%,相当于9个库容量,从本文库中筛选到任一霍乱弧菌的DNA单拷贝序列的机率为99.98%,该文库能承受7次反复冻溶.结论:成功构建了我国新疆分离O139群霍乱弧菌菌株93006的基因组文库,为进一步克隆霍乱弧菌的基因和研究我国O139群霍乱弧菌的来源奠定了基础.
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Survivin与肿瘤
survivin是凋亡抑制蛋白(inhibitor of apoptosis protein,IAP)家族的新成员.1997年,由耶鲁大学的Altieri等[1]应用效应细胞蛋白酶受体-1(effector cell proteasa receptor-1,EPR-1)的cDNA通过杂交方法在人类基因组文库中筛选并鉴定出来.survivin广泛表达于人的胚胎组织和几乎所有人类常见恶性肿瘤组织,而在正常成人组织和终末分化的组织内检测不到.本文就survivin的生物学特性及其与肿瘤的关系作一综述.
