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心肌锚定重复序列蛋白基因心脏特异敲除小鼠模型构建与鉴定
目的 构建心肌锚定重复序列蛋白(CARP)基因心脏特异敲除小鼠模型,为研究CARP基因与心脏疾病的关系奠定基础.方法 构建CARP基因条件打靶载体pL253-CARP-LoxP电转入小鼠胚胎干细胞(ES)细胞,G418和GANC药物筛选阳性细胞克隆,Southern blot确定CARP基在条件打靶载体转染成功.胚胎注射ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠与心脏特异启动子Cre小鼠(α-MHC-Cre)杂交.结果 得到6只嵌合体小鼠,与α-MHC-Cre小鼠杂交获得CARP基因心脏特异敲除小鼠(CARP-KO),半定量RT-PCR和Westem blot确定CARP基因在CARP-KO小鼠心脏缺失.该小鼠早期胚胎发育和个体生长、心脏发育正常,但心肌肥厚标志基因β-MHC和ANF显著升高(分别为2.25±0.04和1.45 +0.03)(P＜0.05).结论 成功构建CARP基因心脏特异敲除小鼠,CARP基因缺失对小鼠胚胎发育、个体生长和心脏发育没有显著影响.
关键词： 心肌锚定重复序列蛋白 基因打靶 心肌肥厚 -
小鼠胚胎干细胞α-GT基因打靶的研究
目的在小鼠胚胎干细胞上进行α-1,3半乳糖基转移酶(α-GT)基因打靶.方法利用长距离PCR和套式PCR从C57小鼠基因组DNA中克隆出α-GT基因组DNA片段,构建了针对α-GT基因外显子4的置换型基因打靶载体ploxp-GT,同源长臂(5.0kb),同源短臂(3.97kb),同源序列全长共约9.0kb.将打靶载体酶切线性化并以电穿孔方法转移入小鼠ME ES细胞.结果通过G418和Gancyclovir正负选择出171株ES细胞药物抗性克隆,Southern blot鉴定获得11个α-Gal(+/-)小鼠ES细胞克隆,重组频率为6.4%.结论上述方法能够完成α-GT基因敲除,为进一步完成α-GT基因敲除小鼠奠定了基础.
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基因打靶技术——2007年诺贝尔生理学或医学奖评介
2007年度诺贝尔生理学或医学奖由美国犹他大学医学院的马里奥-R-卡佩奇(Mario R.Capecchiand)、英国卡迪夫大学医学院的马丁-J-伊文思(Martin J.Evans)和北卡罗莱纳大学医学院的奥利弗-史密西斯(Oliver Smithies)三人赢得.这三位科学家因为"涉及胚胎干细胞和哺乳动物DNA重组方面的一系列重大突破性发现"而获得这一殊荣.
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基因操作技术在药物代谢酶系研究中的应用
采用基因敲除与转基因技术,可制备具有人类CYP450药物氧化代谢种属特性的"人源化"整体动物模型,在外源性化学物质与肿瘤发生的易感性研究等方面,具有重要的药理学和毒理学意义,也可为新药的研制与开发提供新的更为可靠的评价手段.
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细胞谱系示踪技术
细胞谱系示踪（ cell lineage tracing）是指利用各种方式标记细胞，并对包括其后代所有细胞的增殖、分化以及迁移等活动进行追踪观察。自20世纪以来，谱系示踪技术为研究器官发育、组织损伤修复以及单细胞的分化命运提供了重要的手段。近些年，随着基因工程技术的飞速发展，细胞谱系示踪技术也有所突破，尤其是诱导性重组酶Cre/loxp系统的应用，极大地拓宽了细胞谱系示踪技术的应用范围。本文将结合细胞谱系示踪技术在多种研究中的应用，对该技术的原理、特点以及新进展做一综述。
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人工转录激活子样效应因子核酸酶与多位点基因打靶载体的构建与鉴定
目的 构建并验证针对人类基因组核糖体DNA(rDNA)序列的转录激活子样效应因子核酸酶(TALEN)表达载体与人类通用多位点基因打靶载体.方法 运用在线软件TALENs Targeter在rDNA序列上设计TALEN切割位点,并构建针对该位点的TALEN表达载体,利用细胞转染技术,筛选出一对有较高活性的TALEN,并计算其切割效率.将TALEN切割位点两侧的同源重组引导序列DS1、DS2以及GFP表达元件克隆到pUC-19质粒中,终将TALEN与多位点基因打靶载体共转染293T细胞,经PCR与测序鉴定,对目的基因整合情况进行验证.结果 经酶切、测序鉴定,成功获得一对切割活性高达78.5％的TALEN(TALEN-L1R2),成功构建人类细胞通用的多位点基因打靶载体pUC-DS1-EGFP-DS2;两种技术结合后将目的基因GFP成功整合于293T细胞基因组中.结论 TALEN与多位点打靶技术结合,可有效将目的基因整合于基因组中.
关键词： 转录激活子样效应因子核酸酶 基因打靶 核糖体DNA -
敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因并敲入HLA- G1基因的打靶载体构建
本实验室已克隆到猪α1,3-半乳糖基转移酶基因(α1,3-GT, 第九外显子不全).其中pMD-3arm载体上有5.0kb的片段,该片段包括了小部分第8外显子,完整的第8内含子和一部分第9外显子.本实验中利用LA-PCR的方法,从猪的基因组中获得约2.0kb的猪α1,3-GT的第9外显子序列的扩增产物, 将片段克隆于pGEM-Teasy 载体.将5.0kb和2.0kb片段分别作为打靶载体的5′,3′同源臂,以neo为正选择标记基因,以GFP为负选择标记基因,构建敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因并同时能表达人白细胞抗原HLA-G1基因的的打靶载体p ZJ.经酶切图谱和测序结果的鉴定成功地构建出敲除猪α1,3-半乳糖基转移酶基因并同时能表达人白细胞抗原HLA-G1基因的正负双向选择的打靶载体,为异种器官移植提供了很好的探索.
关键词： α1 3-半乳糖基转移酶基因 基因打靶 人白细胞抗原HLA-G1 -
基因打靶技术在构建人源体细胞基因敲除或敲入细胞系中的应用
基因打靶技术能够帮助人们认识某些动物个体或细胞表型异常的遗传基础,利用该技术构建的模式生物(例如基因敲除小鼠)已经广泛地应用于人类基因的研究[1],截至1999年就已经报道了800多个模式小鼠种系.同源重组介导的基因打靶技术(基因敲除或敲入)是判定基因功能的强有力工具.与基因敲除小鼠相比,人类体细胞基因敲除或敲入细胞系构建的报道相对较少,但该项技术在细胞水平上对某些人源基因参与的生化或生理途径的分析是不可替代的.
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细胞重编程及其在再生医学中的应用前景——写在2012年诺贝尔生理学或医学奖颁布之际
2012年10月8日,英国发育生物学家约翰·格登爵士(John B.Gurdon)和日本生物医学家山中伸弥(Shinya Yamanaka)因"发现成熟细胞可以被重编程(reprogrammed)为多能性(pluripotency)"而获奖,这次获奖是在短短五年时间内干细胞领域的第二次获奖,上一次获奖是在2007年,马丁·埃文斯因1981年成功分离出小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)而与另外两名从事"基因打靶"(gene targeting)的科学家马里奥·卡佩基、奥利弗·史密斯共享诺贝尔生理学或医学奖.
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赖型钩端螺旋体017株外膜蛋白新基因ompL17基因靶向敲除及其突变株的构建
目的将外膜蛋白新基因ompL17靶向敲除并构建该基因的突变株. 方法提取钩端螺旋体017株基因组DNA,扩增出外膜蛋白新基因ompL17,与打靶载体p2NIL重组,并插入氨苄抗生素抗性基因Ampr+使外膜蛋白新基因ompL17失活,构建重组的基因打靶质粒p2NIL17A.电穿孔转化入钩体017株中构建突变株,通过豚鼠模型观察该突变株的毒力变化. 结果 PCR、Dot blot和酶切分析,证实构建了以氨苄青霉素抗性基因DNA为标记探针的基因打靶载体,并构建外膜蛋白新基因ompL17敲除的钩体017株突变株. 结论成功将钩体外膜蛋白的新基因ompL17进行靶向敲除,并构建钩体017株突变株,为进一步进行该基因的功能研究和阐明赖型钩体致病的分子机制奠定了基础.
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变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因失活菌株的构建和鉴定
目的利用基因打靶技术构建变异链球菌葡聚糖结合蛋白D基因(gbpD)失活株,用于葡聚糖结合蛋白D基因功能的研究.方法体外培养变异链球菌UA159菌株并以其基因组为模板,对gbpD基因内部序列进行PCR扩增,连接自杀载体pVA8912,分别用酶切及PCR鉴定;转化变异链球菌UA159株,用PCR及Western blot鉴定.结果经鉴定PCR产物及插入片段大小与预期值相符,且为所需目的基因片段,成功构建了自杀质粒pVA8912-gbpD;经PCR鉴定及Western blot鉴定,gbpD基因失活株基因组中gbpD基因内部成功插入目的片段,且该菌株不表达GbpD蛋白.结论成功构建了用于变异链球菌gbpD基因打靶的自杀质粒和gbpD基因失活株,为该基因功能的研究奠定了基础.
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用 cre-loxp 鼠研究 Runx2在釉质发育中的作用
目的：为研究 Runx2基因缺失对牙釉质发育的影响，拟建立 Runx2基因条件性敲除的小鼠动物模型。方法利用染色体位点特异性重组酶 cre-loxp 系统和 FLP-frt 的条件性基因打靶，借助于同源重组将两个同向的 loxp 位点置于 Runx2基因的编码重要功能域外显子2两侧的内含子序列中，从而获得表型正常的 Flox 小鼠，为了提高 ES 细胞筛选的效率，插入被 FRT 位点瞄定的、作为选择性筛选的阳性标记 neo 基因，同时插入作为负性筛选的 DTA，通过电转的方式，将构建成功的载体电导入到 ES 细胞，并通过对中靶的 ES 细胞进行筛选和鉴定，得到了同源重组正确的阳性克隆，通过显微注射，将中靶的 ES 细胞导入囊胚中，将囊胚移植到代孕鼠子宫内，终得到嵌合体小鼠，将此嵌合体小鼠与 FLP 工具鼠杂交，利用 FRT与 FLP 特异性识别，去掉 neo 基因即可获得阳性的 loxp 鼠，将其与组织特异性表达 cre 重组酶的转基因小鼠杂交，特异性表达的 cre 重组酶将介导 loxp 位点间的基因片段重组。小鼠出生后经 PCR 鉴别，获得 Runx2基因条件性敲除的杂合子小鼠，条件性敲除的杂合子小鼠自交或与 loxp 纯合子小鼠杂交，小鼠出生后，PCR 鉴别筛选条件性完全敲除的小鼠。RT-PCR 法检测外源性 Cre 基因的表达。结果构建了 cre 鼠、loxp 鼠和 Runx2基因条件性敲除的小鼠模型。结论利用染色体位点特异性重组酶 loxp-cre 系统和 FLP-frt 系统可以很好的研究 Runx2基因缺失对牙釉质发育的影响。
关键词： cre-loxp 系统 Runx2 基因打靶 同源重组 FLP-frt 系统 -
XBP1s 条件性过表达定点敲入小鼠模型的建立
目的：获得可进行条件性过表达 XBP1s 基因的 Rosa 26定点敲入杂合子小鼠。方法通过 In-Fusion Cloning 的方法构建胚胎干细胞（ES 细胞）打靶载体，并进行线性化，电转染 JM8A3 ES细胞。药物筛选获得抗性 ES 细胞克隆，经长片段 PCR 鉴定获得正确同源重组的阳性克隆。阳性 ES细胞经克隆扩增后，注射入 C57BL／6J 小鼠的囊胚中，获得嵌合鼠，筛选出高比例嵌合小鼠与野生型C57BL／6J 小鼠交配后获得阳性 F1代小鼠，并分别进行 PCR 和测序鉴定。结果经酶切鉴定证明打靶质粒构建成功，经胚胎干细胞打靶共获得144个抗性 ES 细胞克隆，通过长片段 PCR 的方式对同源重组阳性克隆进行筛选和克隆经测序确认，共获得21个正确同源重组的阳性克隆。阳性 ES 细胞克隆 E3、C6经扩增后注射 C57BL／6J 小鼠囊胚96个，通过胚胎移植，共获得2只高嵌合雄鼠，与野生型C57BL／6J 小鼠交配后获得3只 F1代杂合小鼠，经 PCR 及测序鉴定正确。结论成功建立了 XBP1s基因的 Rosa26定点敲入 F1代杂合子小鼠，为未来获得免疫细胞、肾脏固有细胞及腹膜间皮细胞XBP1s 条件性敲入小鼠奠定了基础。
关键词： XBP1s 非折叠蛋白反应/内质网应激 同源重组 基因打靶 条件性基因敲入 -
基因治疗技术发展在耳聋治疗研究方面的应用
基因治疗是指将外界正常或治疗基因，通过载体转移到人体的靶细胞，进行基因修饰和表达，从而改善疾病的一种治疗手段。基因治疗的概念早是在1972年由Friedmann和Roblin提出[1]。既往以同源重组(Homologous Recombination，HR)修复机制为基础的基因打靶(gene targeting)技术在研究基因功能方面发挥重要作用并用于基因治疗的探索。近几年基于同源重组修复机制和不依赖于同源重组的非同源末端连接(Non Homologous End Joining，NHEJ)机制的基因组编辑(genome editing)技术开创了基因研究及治疗的新天地。
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基因打靶技术及其在眼科领域的应用
基因打靶是近十年来发展起来的分子生物学技术,此项技术的应用和发展为人们在整体水平研究基因的功能及其调控、建立人类疾病动物模型和发展基因疗法提供了可靠的手段.本文综述了基因打靶技术的概况以及其在眼科疾病研究中的应用.
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牙龈卟啉单胞菌血凝素2基因缺陷型突变株的构建
目的 构建牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,Pg)血凝素2(hemagglutinin-adhesin 2,HA-2)基因缺陷型突变株,为研究HA-2基因功能奠定基础.方法 PCR扩增PgHA-2基因两翼片段HA_u、HA_1,将抗性基因ermF-ermAM连接到两者之间构建打靶载体HA-ermF-ermAM.将HA-ermF-ermAM电转化PgATCC33277,基因同源重组整合进入PgATCC33277染色体,用选择性培养基筛选获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.进行PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与其野生株凝血功能试验,比较二者的凝血功能差异.结果 PCR、酶切和测序鉴定结果表明,打靶载体HA-ermF-ermAM成功构建.经PCR鉴定,打靶载体HA-ermF-ermAM通过同源重组整合进入PgATCC33277染色体,成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株.凝血实验结果表明,PsATCC33277HA-2基因缺陷型突变株与野生株相比凝血能力明显减弱.结论 成功获得PgATCC33277HA-2基因缺陷型突变株,为进一步研究HA-2的生物学性质奠定了基础.
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猪α1,3-半乳糖转移酶基因定向缺失质粒的构建
目的:构建猪α1,3-半乳糖转移酶(α1,3-galactosyltranferase, GGTA1 /α1,3-GT)基因的定向缺失质粒,用于GGTA1基因敲除.方法:以原代猪胚胎成纤维细胞(porcine fetal fibroblast,PFFb)基因组DNA为模板,采用长程PCR方法扩增出GGTA1基因同源长、短臂,将长臂段在NotⅠ位点插入PBSLoxPNEOLoxP质粒中PGK-NEO-PolyA序列的5′端,将短臂段在SalⅠ和XhoⅠ位点插入该质粒PGK-NEO-PolyA序列的3′端.结果和结论:成功构建了猪GGTA1基因的定向缺失质粒NEOSL /GT,为下一步获得GGTA1基因敲除猪打下了基础.
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小鼠LRP16基因打靶载体的构建
目的:为利用基因敲除技术进行LRP16基因生理功能的研究,本研究构建了针对小鼠LRP16基因的打靶载体.方法:通过PCR方法筛选129品系小鼠基因组文库中LRP16克隆,在第5外显子内插入SA-RIES-β geo序列,构建插入失活型打靶载体. 结果:将包含第5至11外显子的LRP16基因组片段亚克隆到pBluescript SK Ⅱ+载体,SA-IRES-β geo序列正确插入第5外显子中. 结论:成功构建了第5外显子插入失活型LRP16基因打靶载体,为下一步筛选同源重组ES细胞奠定基础.
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小鼠β-酪蛋白基因的克隆及序列分析
目的:从129Sv小鼠基因组文库中分离克隆β-酪蛋白基因.方法:PCR方法扩增部分β-酪蛋白基因作为探针,用原位杂交和PCR方法从小鼠基因组文库中分离克隆β-酪蛋白基因.结果和结论:通过3轮原位杂交分析,获得了包括小鼠β-酪蛋白全长基因在内的阳性克隆,为进一步构建乳腺特异表达基因打靶载体创造了条件.
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小鼠LRP16基因同源重组ES细胞克隆的鉴定
目的:为深入研究LRP16基因的生理功能,本研究将小鼠LRP16基因特异打靶载体pB△16转染小鼠胚胎干细胞(embryonic stem cell),并筛选同源重组克隆.方法:通过电转染方法将LRP16插入失活型打靶载体导入ES细胞,经G418筛选,挑取抗性克隆,Southern blot方法鉴定同源重组ES细胞克隆.结果:打靶载体成功转染ES细胞,Southern blot筛选100个抗性克隆,结果显示有一个打靶序列同源重组型插入的ES细胞克隆.结论:筛选到同源重组型ES细胞,为下一步建立LRP16缺失型小鼠并为从整体水平研究LRP16基因的生理功能奠定基础.
